评价抑癌药物抑癌作用体内外常用实验方法比较
【摘要】：由于环境污染等原因，恶性肿瘤的发病率日益增长。癌症已成为威胁人类健康的重大杀手。寻肿瘤的新型高效药物，一直是医学界的研究热点。对于各类抗肿瘤药物抑制肿瘤细胞增殖、杀伤肿瘤细胞的效果评价，分为体外实验和体内实验。本文章总结检验抑癌作用常用的体内外实验技术，体内外实验的差异和互补性，说明多数抗肿瘤药物抑癌效应采用体内外实验联合论证的必要性。 【关键词】：抑癌药物；体内；体外；动物模型
【Abstract】With the pollution of the environment, the growing incidence of cancer, which has become a major threat to human health killer. Search the new cancer treatment drug, has been a research focus of the medical profession. For all types of anticancer drugs inhibit tumor cell proliferation, evaluated the effect of killing tumor cells, divided into in vitro and in vivo experiments, this paper summarizes the test tumor suppressor role of technolog
y commonly used in vivo, in vitro and the differences and complementary, that Most tumor suppressor effect of anticancer drugs combined with in vivo experiments demonstrated the need.
【Key words】 tumor suppressor drugs; in vivo; in vitro; animal models
前言
我国肿瘤的年患病人数超过2000万，年死亡人数约150万，居各类疾病病死率第二位，因此大力加强肿瘤防治工作已成为我国卫生工作的战略重点之一[1]。在手术，药物、放射和免疫等综合肿瘤措施中，化学占有重要地位。化疗药物中除了直接杀灭肿瘤细胞的药物外，还有癌化学预防药、肿瘤细胞诱导分化药、生物反应调节药以及抗肿瘤侵袭及转移药。各类已研究成熟或是仍在探索中的抗肿瘤药物，在真正进入临床前都必须经过一系列的证实抑癌作用及探索机制的实验。
一、抑癌作用实验分类：
目前用于抑癌作用研究的实验可分为体内实验和体外实验。体外实验指观察研究药物对在细胞芯片
体外培养的肿瘤细胞增殖抑制及杀伤作用。体内实验主要是通过建构裸鼠肿瘤模型，根据裸鼠肿瘤大小及形态学改变，来观察抑癌药物对的肿瘤生长的影响。
二、 常用体外抑癌作用实验
2.1 制模并检验：选用相应的肿瘤细胞在适宜的条件下进行细胞培养。根据抑癌药物类型选择作用方式。直接加药[2]；采取脂质体法[3][4]导入肿瘤细胞内的；或空载体腺病毒（Ad-GFP)组构Ad-IL-24后[5]感染细胞系。
脂质体瞬时转染法的主要步骤为：提取质粒DNA、制备脂质体，在细胞长到70-80%时，将按照接近1:2的比例配好的质粒脂质体混合液加入细胞培养液。注意：由于脂质体是随机整合可能造成宿主细胞死亡，一般认为在6孔板中转入的脂质体<3üg是安全的。病毒包埋是有选择性整合的。
之后，可用流式细胞术（FCM）检测基因转染阳性结合率[4]。
2.2 测试导入后表达：对于基因水平检测可采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，通过逆转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段进行检测。结合免疫
印记技术（Western Blot）检测目的基因的蛋白表达[3][5]；
2.3 抑癌作用及机制探讨
1)细胞增殖的影响：四甲基偶氮唑盐MTT法[2~7]进行细胞毒性试验；
MTT法的作用原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可使外源性MTT还原成不溶于水的蓝紫结晶甲瓒，并沉积在细胞中，死细胞无此功能，二甲亚砜能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
2）细胞凋亡检测：多选用流式细胞仪上机检测细胞亚G1 峰(即凋亡细胞) [5][8]、Hoechst33342染法[2]观察凋亡细胞中的细胞核形态的改变，凋亡小体的出现，检测细胞凋亡情况；亦有文献采用用AO／EB荧光染法检测细胞凋亡率[7]。
3）可能分子学机制：RT-PCR法检测干预因子对肿瘤细胞中凋亡相关基因表达的影响，探讨其诱发凋亡的可能作用机制。如[5]中的结论：IL-24可上凋p53、Bax、Caspase-3基因和下凋Bcl-2基因表达，进而诱导细胞凋亡。
三、 常用的体内抑癌作用实验：
3.1 制备相应肿瘤细胞的动物模型：
如：小鼠前列腺癌模型[8]的建立： 收集处于对数生长期的肿瘤细胞，接种于6~ 8 周龄的健康C57BL/ 6 雄性小鼠右背侧皮下( 5 *106个活细胞/只)。待长出可扪及的沙粒样肿瘤结节后随机分为3 组，每组8 只。
3.2 干预：可采取瘤体内注射，或小鼠尾静脉注射
3.3 抑癌效应监测：
1）动态观察小鼠肿瘤生长及食欲活动变化等情况；
2）实验结束处死小鼠后称量离体瘤块重量、石蜡包埋进行组织学检查[8]或计算抑瘤率等，同时也可摘除眼球取血检测血常规及肝肾功能；
3）可能机制的研究方法：
从细胞层面的免疫组化法检测[5]；到蛋白水平的免疫印迹法检验药物作用后蛋白表达的影响；以及基因水平RT-PCR法检测干预因子对肿瘤细胞中凋亡相关基因表达的影响。
也有联合几种方法来加以验证：采用免疫组织化学法和 RT- PCR 法检测移植瘤组织中COX- 2的表达[9]；TUNEL免疫荧光法和免疫组化技术[8]；以基因芯片技术筛选Fumagillin处理后HUVECs的基因表达变化，并以定量PCR和免疫印迹技术对基因芯片的结果做进一步验证[10]。
四、体内外实验的差异
各类抗肿瘤药物抑制肿瘤细胞增殖、杀伤肿瘤细胞的效果，常是体外实验和体内实验联合论证。
这是由于细胞培养是它是一个“简单，稳定”的模型，是这是一个在完全非生理状况下的单纯细胞研究，排开了其他因素的干扰作用，能更加准确的说明干预条件的直接作用结果，但这种非生理状态不能准确表现药物在生物体内的变化和作用。
在在体内情况复杂得多，肿瘤细胞周围有大量的细胞联系，并且受到宿主免疫系统、循环系统多方面影响，这与细胞培养系统相当不同的，而肿瘤药物真正应用于临床，必需是在体内条件下也能发挥疗效。药物作用有其选择性，如：缓释顺铂植入剂的有效药物组分顺
铂为水溶物, 其脂肪分布, 骨胳沉积及血脑扩散相对很弱[11]。体内外实验有时也可能得出不同的结果：体外敏感的菌株在体内试验中ED50值较高，提示注射用法罗培南钠对MRSA无效，即使体外敏感[12]。体内试验可动态观察观察肿瘤变化，同时还可以获得实验动物其他系统，如肝肾等脏器改变[8]情况。
五、抑癌作用方法的展望
各类抗癌药物及新型抑癌机制层出不穷。在这些药物的前期抑癌作用研究中，除了传统经典的细胞水平的MTT，免疫组化等方法，越来越多采用了的蛋白水平甚至基因水平实验技术，如免疫印技术，PT-PCR，基因芯片技术以及流式细胞学等。这些新技术在验证药物抑癌作用的同时，也对抑癌作用的机制进行了更深层次的探讨，有助于新型抑癌药物的研发。这些实验也存在着各自的一些限制，出于科学性和完备性的考虑，抗癌药物的抑癌作用的论证应根据实验室已具备的条件以及对结果的要求等方面选用恰当的实验方法，从多方面各层次来联合论证，充分说明药物的抑癌作用以及生物等效性。
【 参考文献】
[1] 向继洲.《药理学》科学出版社.抗恶性肿瘤药物.544
[2]沙丹，何友兼，等.Avastin联合重组腺病毒胸腺激酶自杀基因抗鼻咽癌的体内外实验.中华耳鼻咽喉头颈外科杂志2007年7月42卷第7期
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