利用成熟的miRNA 微陣列晶片或是real-time qPCR 技術可以高效快速地篩選出差異表達的miRNA，而進一步出差異miRNA 作用的基因成為研究其重要生物學功能的關鍵！植物miRNA 通常與mRNA 進行完全或幾近完全的配對引起標靶基因(target gene) 的剪切從而調控基因的表達，因此發展出一種稱之為降解組測序(Degradome Sequencing) 的方法，可真正從實驗中到miRNA 的作用基因，減低由生物資訊預測產生之誤差。藉由上游的miRNA 晶片/miRNA 下一代測序(Next generation sequenng, NGS) 資料結合降解組測序與下游的全基因晶片之高通量技術資料，可將植物從miRNA 表現量，miRNA 調控基因到後序相關基因調控做一完整且串連的研究。 miRNA 的重要功能
近幾年，miRNA 從原本不被重視的配角，成為了研究人員競相研究的主角。這種非編碼的單股miRNA 分子廣泛存在於植物、線蟲及動物的細胞中，控制著不僅包括細胞增殖、細胞凋亡、器官發生、個體發育、造血以及腫瘤發生等等調控路徑，還可能同時具有腫瘤抑制因子和原發癌基因的功能，因此在癌症的診斷和治療中亦發揮重要的作用。
動物與植物 miRNA 的分別功能
在動物中，大多數miRNA 的表現量在不同的組織、不同的發育階段有顯著差異，具有嚴謹的空間分佈和時間順序。儘管對多數miRNAs 的功能還不甚瞭解，但通過對果蠅、線蟲等生物體內miRNA 的研究，已
經認識到這類小RNA 分子在生命過程中扮演著重要的角，甚至可能與腫瘤等疾病的形成相關。不過植物miRNA
的功能與動物不太一樣的是，miRNA 正常表達為植物正常生長發育所必需的(圖一)。
圖一、miRNA 的表現與植物生長有密切關係，本圖為阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)。當miRNA 的表現受到干擾無法正常作用，植物的發育即受到影響而較矮小。
科學家一般藉由改變植物體中miRNA 的表
植物降解組測序(Plant Degradome Sequencing)
現量，或者通過改變miRNA 中的核苷酸以降低其與標靶mRNA 的鹼基配對程度，或者通過轉殖基因改變植物中標靶mRNA 的序列使其具有抗miRNA 降解的能力，來研究miRNA 對靶標基因的調控作用。
並且發現miRNA 會對多種植物激素進行轉錄因子之調控，對於調節植物的發育過程具有重要意義。目前發現植物miRNA 標靶基因中約50% 是針對一些轉錄調控因子。
mir162而據估計，miRNA 的數量約為生物體中編碼基因數量的1%，但目前已經驗證的miRNA 還遠遠未達到飽和。
miRNA特性
miRNA (microRNA) 是一類長度約為22 核苷酸的內源性非編碼RNA，本身不具有開放閱讀框(open reading frame, ORF)。miRNA 對於真核生物的mRNA 剪切，RNA 調節，轉譯抑制，DNA 甲基化作用，扮演基因調控的角。
大部份的miRNA 基因(MIR) 是由RNA polymerase II (Pol II) 轉譯，形成單股miRNA 的前驅物(precursor miRNA, pre-miRNA) 摺疊成髮夾環構造，進而被RNase III 酵素辨識，RNase III 在動物稱之為Drosha；在植物為Dicer 或Dicer-like proteins (DCLs)，然後剪切miRNA 髮夾環形成miRNA-miRN
A* 複合物(miRNA* 是miRNA 的部分互補股)，miRNA 表現量通常比miRNA* 豐富，但有文獻指出miRNA* 較能與Argonaute (AGO) 蛋白結合而執行其功能。
而當miRNA 與miRNA* 其表現量是相當的，根據其在序列中的位置，命名方式以miR-5p 與miR-3p 表示。
通常，成熟的miRNA 在動物體內以基因的轉譯抑制居多，但植物miRNA 通常與mRNA 進行完全或接近完全的配對引起標靶基因的剪切進而調控基因的表達。如何研究 miRNA 的功能？
miRNA的研究看起來並不複雜，但是因為miRNA很小，也就讓每一步都充滿了挑戰。一般來說，研究人員收集發育或分化的不同階段的樣品，或疾病及正常組織的樣品，從中提取出miRNA。我們接著可以利用miRNA 晶片比較出細胞和組織的miRNA 表現圖譜，出表達差異的miRNA。研究人員通常會挑出幾個候選的miRNA，展開進一步的分析，如real-time qPCR 驗證。
不過尋這些miRNA 的標靶基因仍是個挑戰，因此有許多利用生物資訊的方式來預測其作用基因，例如針對動物miRNA 的研究：TargetScan、PicTar、miRanda、PITA 以及RNA22；而針對植物的miRNA 則有：miRU 和TargetFinder 等(1)。然而，由於預測方法無法區分預測基因的真偽，所有預測結果必須經實驗證實以去偽存真，這大大地影響了標靶基因的探索效率。
目前的miRNA 學術研究在植物方面相對較少，本次將針對植物miRNA 為大家做介紹。水稻的研究裡，將Os DCL1 (OsDCL1IR) 基因缺失後，發現miRNA 的累積量下降，而OsDCL1IR 轉基因水稻產生發育抑制或發育多效性，顯示miRNA 在水稻發育扮演重要角。大量表現OsmiR156b 與OsmiR156h 造成嚴重的植株矮化，稻穗尺寸變小與抽穗期延遲，顯示miRNA 對於外表性狀也有一定程度的影響(2)。
另外，阿拉伯芥之miRNA 在不同的生物代謝過程中扮演重要角，例如發育調節，賀爾蒙反應與逆境適應等。例如：miR160 會直接剪切AUXIN RESPONSE FACTOR 10 (ARF10)、ARF16 與ARF17，藉由大量表現修飾後可抗MiR160 剪切的ARF17，產生戲劇性的生長發育缺失，反之大量表現miR160 的植株發現有根間雜亂無章與澱粉粒減少之情形。此外，miR162 與miR168 分別的標靶基因DCL1 與AGO1，顯示可能其miRNA 可自行調節其生合成與功能。
降解組測序 (Degradome Sequencing)
目前針對植物 miRNA 研究方式除可與動物 miRNA 研究策略相同外，植物因為有 miRNA 通常與 mRNA 進行完全或接近完全的配對引起標靶基因的剪切從而調控基因的表達的優勢，因此可應用高通量測序來加速尋標靶基因。
隨著下一代測序或稱為高通量測序 (High throughtput sequencing) 技術發展，可出數以千萬 miR
NA 之資訊。加上植物 miRNA 通常與 mRNA 進行完全或接近完全的配對引起標靶基因的剪切從而調控基因的表達，出現了一種新的實驗方法稱為降解組測序 (Degradome Sequencing)，它結合了高通量測序技術與生物資訊學分析各自的優勢，已成功應用於阿拉伯芥，水稻 (3) 等植物的
miRNA 標靶基因篩選。
圖二、植物降解組源裡，此為 t-plot 圖示。當 miRNA 黏合到標靶基因後，剪切在 miRNA 與 mRNA 互補區域的第十位元核苷酸上。基因經剪切產生二個片段，5’ 剪切片段和 3’ 剪切片段。其中 3’ 剪切片段，包含有自由的 5’ 單磷酸和 3’ polyA 尾巴，可被 RNA 連接酶連接，產物可用於下游高通量測序；經 CleaveLand 分析方法進行分析，下方 t-plot 圖示顯示在 mRNA 序列的某個位點會出現一個波峰，而該處正是候選的 miRNA 剪切位元點。
降解組測序的原理在於，植物體內絕大多數的 miRNA 是利用剪切作用調控基因的表達，且剪切常發生在 miRNA 與 mRNA 互補區域的第十位元核苷酸上 (完整實驗流程請見圖二)。基因經剪切產生二個片段，5’ 剪切片段和 3’ 剪切片段。其中 3’ 剪切片段，包含有自由的 5’ 單磷酸和 3’ polyA 尾巴，在5’ 端可被 RNA 連接酶連接，產物可用於下游高通量測序；而含有 5’ 帽子結構的完整基因，含有帽子結構的 5’ 剪切片段或是其他缺少 5’ 單磷酸基團的 RNA 是無法被 RNA 酶連接，因而無法進入下游的測序實驗，此針對被剪切的序列進行分離的方法，稱之為 PARE (Parallel Analysis of RNA Ends) (4)。
測序數據的分析方法
測序數據使用賓州大學 Addo-Quaye 等建立 CleaveLand 分析方法進行比對分析 (5)，可以直觀地發現在 mRNA 序列的某個位點會出現一個波峰，而該處正是候選的 miRNA 剪切位元點。利用降解組測序技術的所得到的定序結果與實驗驗證
可見下圖所示
(圖三)。
圖三、降解組定序結果與實驗驗證。水稻降解組定序結果到 osa-miR160 分別會作用 AUXIN RESPONSE FACTORs 相關基因：Os02g41800、Os04g43910、Os04g59430、Os06g47150 與 Os10g33940 (2)。圖解以 A 作說明：上半部為降解組定序比對
到Os02g41800 基因，且會與osa-miR160 幾近互補，在Os02g41800 序列中標示紅字母G 為miRNA 與Os02g41800 黏合後進行剪切的位置，上方黑箭指示經過RLM 5′-RACE 驗證為剪切點的機率，3/4 表示共 4 次的RLM5′-RACE 實驗中，有3 次5′端起始點在此位置。下方為t-plot 圖，可判斷此miRNA-mRNA 結合位置與是否具專一性。(註：圖二之實驗結果除5′-RACE驗證結果外，其餘皆為實際給予客戶之圖表，讓您稍加整理數據即可發表，欲知細節請洽華聯生技。)
降解組測序的應用，主要在確認上游miRNA 的剪切基因，進而得知下游影響基因路徑。可由miRNA 微陣列晶片或利用下一代測序發掘新的miRNA，來獲得miRNA 表現量差異，從降解組測序確認miRNA 剪切哪些基因，再由下游使用全基因晶片進一步檢測影響基因表現量差異，結合生物資訊Gene Ontology (GO)、Pathway 分析與外表性狀，將植物miRNA 的調控，由上而下整體性了解分析，降解組測序適時的扮演目前在miRNA 研究中對於確認剪切基因的關鍵性角。文獻參考：
1.Yang JH, Li JH, Shao P, Zhou H, Chen YQ, Qu LH. starBase:
a database for exploring microRNA–miRNA interaction maps
from Argonaute CLIP-Seq and Degradome-Seq data.Nucleic Acids Res 2010;39:D202-D209.
2.Zhao M, Gu LF, Li PC, Song XW, Wei L, Chen Z, Cao XF.
Degradome sequencing reveals endogenous small RNA targets in rice (Oryza sativa L. ssp. indica). Front Biol 2010;5:67-90.
3.Li YF, Zheng Y, Addo-Quaye C, Zhang L, Saini A,
Jagadeeswaran G, Axtell MJ, Zhang W, Sunkar R.
Transcriptome-wide identification of microRNA targets in rice.
Plant J 2010;62(5):742-759.
4.German MA, Luo S, Schroth G, Meyers BC, Green PJ.
Construction of Parallel Analysis of RNA Ends (PARE) libraries for the study of cleaved miRNA targets and the RNA degradome. Nat Protoc 2009;4(3):356-362.
5.Addo-Quaye C, Miller W, Axtell MJ. CleaveLand: a pipeline
for using degradome data to find cleaved small RNA targets.
Bioinformatics 2009;25(1):130-131.
目前在 NCBI 只有十一篇降解組測序相關文獻，顯示其發展潛力大，還有更多未知的領域等待科學的研究。
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