抗PVRIG抗体和使用方法与流程

抗pvrig抗体和使用方法
1.本技术是分案申请，对应的母案申请的申请号是201680023677.4，申请日期是2016 年2月19日，发明名称为“抗pvrig抗体和使用方法”。
2.相关申请的交叉引用
3.本技术根据35 u.s.c.
§
119要求2015年2月19日提交的ussn 62/118,208和2015 年3月31日提交的ussn 62/141,120以及2015年10月1日提交的ussn 62/235,823的 优先权，这些专利全部明确地以全文引用的方式并入本文中。

背景技术：

4.初始t细胞(t cell)为了被高产地活化必须从抗原呈递细胞(apc)接收两 个独立信号。第一信号1是抗原特异性的，并且出现在t细胞抗原受体遇到apc上的 恰当抗原-mhc复合体时。免疫反应的结局由第二抗原独立信号(信号2)决定，该信 号通过t细胞共刺激分子结合其apc表达的配体来传递。这个第二信号可以是刺激性 的(正性共刺激)或抑制性的(负性共刺激或共抑制)。在不存在共刺激信号的情况下 或在存在共抑制信号的情况下，t细胞活化被削弱或失败，这可能导致抗原特异性无反 应状态(称为t细胞无反应性)，或可能引起t细胞细胞凋亡性死亡。
5.共刺激分子对通常由在apc上表达的配体和其在t细胞上表达的同源受体组成。 共刺激分子的原型配体/受体对是b7/cd28和cd40/cd40l。b7家族由在结构上相关的 细胞表面蛋白质配体组成，它们可以向免疫反应提供刺激性或抑制性输入。b7家族的 成员在结构上是相关的，其中胞外结构域含有至少一个免疫球蛋白可变结构域或恒定结 构域。
6.正性和负性共刺激信号在细胞介导的免疫反应的调节中均起重要作用，并且介导这 些信号的分子已被证明是进行免疫调节的有效靶标。基于此认识，已经研发出了若干涉 及共刺激分子的靶向的途径，并且这些途径显示为适用于通过在癌症患者中开 启免疫反应或防止免疫反应关闭来预防和癌症，并且适用于预防和自身免疫疾 病和炎症性疾病以及同种异体移植的排斥反应，各自通过关闭不受控制的免疫反应，或 通过负性共刺激(或共抑制)在具有这些病理学病况的受试者体内诱导“关闭信号(offsignal)”。
7.操控由b7配体传递的信号已经显示出自身免疫性、炎症性疾病以及移植排斥 反应的潜能。策略包括使用针对共刺激对的配体或受体的单克隆抗体或使用由可以 结合和阻断其恰当配体的共刺激性受体组成的可溶性融合蛋白来阻断共刺激。另一种途 径是使用抑制性配体的可溶性融合蛋白诱导共抑制。这些途径至少部分地依赖于自身反 应性或同种异体反应性t细胞(它们分别是造成自身免疫疾病或移植中的致病过程的原 因)的最终缺失，可能是因为在不存在共刺激(其诱导细胞存活基因)的情况下，t细 胞变得非常容易诱导细胞凋亡。因此，能够在不损害免疫系统防御病原体的能力的情况 下调节共刺激信号的新颖药剂对和预防这类病理学病况非常有利。
8.共刺激通路在肿瘤发展中起重要作用。有趣的是，已经显示出，肿瘤通过抑制 b7-cd28和tnf家族中的共刺激因子来阻碍t细胞活化以及通过吸引抑制抗肿瘤t细 胞反应的
组成的组的抗体的vhcdr1、vhcdr2、vhcdr3、vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3序列： cpa.7.001、cpa.7.003、cpa.7.004、cpa.7.006、cpa.7.008、cpa.7.009、cpa.7.010、 cpa.7.011、cpa.7.012、cpa.7.013、cpa.7.014、cpa.7.015、cpa.7.017、cpa.7.018、 cpa.7.019、cpa.7.021、cpa.7.022、cpa.7.023、cpa.7.024、cpa.7.033、cpa.7.034、 cpa.7.036、cpa.7.040、cpa.7.046、cpa.7.047、cpa.7.049以及cpa.7.050。
18.本发明的额外目标是提供如以上所概述的方法，其中抗pvrig抗体与包含选自以 下组成的组的抗体的vhcdr1、vhcdr2、vhcdr3、vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3序列 的抗体竞争结合：cpa.7.001、cpa.7.003、cpa.7.004、cpa.7.006、cpa.7.008、cpa.7.009、 cpa.7.010、cpa.7.011、cpa.7.012、cpa.7.013、cpa.7.014、cpa.7.015、cpa.7.017、 cpa.7.018、cpa.7.019、cpa.7.021、cpa.7.022、cpa.7.023、cpa.7.024、cpa.7.033、 cpa.7.034、cpa.7.036、cpa.7.040、cpa.7.046、cpa.7.047、cpa.7.049以及cpa.7.050。
19.本发明的另一个目标是提供如以上所概述的方法，其中抗pvrig抗体选自以下组 成的组：cpa.7.001、cpa.7.003、cpa.7.004、cpa.7.006、cpa.7.008、cpa.7.009、cpa.7.010、 cpa.7.011、cpa.7.012、cpa.7.013、cpa.7.014、cpa.7.015、cpa.7.017、cpa.7.018、 cpa.7.019、cpa.7.021、cpa.7.022、cpa.7.023、cpa.7.024、cpa.7.033、cpa.7.034、cpa.7.036、cpa.7.040、cpa.7.046、cpa.7.047、cpa.7.049以及cpa.7.050。
20.本发明的额外目标是提供如以上所概述的方法，其中抗pvrig抗体与选自以下组 成的组的抗体竞争结合：cpa.7.001、cpa.7.003、cpa.7.004、cpa.7.006、cpa.7.008、 cpa.7.009、cpa.7.010、cpa.7.011、cpa.7.012、cpa.7.013、cpa.7.014、cpa.7.015、 cpa.7.017、cpa.7.018、cpa.7.019、cpa.7.021、cpa.7.022、cpa.7.023、cpa.7.024、 cpa.7.033、cpa.7.034、cpa.7.036、cpa.7.040、cpa.7.046、cpa.7.047、cpa.7.049以 及cpa.7.050。
21.本发明的另一个目标是提供如以上所概述的方法，其中抗pvrig抗体包含选自以 下组成的组的抗体的vhcdr1、vhcdr2、vhcdr3、vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3序列： cha.7.502、cha.7.503、cha.7.506、cha.7.508、cha.7.510、cha.7.512、cha.7.514、 cha.7.516、cha.7.518、cha.7.520.1、cha.7.520.2、cha.7.522、cha.7.524、cha.7.526、 cha.7.527、cha.7.528、cha.7.530、cha.7.534、cha.7.535、cha.7.537、cha.7.538.1、 cha.7.538.2、cha.7.543、cha.7.544、cha.7.545、cha.7.546、cha.7.547、cha.7.548、 cha.7.549、cha.7.550、cpa.7.001、cpa.7.003、cpa.7.004、cpa.7.006、cpa.7.008、 cpa.7.009、cpa.7.010、cpa.7.011、cpa.7.012、cpa.7.013、cpa.7.014、cpa.7.015、 cpa.7.017、cpa.7.018、cpa.7.019、cpa.7.021、cpa.7.022、cpa.7.023、cpa.7.024、 cpa.7.033、cpa.7.034、cpa.7.036、cpa.7.040、cpa.7.046、cpa.7.047、cpa.7.049以 及cpa.7.050。
22.本发明的额外目标是提供如以上所概述的方法，其中pvrig抗体与选自包含 vhcdr1、vhcdr2、vhcdr3、vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3序列的抗pvrig抗体组成 的组的抗体竞争结合，所述序列来自选自以下组成的组的抗体：cha.7.502、cha.7.503、 cha.7.506、cha.7.508、cha.7.510、cha.7.512、cha.7.514、cha.7.516、cha.7.518、 cha.7.520.1、cha.7.520.2、cha.7.522、cha.7.524、cha.7.526、cha.7.527、cha.7.528、 cha.7.530、cha.7.534、cha.7.535、cha.7.537、cha.7.538.1、cha.7.538.2、cha.7.543、 cha.7.544、cha.7.545、cha.7.546、cha.7.547、cha.7.548、cha.7.549、cha.7.550、 cpa.7.001、
cpa.7.003、cpa.7.004、cpa.7.006、cpa.7.008、cpa.7.009、cpa.7.010、 cpa.7.011、cpa.7.012、cpa.7.013、cpa.7.014、cpa.7.015、cpa.7.017、cpa.7.018、 cpa.7.019、cpa.7.021、cpa.7.022、cpa.7.023、cpa.7.024、cpa.7.033、cpa.7.034、 cpa.7.036、cpa.7.040、cpa.7.046、cpa.7.047、cpa.7.049以及cpa.7.050。
23.本发明的另一个目标是提供诊断癌症的方法，包含a)使来自患者的组织与抗pvrig 抗体接触；和b)判定组织中pvrig的过表达的存在作为癌症存在的指示。抗pvrig 抗体可以如此处所描述和如上文所概述。
24.本发明的额外目标是提供抗原结合结构域，包括抗体，是抗pvrig抗体，包含选 自以下组成的组的抗体的vhcdr1、vhcdr2、vhcdr3、vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3 序列：cpa.7.001、cpa.7.003、cpa.7.004、cpa.7.006、cpa.7.008、cpa.7.009、cpa.7.010、 cpa.7.011、cpa.7.012、cpa.7.013、cpa.7.014、cpa.7.015、cpa.7.017、cpa.7.018、 cpa.7.019、cpa.7.021、cpa.7.022、cpa.7.023、cpa.7.024、cpa.7.033、cpa.7.034、 cpa.7.036、cpa.7.040、cpa.7.046、cpa.7.047、cpa.7.049以及cpa.7.050。
25.本发明的另一个目标是提供抗pvrig抗原结合结构域(包括抗体)组合物，它们 是抗pvrig抗体，选自以下组成的组：cpa.7.001、cpa.7.003、cpa.7.004、cpa.7.006、 cpa.7.008、cpa.7.009、cpa.7.010、cpa.7.011、cpa.7.012、cpa.7.013、cpa.7.014、 cpa.7.015、cpa.7.017、cpa.7.018、cpa.7.019、cpa.7.021、cpa.7.022、cpa.7.023、 cpa.7.024、cpa.7.033、cpa.7.034、cpa.7.036、cpa.7.040、cpa.7.046、cpa.7.047、 cpa.7.049以及cpa.7.050。
26.本发明的另一个目标是提供抗pvrig抗原结合结构域(包括抗体)组合物，它们 是抗pvrig抗体，选自以下组成的组：h518-1、h518-2、h518-3、h518-4、h518-5、h524-1、 h524-2、h524-3、h524-4、h530-1、h530-2、h530-3、h530-4、h530-5、h538.1-1、h538.1-2、 h538.1-3、h538.1-4、h538.2-1、h538.2-2以及h538.2-3(如图90中所描绘)。
27.本发明的额外目标是提供抗原结合结构域，包括抗体，是抗pvrig抗体，包含选 自以下组成的组的抗体的vhcdr1、vhcdr2、vhcdr3、vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3 序列：cha.7.502、cha.7.503、cha.7.506、cha.7.508、cha.7.510、cha.7.512、 cha.7.514、cha.7.516、cha.7.518、cha.7.520.1、cha.7.520.2、cha.7.522、cha.7.524、 cha.7.526、cha.7.527、cha.7.528、cha.7.530、cha.7.534、cha.7.535、cha.7.537、 cha.7.538.1、cha.7.538.2、cha.7.543、cha.7.544、cha.7.545、cha.7.546、cha.7.547、 cha.7.548、cha.7.549、cha.7.550、cpa.7.001、cpa.7.003、cpa.7.004、cpa.7.006、 cpa.7.008、cpa.7.009、cpa.7.010、cpa.7.011、cpa.7.012、cpa.7.013、cpa.7.014、 cpa.7.015、cpa.7.017、cpa.7.018、cpa.7.019、cpa.7.021、cpa.7.022、cpa.7.023、 cpa.7.024、cpa.7.033、cpa.7.034、cpa.7.036、cpa.7.040、cpa.7.046、cpa.7.047、 cpa.7.049以及cpa.7.050。
28.本发明的另一个目标是提供核酸组合物，包含：a)第一核酸，编码包含来自抗体 的vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3的重链可变结构域；和b)第二核酸，编码包含来自抗 体的vlcdr1、vlcdr2和和vlcdr3的轻链可变结构域。抗体选自以下组成的组：cpa.7.001、cpa.7.003、cpa.7.004、cpa.7.006、cpa.7.008、cpa.7.009、cpa.7.010、 cpa.7.011、cpa.7.012、cpa.7.013、cpa.7.014、cpa.7.015、cpa.7.017、cpa.7.018、 cpa.7.019、
cpa.7.021、cpa.7.022、cpa.7.023、cpa.7.024、cpa.7.033、cpa.7.034、 cpa.7.036、cpa.7.040、cpa.7.046、cpa.7.047、cpa.7.049、cpa.7.050、cha.7.502、 cha.7.503、cha.7.506、cha.7.508、cha.7.510、cha.7.512、cha.7.514、cha.7.516、 cha.7.518、cha.7.520.1、cha.7.520.2、cha.7.522、cha.7.524、cha.7.526、cha.7.527、 cha.7.528、cha.7.530、cha.7.534、cha.7.535、cha.7.537、cha.7.538.1、cha.7.538.2、 cha.7.543、cha.7.544、cha.7.545、cha.7.546、cha.7.547、cha.7.548、cha.7.549、 cha.7.550、cpa.7.001、cpa.7.003、cpa.7.004、cpa.7.006、cpa.7.008、cpa.7.009、 cpa.7.010、cpa.7.011、cpa.7.012、cpa.7.013、cpa.7.014、cpa.7.015、cpa.7.017、 cpa.7.018、cpa.7.019、cpa.7.021、cpa.7.022、cpa.7.023、cpa.7.024、cpa.7.033、 cpa.7.034、cpa.7.036、cpa.7.040、cpa.7.046、cpa.7.047、cpa.7.049以及cpa.7.050。
29.本发明的额外目标是提供表达载体组合物，包含如此处和上文所概述的第一和第二 核酸。
30.本发明的另一个目标是提供宿主细胞，包含呈单一表达载体或两个表达载体的形式 的表达载体组合物。
31.本发明的额外目标是提供制造抗pvrig抗体的方法，包含a)在产生抗体的条件下 培养本发明的宿主细胞与表达载体；和b)回收抗体。
附图说明
32.图1是本发明的作用机制的示意图。
33.图2示出了pvrig在各种正常人类组织中的mrna表达。
34.图3示出了pvrig在源自外周血和骨髓的各种免疫体中的mrna表达(基于 gse49910)。
35.图4示出了pvrig在各种cd3+淋巴细胞体中的mrna表达(基于gse47855)。
36.图5a、图5b和图5c示出了pvrig在特异性细胞体中的mrna表达。图5a示 出了pvrig在通过激光捕获显微镜获得的特异性细胞体中的mrna表达(基于 gse39397)。图5b示出了pvrig在来自正常患者和癌症患者的cd4 t细胞中的mrna 表达以及来自引流淋巴结和til形式乳腺癌患者的表达形式cd4t细胞表达(基于 gse36765)。图5c示出了pvrig在源自滤泡性淋巴瘤肿瘤和扁桃体的cd8和cd4 t 细胞中的mrna表达(基于gse27928)。
37.图6示出了基于gtex的正常组织中的pvrig表达。表达水平以log2(rpkm)值(每 一百万个读数每千碱基所鉴别到的片段)示出。超过1的值视为高表达。组织按照中位 值表达从上到下排列。图上的每个点表示单一样品。
38.图7示出了基于tcga的癌组织中的pvrig表达。表达水平以log2(rpkm)值(每 一百万个读数每千碱基所鉴别到的片段)示出。超过1的值视为高表达。组织按照中位 值表达从上到下排列。图上的每个点表示单一样品。
39.图8显示三个类别的富集分析结果的热图表示：蛋白质相互作用、通路以及疾病相 关性。结果按照每行的平均p值从上到下排列。每个类别仅显示前10个结果。灰正 方形指示p值《0.05。热图中的每一列对应于正常组织或癌组织，由所述组织衍生出高度 相关的基因列表(r》0.55，使用至少50个样品)。如热图中所示，pvrig与t细胞基因 表达特征相关，t细胞基因表达特征与免疫反应和免疫疾病非常相关。
40.图9示出了正常皮肤对比黑素瘤中的pvrig表达(gtex和tcga分析)。这类过 表达在额外的实体肿瘤中观察到了并且是由肿瘤微环境中的浸润性淋巴细胞和nk细胞 造成的。在正常情况下，不存在浸润免疫细胞并且因此pvrig表达水平非常低。
41.图10示出了来自tcga样品的黑素瘤中的pvrig和pd1与肺腺癌、结肠腺癌和 黑素瘤中的若干t细胞标志物的相关性。标志物cd3是t细胞的通用标志物并且也在 nkt细胞上表达。cd4和cd8标志物用于表征t细胞亚。
42.图11显示了pvrig在人类pbl上的表达。评估了源自两个供体的人类pbl的 pvrig表达。供体61和供体40均显示由抗pvrig特异性抗体显著染。
43.图12显示，pvrig-ig与所测试的所有四个人类黑素瘤细胞系mel-23、mel-624 和mel-624.38以及mel-888全部展现强结合。结合不受与经过工程改造的黑素瘤特异性 t细胞共培养的影响。灰线对应于同种型对照，黑实线对应于pvrig-ecd-ig。
44.图13是pvrig与t细胞和t细胞亚的相关性。cd3g是t细胞受体复合体的组 分，cd4是t辅助细胞的标志物并且cd8a是用于鉴别细胞毒性t细胞的cd8蛋白质 的组分。pvrig与许多类型的肿瘤中的t细胞非常相关，所述肿瘤包括本文所示的肺腺 癌、结肠腺癌和黑素瘤。
45.图14示出了确认/特异性筛选的代表性图像。来自初步筛选和egfr表达载体(阴 性对照)的所有命中一式两份地重新排列/表达并且用20μg/ml pvrig探测。高强度的 特异性命中用绿显示(pvrl2)。非特异性命中用黑显示。另一个弱命中(mag) 后来显示也结合其它配体，由此表明它不是特异性的。
46.图15a到图15e示出了各种pvrig-ecd-ig m:m蛋白质对小鼠cd4 t细胞活化的 影响。如材料和方法中所述，在存在10μg/ml pvrig-ecd ig(批次#198)或对照migg2a 的情况下，用抗cd3 mab(2μg/ml)包被培养板。在存在2μg/ml可溶性抗cd28的情 况下，用每孔1
×
105个cd4+cd25-小鼠t细胞对孔进行涂铺。(a)在刺激后48小时通 过流式细胞仪分析cd69的表达，显示代表性直方图。每个条柱是一式两份培养的平均 值，误差棒指示标准偏差。(b-c)在刺激后48h收集培养上清液并且通过elisa分析 小鼠il-2和ifnγ水平。结果显示为一式两份样品的平均值
±
标准误差。(d)示出了固 定的pvrig-ecd ig(图92bb对表面cd69(d)和ifnγ分泌(e)的剂量反应效应。 每个条柱是一式三份培养的平均值，误差棒指示标准误差。
47.图16示出了使用特异性抗体对pvrig转导的pbl的facs分析。提供蛋白质染 阳性细胞的百分比(相对于空载体转导)。
48.图17示出了使用特异性抗体对pvrig(与f4 tcr共表达或呈含有f4 tcr和ngfr 的双顺反子载体形式)转导的pbl的facs分析。提供蛋白质染阳性细胞的百分比(相 对于空载体转导)。
49.图18a到图18b示出了实验1(图18a)和实验2(图18b)中使用特异性单克隆 抗体对tcr转导刺激的pbl进行的facs分析，所述特异性单克隆抗体识别所转导的 特异性tcr的β链的胞外结构域。提供染阳性细胞的百分比。
50.图19显示，pvrig在表达f4的pbl上的表达引起在与sk-mel23、mel-624和 mel-624.38共培养后相比于空载体的表达来说ifnγ分泌减少。
51.图20a到图20b显示，pvrig和f4在pbl中通过共转导的表达(图20a)不影 响与黑素
瘤细胞系共培养时的ifnγ分泌。pvrig和f4在pbl中使用双顺反子载体的 表达(图20b)引起在与sk-mel23、mel-624和mel-624.38共培养后相比于空载体 的表达来说ifnγ分泌减少。
52.图21显示，pvrig和f4在pbl中使用双顺反子载体的表达引起在与黑素瘤细胞 系共培养后t细胞介导的细胞毒性降低。
53.图22显示，低水平、无变化和高水平耗竭t细胞的3个亚组中的pvrig表达。耗 竭t细胞基于4种标志物的高水平表达来选择：cd8a、pd-1、tim-3和tigit。低表 达样品未示出，因为没有任何可检测水平的pvrig。
54.图23a到图23b：异位表达的人类pvrig蛋白质的蛋白质印迹分析(western blotanalysis)。使用抗flag抗体(23a)或抗pvrig抗体(23b)，通过wb分析预先用编码 人类pvrig-flag的表达构建体(泳道2)或用空载体(泳道1)转染的hek293细胞池 的全细胞提取物。
55.图24：通过facs分析，hek293细胞的细胞表面表达异位表达了人类pvrig-flag 蛋白质。使用抗pvrig pab(亚诺法(abnova))来分析稳定地表达人类pvrig-flag蛋 白质的hek293细胞。表达空载体的细胞用作阴性对照。通过山羊抗小鼠pe结合的第 二抗体进行检测并且通过facs分析。
56.图25描绘了实例中所用的人类pvrig(显示了两个不同的甲硫氨酸起始点)和 pvrig fc融合蛋白的全长序列。信号肽加下划线，ecd加双下划线，并且fc结构域加 下划虚线。
57.图26描绘了如实例5中所示的pvrig的结合伴侣(binding partner)人脊髓灰质炎 病毒受体相关蛋白2(pvlr2，也被称作nectin-2、cd112或疱疹病毒侵入介质b(hveb)) 的序列。pvlr2是人质膜糖蛋白。
58.图27是pvrig抗体对经过工程改造以过表达pvrig的hek细胞的特异性。数据 显示，绝对几何mfi(gmfi)测量值随抗体浓度增加而增加。含有正方形的黑虚线显 示代表性抗人类pvrig抗体(cpa.7.021)对hek hpvrig细胞的染，并且含有圆形 的黑实线显示相同抗体对hek亲本细胞的染。
59.图28通过qpcr评定各种癌细胞系中的pvrig rna。所示数据是pvrig rna在 细胞系中相对于在expi细胞中的水平的倍数变化的相对表达，如通过2
(-δδct)
法所评定。
60.图29通过qpcr评定经过分选的pbmc亚组中的pvrig rna。所示数据是pvrigrna在每个亚组中相对于在hek gfp细胞中的水平的倍数变化的相对表达，如通过 2
(-δδct)
法所评定。d47到d49表示三个单独的供体。cd4表示cd4 t细胞，cd8表示 cd8 t细胞，cd14表示单核细胞，并且cd56表示nk细胞。
61.图30a到图30b.图30a：在初始条件和活化条件下通过qpcr评定经过分选的cd4 t细胞(cd4)和nk细胞(nk)中的pvrig rna。用人类t细胞刺激物戴诺磁珠 (dynabead)和50u/ml il-2刺激cd4 t细胞3天。使nk细胞在50u/ml il-2中刺激3 天。所示数据是pvrig rna在每个亚组中相对于在expi细胞中的水平的倍数变化的相 对表达，如通过2
(-δδct)
法所评定。包括jurkat作为阳性对照。d47到d49表示三个单独 的供体。图30b在初始条件和活化条件下通过qpcr评定经过分选的cd8 t细胞中的 pvrig rna。用人类t细胞刺激物戴诺磁珠和100u/ml il-2刺激cd8 t细胞3天。所 示数据是pvrig rna在每个亚组中相对于在expi细胞
中的水平的倍数变化的相对表 达，如通过2
(-δδct)
法所评定。包括jurkat作为阳性对照。d49、70和71指示三个单独 的供体。
62.图31a到图31b是pvrig与hek hpvrig工程改造的细胞系、hek亲本细胞、 ca46细胞以及jurkat细胞的结合特征。hek oe表示hek hpvrig细胞，hek par表 示hek亲本细胞。关于jurkat和ca46数据，gmfir指示pvrig抗体染的几何mfi 相对于其对照的倍数差异。浓度指示计算gmfir时的浓度。非可靠拟合指示抗体结合特 征确实满足恰当的数学拟合要求。一些抗体因为不良的结合特征、特异性或可制造性， 所以在一些条件下并没有测试。
63.图32a到图32b是pvrig与原代人类pbmc、cyno瞬时过表达细胞以及cyno原 代pbmc的结合特征。expi cyno oe表示经过cpvrig瞬时转染的expi细胞，expi par 表示expi亲本细胞。gmfir指示pvrig抗体染的几何mfi相对于其对照的倍数差异。 浓度指示计算gmfir时的浓度。如图31中一样，一些抗体因为不良的结合特征、特异 性或可制造性，所以在一些条件下并没有测试。另外，对选择抗体基于其结合cpvrig 瞬时细胞的能力或功能性进行鉴别分类(triage)以筛选出cyno pbmc亚组。pvrig在 cd4 t细胞上的表达类似于表中关于cd8 t细胞所述的表达。
64.图33是pvrig抗体对ca46和jurkat细胞的特异性。数据显示，通过facs得到 的绝对几何mfi(gmfi)测量值随抗体浓度增加而增加。含有三角形的黑实线显示抗 人类pvrig抗体(cpa.7.021)对ca46细胞的染并且含有正方形的黑实线显示jurkat 细胞的染。ov-90(含有倒三角形的虚线)和nci-h4411(含有菱形的虚线)显示为 阴性对照。
65.图34a到图34d是pvrig抗体与cpvrig瞬时细胞的交叉反应性。数据显示了作 为cpvrig瞬时细胞上的负结合剂(a-b，cpa.7.021)和正结合剂(c-d，cpa.7.024)的 抗体的实例。实心灰直方图指示对照抗体，空心黑直方图指示所关注的抗体。细胞 用每种抗体按5μg/ml的浓度染。
66.图35通过qpcr评定经过分选的cyno pbmc亚组中的cpvrig rna。所示数据是 如通过定向于cpvrig基因的两个独特区域的两组引物从三个cyno供体检测到的平均 ct值。
67.图36a到图36c通过facs评定a)cd16+淋巴细胞(nk细胞)、b)cd14+cd56+ 骨髓细胞(单核细胞)以及c)cd3+淋巴细胞(t细胞)上的cpvrig蛋白质。数据显 示为绝对几何mfi，其中黑实线指示背景荧光水平。数据代表了在三个cyno供体中 测试的我们的抗人类pvrig抗体组的样品。
68.图37a到图37b显示如实例5中所述，确定可成功阻断pvrig与其对应物pvrl2 的相互作用的fab的cdr序列。
69.图38a到图38aa显示结合pvrig并且阻断pvrig和pvlr2的结合的本发明所 列举的人类cpa抗pvrig序列的重链可变结构域和轻链可变结构域、全长重链和轻链 以及重链可变cdr和轻链可变cdr的氨基酸序列。
70.图39a到图39h描绘了结合pvrig但不阻断pvrig和pvlr2的结合的本发明的 八个人类cpa抗pvrig序列的重链可变结构域和轻链可变结构域、全长重链和轻链以 及重链可变cdr和轻链可变cdr的氨基酸序列。
71.图40a到图40d描绘了所有产生的结合pvrig的cpa抗pvrig抗体序列的cdr， 包括不阻断pvrig和pvlr2的结合的那些。
72.图41a到图41dd描绘了以下所列举的本发明cha抗体中的每一个的可变重链和 轻
链以及vhcdr1、vhcdr2、vhcdr3、vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3序列：cha.7.502、 cha.7.503、cha.7.506、cha.7.508、cha.7.510、cha.7.512、cha.7.514、cha.7.516、 cha.7.518、cha.7.520.1、cha.7.520.2、cha.7.522、cha.7.524、cha.7.526、cha.7.527、 cha.7.528、cha.7.530、cha.7.534、cha.7.535、cha.7.537、cha.7.538.1、cha.7.538.2、 cha.7.543、cha.7.544、cha.7.545、cha.7.546、cha.7.547、cha.7.548、cha.7.549 以及cha.7.550(这些序列包括来自小鼠序列(来自融合瘤)的可变重链和轻链序列)。
73.图42描绘了实例11的分库(binning)结果。不分库：cpa.7.029和cpa.7.026(不 与抗原结合)。
74.图43是35种抗pvrig mab对抗原的成对阻断(“0”，红方框)或夹心(“1”， 绿方框)的二元矩阵。矩阵左侧竖直列出的mab是共价固定到proteon阵列上的mab。 矩阵顶部水平列出的mab是注射了预混合抗原的分析物。克隆cpa.7.041仅作为分析物 进行研究。黑方框根据mab的竖直阻断模式勾画了四个表位库(epitope bin)的轮廓。
75.图44是图43的二元矩阵中的每个mab的竖直结合模式的层次聚类(hierarchicalclustering)树状图。每组内存在四个具有相同的表位阻断模式的mab库。库1与2之 间的唯一区别是库1中的mab阻断抗原与克隆cpa.7.039的结合，而库2中的mab能 够与cpa.7.039一起对抗原进行夹心。克隆cpa.7.050能够与所有其它克隆一起对抗原 进行夹心。
76.图45a到图45jj是指示cpa.7.036与所有其它固定的mab的抗原阻断模式的传感 图(sensorgram)，这些是1号库的代表性数据。每个图代表具有不同的固定mab的不 同proteon芯片阵列点。蓝反应是只有抗原的对照。黑反应是cpa.7.036在摩尔浓 度过量的抗原中的预混合溶液。灰反应是只有mab的对照注射液。cpa.7.36阻断抗 原与除了cpa.7.050(jj)以外的所有其它mab的结合。
77.图46a到图46jj是指示cpa.7.034与所有其它固定的mab的抗原阻断模式的传感 图，这些是2号库的代表性数据。每个图代表具有不同的固定mab的不同proteon芯片 阵列点。蓝反应是只有抗原的对照。黑反应是cpa.7.34在摩尔浓度过量的抗原中的 预混合溶液。灰反应是只有mab的对照注射液。cpa.7.34阻断抗原与除了cpa.7.039 (dd)和cpa.7.050(jj)以外的所有其它mab的结合。
78.图47a到图47jj是指示cpa.7.039与所有其它固定的mab的抗原阻断模式的传感 图。cpa.7.039是3号库中的唯一mab。每个图代表具有不同的固定mab的不同proteon 芯片阵列点。蓝反应是只有抗原的对照。黑反应是cpa.7.039在摩尔浓度过量的抗 原中的预混合溶液。灰反应是只有mab的对照注射液。图c、f、h、j、l、n、r、 s、z、ee、gg、hh、ii和jj显示抗原的夹心。
79.图48a到图48jj是指示cpa.7.050与所有其它固定的mab的抗原阻断模式的传感 图。cpa.7.050是4号库中的唯一mab。每个图代表具有不同的固定mab的不同proteon 芯片阵列点。蓝反应是只有抗原的对照。黑反应是cpa.7.50在摩尔浓度过量的抗原 中的预混合溶液。灰反应是只有mab的对照注射液。只有图jj显示了这样的抗原阻 断，其中cpa.7.050本身被注射了w/抗原。
80.图49显示了实例12的spr实验的结果。
81.图50a到图50q是多种浓度的抗pvrig fab在注射到所捕获的人类pvrig融合蛋 白(黑线)上的上清液中的spr传感图数据。红线显示与多种浓度的fab的1:1球形动 力学拟
合，用于评估相互作用的ka和kd。字母指示表1中列出的克隆，表1还列了所得 速率常数和所计算的kd。
82.图51a到图51c是克隆cpa.7.009(a)、cpa.7.003(b)和cpa.7.014(c)与所 捕获的人类pvrig融合蛋白的结合的spr传感图。这些是实例，其中传感图显示了复 杂的多相动力学，并且因此无法可靠地估计速率常数。
83.图52a到图52b显示了实例5中的“额外验证研究4”的阻断研究的结果。
84.图53显示，在同种异体活化之后，pvrig在cd4+t细胞上以及在cd8+t细胞和 双阴性γδt细胞上的表达上调。在所测试的两个供体中的一个的pbmc中观察到了这 种上调。
85.图54显示实例1g中所测试的人细胞系。
86.图55显示实例1g中所测试的小鼠细胞系。
87.图56a到图56c.人类pvrig在各种人癌细胞系中的转录物表达。通过qrt-pcr， 使用taqman探针验证若干细胞系中的人转录物。直方图表示使用taqman探针 hs04189293_g1观察到的数据。ct值详细列于表中。分析指示jurkat、hut78和hl60 中的高转录以及thp1和rpmi8226细胞系中的低水平。
88.图57a到图57b是小鼠pvrig在各种小鼠细胞系中的转录物表达。通过qrt-pcr， 使用taqman探针验证若干细胞系中的小鼠转录物。直方图表示使用taqman探针 cc70l8h观察到的数据。ct值详细列于表中。分析指示nih/3t3、renca、sai/n和j774a.1 中的高转录以及ct26和b104-1-1细胞系中的低水平。
89.图58使用各种细胞系的全细胞提取物，用商业抗人类pvrig兔多克隆抗体(西格 玛(sigma)，目录号hpa047497)通过wb分析pvrig蛋白质的内源性表达。异位过 表达人pvrig的hek293细胞(泳道2)或用空载体转染的细胞(泳道1)的提取物分 别用作阳性对照和阴性对照。
90.图59是用pvrig sirna转染的jurkat细胞系中的人pvrig转录物的qrt-pcr分 析。使用人pvrig taqman探针#hs04189293_g1，通过qrt-pcr分析经过人pvrigsirna或乱序(scrambled)sirna转染的jurkat人癌细胞系，并且用上表中所指出的两 个管家基因(housekeeping gene)的几何平均值进行归一化。ct值详细列于表中。指出 pcr反应的技术性一式三份的标准偏差。
91.图60是人pvrig蛋白质在经过人pvrig sirna转染的jurkat人细胞系中的膜表 达。用单克隆抗pvrig抗体(包括cpa.7.021)(左图，绿线)或igg2同种型对照抗体 (左图，蓝线)和西格玛抗体(右图，红线)或igg(右图，蓝线)对经过人pvrig sirna 转染的jurkat细胞进行染。用相同的抗pvrig(橙)或同种型对照(左图红线是 mab染；右图绿线是西格玛抗体)对经过乱序sirna转染的细胞进行染。在细胞 洗涤之后，向单独的西格玛抗体中添加pe-山羊抗小鼠结合的第二抗体。
92.图61指示本报告中所述的结果的汇总，突出了在qpcr与facs之间显示出相关性 的细胞系，通过敲低(knock down)来确认，hskg-管家基因，+-阳性，nt-未测 试，x-阴性，kd-敲低。
93.图62指示本报告中所述的结果的汇总，突出了在qpcr与facs之间显示出相关性 的细胞系，通过敲低来确认。hskg-管家基因，+-阳性，nt-未测试，x-阴性， kd-敲低。
94.图63a到图63d描绘了所列举的本发明cpa抗体cpa.7.001到cpa.7.050中的每 一
个的vhcdr1、vhcdr2、vhcdr3、vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3序列是人类序列(来 自噬菌体展示)。
95.图64a到图64b显示了实例1b中的筛选的结果。
96.图65是实例1i中所用的抗体细节和染浓度。
97.图66a到图66c描绘了人igg1、igg2、igg3和igg4的序列。
98.图67描绘了许多的人pvrig ecd片段。
99.图68描绘了如实例13中所示的cpa.7.021的结合曲线。
100.图69a到图69c是cd137和pd-1表面表达的检测。活化cd8+t细胞、cd4+t 细胞和til并且随时间推移在如m&m中所述的4个时间点进行监测。静息细胞或活化 细胞首先针对淋巴细胞进行设门(gate)(fsc-a对比ssc-a)，接着是活细胞设门，进 一步针对单线(fsc-h对比fsc-a)、cd4/cd8阳性细胞进行设门，并且进一步针对 cd137和pd1进行设门。将pd-1(左)和cd137(右)在活化时程内的不同时间点在 (a)cd8+t细胞、(b)cd4+t细胞和(c)til上的表面表达针对同种型对照进行归 一化。
101.图70a到图70c是pvrig在静息的和活化的cd4+t细胞和cd8+t细胞上的表 达。活化cd4+和cd8+t细胞并且随时间推移在如m&m中所述的4个时间点进行监 测。将细胞用活力染料(viability dye)进行染，接着与抗pvrig和同种型对照 (7.5g/ml)一起孵育，并且通过流式细胞仪评估。(a)在cd4+t细胞上的表达。在单 一设门24h、48h、72h和144h之后，pvrig相比于同种型对照在活的静息的(时间 0)和活化的cd4+细胞上的表达。(b)在cd8+t细胞上的表达。在单一设门24h、 48h、72h和144h之后，pvrig相比于同种型对照在活的静息的(时间0)和活化的 cd8+细胞上的表达。示出了所获得的荧光强度值的几何平均值。(c)在活化时程内用 抗pvrig-cpa.7.021抗体相比于人类igg2同种型进行的倍数诱导染的归一化。
102.图71a到图71c是pvrig在静息的和活化的til上的表达。活化til mart1和209 并且随时间推移在如m&m中所述的4个时间点进行监测。将细胞用活力染料进行染， 接着与抗pvrig和同种型对照(7.5g/ml)一起孵育，并且通过流式细胞仪评估。(a) 在til mart1上的表达。在单一设门24h、48h、72h和144h之后，pvrig相比于同 种型对照在活的静息的(时间0)和活化的til上的表达。(b)在til 209上的表达。 在单一设门24h、48h、72h和144h之后，pvrig相比于同种型对照在活的静息的(时 间0)和活化的til上的表达。示出了所获得的荧光强度值的几何平均值。(c)在活化 时程内用抗pvrig-cpa.7.021抗体相比于人类igg2同种型对照进行的倍数诱导染的 归一化。
103.图72是pvrl2在单核细胞衍生的dc上的表达。示出了pvrl2随时间(天)而 变的表达(含三角形的虚线)相对于同种型对照(含圆形的实线)。分化后的天数指示 向单核细胞中添加gm-csf和il-4后的时间。
104.图73a到图73b是pvrig在mlr中在cd4和cd8 t细胞上的表达。示出了pvrig 在增殖性(cfse低)和非增殖性t细胞(cfse高)上的表达。数据源自三个单独的 cd3 t细胞供体和一系列pvrig抗体。在x轴上度量cfse并且在y轴上度量pvrig 表达。前3个系列的散点图指示pvrig在cd4 t细胞上的表达，并且后3个系列指示 在cd8 t细胞上的表达。
105.图74a到图74b是pvrig在mlr中在cd4和cd8 t细胞上的归一化表达。在所 分析的所有抗体中，示出了来自三个单独的cd3 t细胞供体的pvrig相对于migg1同 种型对照的表
达。
106.图75a到图75b pvrig抗体增加了mlr中的t细胞增殖。示出了来自用所指示的 pvrig抗体处理过的mlr分析的cfse低细胞的百分比。每个图表示一个单独的cd3 t 细胞供体。
107.图76是pvrig抗体在t细胞上的基于facs的表位分析。在t细胞与源自我们的 融合瘤操作的未结合的pvrig抗体预孵育之后指示结合的cpa.7.021(源自噬菌体周期 (phage campaign))以及相关对照的结合水平。对源自mlr的cfse低t细胞进行分析。
108.图77是pvrig抗体对经过工程改造以过表达pvrig的hek细胞的特异性。数据 显示，绝对几何mfi(gmfi)测量值随抗体浓度增加而增加。含有正方形的黑虚线显 示代表性抗人类pvrig抗体(cpa.7.518)对hek hpvrig细胞的染，并且含有圆形 的黑实线显示相同抗体对hek亲本细胞的染。
109.图78pvrig抗体显示出对jurkat细胞的特异性。数据显示，通过facs得到的绝 对几何mfi(gmfi)测量值随抗体浓度增加而增加。含有正方形的黑虚线显示抗人类 pvrig抗体(cpa.7.518)对jurkat细胞的染，并且含有圆形的黑实线显示用migg1 对照抗体进行的染。
110.图79a到图79b是pvrig融合瘤抗体与hek hpvrig工程改造的细胞系、hek 亲本细胞以及jurkat细胞的结合特征。hek oe表示hek hpvrig细胞，hek par表示 hek亲本细胞。关于jurkat数据，gmfir指示pvrig抗体染的几何mfi相对于其对 照的倍数差异。浓度指示计算gmfir时的浓度。无结合指示抗体不结合到所测试的细胞 系。突出显示的抗体是
‘
前四名’所关注的抗体。
111.图80a到图80b是pvrig融合瘤抗体与原代人类pbmc、cyno过表达细胞以及cyno 原代pbmc的结合特征。expi cyno oe表示经过cpvrig瞬时转染的expi细胞，expi par 表示expi亲本细胞。gmfir指示pvrig抗体染的几何mfi相对于其对照的倍数差异。 浓度指示计算gmfir时的浓度。未测试指示因为缺少与人类hek hpvrig、expi cpvrig 细胞的结合或不符合pbmc亚组的结合要求而未进行测试的抗体。突出显示的抗体是
‘
前 四名’所关注的抗体。
112.图81a到图81b是pvrig抗体在基于facs的竞争分析中的阻断能力的汇总。指 出了抑制的ic
50
。无ic
50
指示这些抗体是非阻断剂。突出显示的抗体是
‘
前四名’所关注 的抗体。
113.图82是在用sirna电穿孔24h后在til中进行的kd验证。til用抗pvrig或抗 pd-1进行染，通过facs分析。计算kd体相对于用相关抗体染的scr的百分 比。
114.图83a到图83c将kd til(mart-1特异性)与黑素瘤细胞624在1:1e:t中共培 养18h，并且用抗cd8a抗体以及抗cd137抗体染，通过facs分析。绘制了几何平 均荧光强度(a)。还收集了共培养上清液并且在th1 th2 th17细胞微珠阵列分析中进 行测试以检测所分泌的细胞因子。检测ifnγ和tnf水平(b、c)。通过比较每种处理 与scr对照来计算处理效果的百分比。图显示了2个独立实验的代表性数据。通过一式 三份样品的学生t检验(student's t-test)(*p≤0.05，**p≤0.01)比较各处理。
115.图84a到图84b将kd til(f4 gp100特异性)与黑素瘤细胞624在1:3e:t中共 培养18h，并且用抗cd8a抗体以及抗cd137抗体染，通过facs分析。绘制了几何 平均荧光强度(a)。还收集了共培养上清液并且在th1 th2 th17细胞微珠阵列分析中 进行测试以检测所
分泌的细胞因子。检测ifnγ水平(b)。通过比较每种处理与scr对 照来计算处理效果的百分比。图显示了2个独立实验的代表性数据。通过一式三份样品 的学生t检验(*p≤0.05，**p≤0.01)比较各处理。
116.图85a到图85b将til与黑素瘤细胞624在1:1e:t下在存在抗pvrig抗体 (cpa.7.021；10μg/ml)、抗tigit(10a7克隆；10μg/ml)或其组合的情况下共培养18 h。收集上清液并且在th1 th2 th17细胞微珠阵列分析中进行测试以检测所分泌的细胞 因子。检测ifnγ(a)和tnf(b)水平。通过一式三份样品的学生t检验(*p≤0.05， **p≤0.01)比较各处理。
117.图86a到图86f将mart-1或209til与黑素瘤细胞624在1:1e:t下在存在抗 pvrig抗体(cpa.7.021；10μg/ml)、抗dnam1(dx11克隆；10μg/ml)或其组合的 情况下共培养18h。收集上清液并且在th1 th2 th17细胞微珠阵列分析中进行测试以检 测所分泌的细胞因子。检测ifnγ(a、d)和tnf(b、e)水平。针对cd137的表面 表达对til进行染(c、f)。
118.图87a到图87b将til(f4)与黑素瘤细胞624在1:3e:t下在存在抗pvrig抗体 (cpa.7.021；10μg/ml)、抗tigit(10a7克隆；10μg/ml)、抗pd1(mab 1b8，默克公 司；10μg/ml)或其组合的情况下共培养18h。收集上清液并且在th1 th2 th17细胞微 珠阵列分析中进行测试以检测所分泌的细胞因子。检测ifnγ(a)和tnf(b)水平。
119.图88a到图88i描绘了cha.7.518、cha.7.524、cha.7.530、cha.7.538_1以及 cha.7.538_2各自的四个人源化序列。应注意，cha.7.538_2的轻链与cha.7.538_1相 同。各自的“h1”是与人类框架的“cdr交换”，无改变。后续序列改变了用较大的粗体字 显示的框架改变。cdr序列用粗体表示。根据网站www.bioinf.org.uk/abs/，cdr定义是 abm。人类生殖系和连接序列来自即国际信息系统 www.imgt.org(创建者和管理者：法国蒙彼利埃(montpellier,france)的marie-paulelefranc)。残基编号显示为序列的(seq)或根据chothia，根据网站www.bioinf.org.uk/abs/ (abm)。“b”表示埋入的侧链；“p”表示部分埋入；“i”表示在vh与vl结构域之间的界 面处的侧链。人类和鼠类生殖系之间的序列差异用星号(*)表示。在序列下方标注潜 在的额外框架突变。如图上所提到的，在每个cdr序列下方标注潜在的cdr序列改变 (#脱酰胺取代：q/s/a；这些取代可以防止天冬酰胺(n)脱酰胺。@氨酸氧化取代： y/f/h；这些取代可以防止氨酸氧化；@甲硫氨酸氧化取代：l/f/a)。
120.图89a-e描绘了五个cha抗体的一系列人源化序列。
121.图90描绘了用于组合图88和图89的人源化vh和vl cha抗体的流程。“chimvh
”ꢀ
和“chimvl”是连接到人类igg恒定结构域的小鼠可变重链和轻链序列。
122.图91是pvrig融合瘤抗体与原代人类pbmc、cyno过表达细胞以及cyno原代 pbmc的结合特征。expi cyno oe表示经过cpvrig瞬时转染的expi细胞，expi par表 示expi亲本细胞。gmfir指示pvrig抗体染的几何mfi相对于其对照的倍数差异。 浓度指示计算gmfir时的浓度。未测试指示因为缺少与人类hek hpvrig、expi cpvrig 细胞的结合或不符合pbmc亚组的结合要求而未进行测试的抗体。突出显示的抗体是进 行人源化的四个抗体(参见图90)。
123.图92是pvrig抗体在基于facs的竞争分析中的阻断能力的汇总。指出了抑制的 ic50。无ic50指示这些抗体是非阻断剂。突出显示的抗体是进行人源化的四个抗体(参 见
图90)。
124.图93a到图93c是pvrig抗体阻断pvrig与pvrl2之间的相互作用的作用。(a-b) 数据显示绝对gmfi的变化，代笔着当添加四个pvrig抗体以破坏相互作用时可溶性 pvrig与hek细胞的结合的变化。还指出了每个抗体在每个分析中的ic
50
值。a)数 据显示当抗体与抗原一起预孵育时hek细胞对可溶性pvrig的破坏。b)数据显示当 同时添加抗体与抗原时可溶性pvrig与hek细胞的破坏。c)数据显示绝对gmfi的 变化，代表着当添加四个pvrig抗体以破坏相互作用时可溶性pvrl2 fc与hekhpvrig细胞的结合变化。指出了每个抗体的ic
50
值。nd表示未测定。
125.图94a到图94h是nk细胞受体和配体在reh细胞上的表达。显示了如a)pvrig、 b)dnam-1、c)tigit的nk细胞受体的表达。显示了如d)pvr、e)pvrl2、f)ulbp2/5/6、 g)ulbp3以及h)mica/b的nk受体配体的表达。实心灰直方图表示同种型对照并 且空心黑直方图表示所关注的抗体。
126.图95是pvrig抗体增强nk细胞介导的对reh细胞的细胞毒性的作用。检查5μg/mlcpa.7.002(a)、cpa.7.005(b)、cpa.7.021(a-c)以及cpa.7.050(c)在针对reh细 胞的nk细胞细胞毒性分析中的作用，其中针对恒定数量的reh细胞滴定nk细胞的数 量。d)在恒定数量的nk:reh细胞(5:1)下，检查改变cpa.7.002和cpa.7.021的浓度 对nk细胞介导的细胞毒性的影响。在分析中在如图a到c中所概述的条件下检查 dnam-1(e)和tigit(f)。
127.图96a到图96h是nk细胞受体和配体在molm-13细胞上的表达。显示了如a) pvrig、b)dnam-1、c)tigit的nk细胞受体的表达。显示了如d)pvr、e)pvrl2、 f)ulbp2/5/6、g)ulbp3以及h)mica/b的nk受体配体的表达。实心灰直方图表 示同种型对照并且空心黑直方图表示所关注的抗体。
128.图97a到图97b是pvrig抗体增强nk细胞介导的对molm-13细胞的细胞毒性 的作用。a)检查5μg/ml cpa.7.002、cpa.7.005和cpa.7.021在针对molm-13细胞的 nk细胞细胞毒性分析中的作用，其中针对恒定数量的molm-13细胞滴定nk细胞的 数量。b)类似于图a检查tigit。
129.图98是pvrig抗体在细胞生化分析中的阻断能力的汇总。指出了分析排列与方向 和抑制的ic
50
。(p)指示pvrig抗体在添加到hek细胞中之前与pvrig抗原一起预 孵育的分析排列。(np)指示pvrig抗体和pvrig抗原同时添加到hek细胞中。增加 的结合指示pvrl2 fc与hek hpvrig细胞的结合增强，而不是被抑制。
130.图99：选定pvrig抗体在针对reh和molm-13细胞的nk细胞细胞毒性分析中 的活性的汇总。通过用pvrig抗体条件下的绝对杀死水平(％)除以对照抗体情况下的 绝对杀死水平(％)来计算相对于对照的细胞毒性倍数变化。从5:1的效靶比计算倍数 变化。
131.图100 pvrig直系同源物的序列比对.比对人类、食蟹猴、狨猴以及恒河猴pvrig 胞外结构域的序列。人类与食蟹猴之间的差异用黄突出显示。
132.图101是抗人类pvrig抗体与cyno、人类、cyno/人类混合pvrig变异体的结合。 显示了抗体与野生型cyno pvrig(
●
)、h61r cyno pvrig(
■
)、p67s cyno pvrig l95r/t97i cyno pvrig以及野生型人类pvrig(
◆
)的结合。绘制elisa信号随 抗体浓度而变的图。
133.图102是抗人类pvrig抗体的表位组和食蟹猴交叉反应性的相关性。
134.图103a到图103bx显示在本发明中使用的多个序列。
具体实施方式
135.i.引言
136.癌症可以认为是患者无法识别和消除癌细胞。在许多情况下，这些经过转化(例如， 癌变)的细胞抵制免疫监视。存在天然的控制机制来限制体内t细胞活化，从而预防t 细胞活性不受限制，癌细胞能够利用这点避开或抑制免疫反应。恢复免疫效应细胞、尤 其是t细胞识别和消除癌症的能力是免疫疗法的目标。免疫肿瘤学领域，有时称为“免 疫疗法”，正在迅速发展，最近批准了若干t细胞检查点抑制性抗体，如yervoy、keytruda 和opdivo。这些抗体通常称为“检查点抑制剂”，因为它们阻断了t细胞免疫的正常负性 调节剂。通常认为，可以使用各种免疫调节信号(共刺激的和共抑制的)来安排最佳的 抗原特异性免疫反应。一般来说，这些抗体结合到检查点抑制剂蛋白质，如ctla-4和 pd-1，它们在正常情况下防止或抑制细胞毒性t细胞(ctl)的活化。通过抑制检查点 蛋白质，例如通过使用结合这些蛋白质的抗体，能够实现针对肿瘤的t细胞反应的增加。 也就是说，这些癌症检查点蛋白质抑制了免疫反应；当例如使用针对检查点蛋白质的抗 体阻断蛋白质时，免疫系统被激活，产生免疫刺激，引起对如癌症和传染病等病况的治 疗。
137.本发明针对含有人脊髓灰质炎病毒受体相关免疫球蛋白结构域的蛋白质或
ꢀ“
pvrig”、在本文中有时也被称作“pv蛋白质”的抗体的用途。pvrig在nk和t细胞 的细胞表面上表达并且与其它已知的免疫检查点具有若干相似性。
138.为了鉴别新颖的免疫检查点，使用计算算法分析人类基因组。鉴别出了这样的基因， 预测它们是细胞表面蛋白质，具有在肿瘤微环境内在免疫细胞上表达的ig结构域，尤其 是在假定为受体的肿瘤浸润性淋巴细胞(til)上表达。鉴别出了具有单一igv结构域 并且具有细胞内itim样基序的蛋白质，这说明它们充当免疫检查点并对t细胞和/或 nk细胞具有抑制作用。一旦通过计算鉴别出，就进行各种验证实验，包括：表达研究， 证实pvrig在淋巴细胞上和在肿瘤微环境内的淋巴细胞上表达并且对nk和t细胞具 有抑制作用(用敲低实验和定向于pvrig的抗体证明)。pvrl2经过鉴别/确认是pvrig 的对应物。产生结合到pvrig的抗体，并且然后鉴别结合到pvrig并且阻断pvrig 和pvlr2的相互作用的抗体亚组。
139.因此，当pvrig与其配体(pvrl2)结合时，产生抑制信号，抑制信号用以减弱 nk和t细胞针对靶细胞的免疫反应(即类似于pd-1/pdl1)。阻断pvrl2与pvrig的 结合中断了pvrig的这种抑制信号并且其结果是调节nk和t细胞的免疫反应。利用 抗pvrig抗体来阻断与pvrl2的结合是一种能够增强nk和t细胞对癌细胞的杀死的 途径。已经产生了结合pvrig并阻断其配体pvrl2的结合的阻断抗体。
140.如实例部分中所示，pvrig的表达与已知的免疫检查点蛋白质pd-1的表达正相关。 另外，pvrig(作为胞外结构域(ecd)融合蛋白)的引入显示抑制了t细胞的活化， 并且因此抗pvrig抗体的使用导致t细胞活化。因此，抗pvrig抗体可以用来期 望活化t细胞或nk细胞的病况，如癌症。
141.pvrig阻断抗体对nk和t细胞的功能作用可以通过在体外(并且在一些情况下在 体内，如下文更充分地描述)测量以下参数的改变来评定：增殖、细胞因子释放和细胞 表面标志物。关于nk细胞，细胞增殖、细胞毒性(杀伤靶细胞的能力，如通过cd107a、 颗粒酶以及
穿孔素表达的增加，或通过直接测量靶细胞杀死所测量)、细胞因子产生(例 如，ifn-γ和tnf)以及细胞表面受体表达(例如，cd25)的增加指示免疫调节，例如 癌细胞杀死增强。关于t细胞，增殖增加、细胞表面活化标志物(例如，cd25、cd69、 cd137和pd1)的表达增加、细胞毒性(杀死靶细胞的能力)增加以及细胞因子产生(例 如，il-2、il-4、il-6、ifnγ、tnf-a、il-10、il-17a)增加指示免疫调节，例如癌细胞 杀死增强。
142.因此，本发明提供结合到人类pvrig pp的抗体，包括抗原结合结构域，以及活化 t细胞和/或nk细胞来疾病的方法，所述疾病如癌症和传染病以及免疫活性增加可 引起的其它病况。
143.ii.pvrig蛋白质
144.本发明提供特异性结合到pvrig蛋白质的抗体。“蛋白质”在此情况下可与“多肽
”ꢀ
互换使用，并且也包括肽。本发明提供特异性结合到pvrig蛋白质的抗体。pvrig是 一种跨膜结构域蛋白质，长度是326个氨基酸，含有信号肽(横跨氨基酸1到40)、胞 外结构域(横跨氨基酸41到171)、跨膜结构域(横跨氨基酸172到190)以及细胞质 结构域(横跨氨基酸191到326)。全长人类pvrig蛋白质显示在图25中。存在两个甲 硫氨酸，它们可以是起始密码子，但是成熟蛋白质是相同的。
145.因此，如本文所用，术语“pvrig”或“pvrig蛋白质”或“pvrig多肽”可以任选地包 括任何这类蛋白质或其变异体、结合物或片段，包括(但不限于)如本文所述的已知或 野生型pvrig，以及任何天然产生的剪接变异体、氨基酸变异体或同工型，并且尤其是 pvrig的ecd片段。术语pvrig的“可溶性”形式也可与术语“可溶性胞外域(ecd)
”ꢀ
或“胞外域”或“胞外结构域(ecd)”以及“pvrig多肽的片段”互换使用，它们可以泛指 以下任选的多肽中的一个或多个：
146.pvrig蛋白质含有在胞外结构域内的免疫球蛋白(ig)结构域，这是pvr样ig折 叠结构域。pvr样ig折叠结构域可能是通过与其它b7家族成员的相似性而造成功能性 对应物结合的原因。胞外结构域的pvr样ig折叠结构域包括在结构域内半胱氨酸残基 之间形成的一个二硫键，这对这种折叠来说是典型的并且对于结构-功能来说可能是重要 的。这些半胱氨酸位于残基22和93(或94)处。在一个实施例中，提供能够在测试pvrig 抗体时使用的pvrig的可溶性片段。
147.在pvrig蛋白质的定义内包括pvrig ecd片段。任选地，pvrig ecd片段也指 图67中列出的多肽序列中的任一个，合理地预期其包含pvrig蛋白质的功能性区域。 这种预期是基于一组3d结构已解析的蛋白质复合体的系统分析，其含有ig蛋白质的复 合体(例如pdb id 1i85，其描述ctla4和cd86的复合体)。从每个pdb的每个“共结 构”收集分子间接触残基并且按pvrig的序列投射。鉴别具有由若干接触映射支撑的相 互作用残基簇的若干区域并且合成为一系列肽，并且合理地预期其模拟完整全长蛋白质 的结构并且由此调整pvrig对免疫力和特异性免疫细胞类型的影响中的一种或多种。 根据本发明的至少一些实施例，由图67中列出的多肽序列表示的pvrig ecd片段如下 定位(相比于图25的人类pvrig ecd，从ecd的第一个氨基酸开始计数)：pvrig片 段a位于位置46到66；pvrig片段b位于位置46到79；pvrig片段c位于位置63 到79；pvrig片段d位于位置91到106；pvrig片段e位于位置91到114；pvrig 片段f位于位置11到25；pvrig片段g位于位置3到24；pvrig片段h位于位置18 到36；pvrig片段i位于位置29到52；pvrig片段j位于位置73到98。
148.如此处所提到的和下文更充分地所述的，结合到pvrig并且防止被pvrl2活化(例 如，最常通过阻断pvrig和pvlr2的相互作用)的抗pvrig抗体(包括抗原结合片 段)用于增强t细胞和/或nk细胞活化并且用于疾病，如癌症和病原体感染。
149.iii.抗体
150.因此，本发明提供抗pvrig抗体。pvrig也称为含有脊髓灰质炎病毒受体相关免 疫球蛋白结构域的蛋白质、q6dki7或c7orf15，是指图25中所示的以refseq登记标识 符np_076975显示的氨基酸和核酸序列。如本文中更充分地概述，本发明抗体对pvrig 胞外结构域具有特异性。
151.如下文所论述，通常使用术语“抗体”。适用于本发明中的抗体可以采用如本文所述 的多种形式，包括下文所述的传统抗体以及抗体衍生物、片段和模拟物。一般来说，术 语“抗体”包括含有至少一个抗原结合结构域的任何多肽，如下文更充分地所描述。如本 文所述，抗体可以是多克隆的、单克隆的、异种的、同种异体的、同基因的或其经过修 饰的形式，其中单克隆抗体尤其适用于多个实施例中。在一些实施例中，本发明抗体特 异性地或基本上特异性地结合到pvrig分子。如本文所用，术语“单克隆抗体”和“单克 隆抗体组合物”是指仅含有一个物种的能够与特定抗原表位发生免疫反应的抗原结合位 点的抗体分子体，而术语“多克隆抗体”和“多克隆抗体组合物”是指含有多个物种的能 够与特定抗原相互作用的抗原结合位点的抗体分子体。单克隆抗体组合物典型地对与 其发生免疫反应的特定抗原展现出单一的结合亲和力。
152.传统的全长抗体结构单元典型地包含四聚体。每种四聚体典型地由相同的两对多肽 链组成，每对具有一条“轻链”(典型地具有约25kda的分子量)和一条“重链”(典型地 具有约50-70kda的分子量)。人类轻链分类为κ和λ轻链。本发明针对igg类别，其具 有若干亚类，包括(但不限于)igg1、igg2、igg3和igg4。因此，如本文所用的“同种 型”意指由其恒定区的化学和抗原特征定义的免疫球蛋白亚类中的任一个。虽然此处命 名为“cpa”的示例性抗体是基于igg1重链恒定区，如图38中所示，但是本发明的抗 pvrig抗体包括使用igg2、igg3和igg4序列或其组合的那些抗体。举例来说，如本领 域中已知，不同的igg同种型具有不同的效应子功能，这些效应子功能可能是所期望的 或可能不是所期望的。因此，本发明的cpa抗体还能够用igg2、igg3或igg4恒定结 构域来交换igg1恒定结构域(图66中所描绘)，其中igg2和igg4尤其适用于许多情 况，例如便于制造或当期望降低效应子功能时，后者是一些情况下所期望的。
153.关于具有cha名称的所列举的抗体，这些是产生于融合瘤(“h”名称)中的鼠类抗 体，并且因此一般来说，它们如本领域中已知经过人源化，一般是在框架区(对于重链 和轻链可变区中的每一个来说是f1到f4)中，并且然后移植到人类igg1、igg2、igg3 或igg4恒定重链和轻链结构域上(图66中所描绘的)，另外igg4发现了特定用途，如 下文更充分地所述。
154.每条链的氨基端部分包括主要负责抗原识别的约100到110个或更多个氨基酸的可 变区，在本领域和本文中通常称为“fv结构域”或“fv区”。在可变区中，重链和轻链的 每个v结构域均聚集了三个环以形成抗原结合位点。每个环称为互补决定区(下文称为
ꢀ“
cdr”)，其中氨基酸序列的变异最显著。“可变”是指可变区的某些区段的序列因抗体而 广泛不同的事实。可变区内的可变性分布不均匀。相反，v区由相对不变的延伸部组成， 所述
延伸部称为15到30个氨基酸的框架区(fr)，由称为“高变区”的具有极端可变性 的较短区域隔开。
155.每个vh和vl是由三个高变区(“互补决定区”，“cdr”)和四个fr组成，从氨基 端到羧基端按以下次序排列：fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4。
156.高变区一般涵盖轻链可变区中的约氨基酸残基24-34(lcdr1；“l”表示轻链)、50-56 (lcdr2)和89-97(lcdr3)以及重链可变区中的约31-35b(hcdr1；“h”表示重链)、 50-65(hcdr2)和95-102(hcdr3)的氨基酸残基，但有时编号略有偏移，如本领域 的普通技术人员所了解；kabat等人,《免疫学感兴趣的蛋白质的序列(sequences ofproteins of immunological interest)》,第5版.马里兰州贝塞斯达的美国国 家卫生研究院的公共卫生服务部(public health service,national institutes of health, bethesda,md.)(1991)；和/或形成高变环的那些残基(例如，轻链可变区中的残基26-32 (lcdr1)、50-52(lcdr2)和91-96(lcdr3)；和重链可变区中的残基26-32(hcdr1)、 53-55(hcdr2)和96-101(hcdr3))；chothia和lesk(1987)《分子生物学杂志(j.mol. biol.)》196:901-917。本发明的特异性cdr描述于下文中并且显示于图40中。
157.每条链的羧基端部分界定了主要负责效应子功能的恒定区。kabat等人收集了重链 和轻链可变区的许多初级序列。基于序列的保守度，他们将个别初级序列分类成cdr 序列和框架序列并且拟订了其列表(参见《免疫学感兴趣的序列(sequences ofimmunological interest)》,第5版,nih公开第91-3242号，e.a.kabat等人， 此文献通过引用完全并入本文中)。
158.在免疫球蛋白的igg子类别中，重链中存在若干个免疫球蛋白结构域。“免疫球蛋 白(ig)结构域”在本文中意指具有独特的三级结构的免疫球蛋白区域。本发明中关注的 是重链结构域，包括重链恒定(ch)结构域和铰链结构域。在igg抗体的情况下，igg 同种型各自具有三个ch区。因此，igg情况下的“ch”结构域如下：“ch1”根据如kabat 中的eu索引是指位置118-220。“ch2”根据如kabat中的eu索引是指位置237-340， 并且“ch3”根据如kabat中的eu索引是指位置341-447。
159.因此，本发明提供如本文中所概述地使用的重链可变结构域、轻链可变结构域、重 链恒定结构域、轻链恒定结构域以及fc结构域。如本文所用，“可变区”意指这样的免 疫球蛋白区域，它包含基本上由分别构成κ、λ和重链免疫球蛋白基因座的vκ或vλ和 /或vh基因中的任一个所编码的一个或多个ig结构域。因此，重链可变结构域包含 vhfr1-vhcdr1-vhfr2-vhcdr2-vhfr3-vhcdr3-vhfr4，并且轻链可变结构域包含 vlfr1-vlcdr1-vlfr2-vlcdr2-vlfr3-vlcdr3-vlfr4。“重链恒定区”在本文中意指抗体的ch1-铰链-ch2-ch3部分。如本文所用，“fc”或“fc区”或“fc结构域”意指包含抗体的恒 定区(不包括第一恒定区免疫球蛋白结构域)并且在一些情况下包含铰链的一部分的多 肽。因此，fc是指iga、igd和igg的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域、ige和igm 的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域、以及这些结构域的柔性铰链n端。对于iga和igm 来说，fc可以包括j链。对于igg来说，fc结构域包含免疫球蛋白结构域cγ2和cγ3 (cγ2和cγ3)以及位于cγ1(cγ1)与cγ2(cγ2)之间的较低铰链区。虽然fc区的边 界可能不同，但是人类igg重链fc区通常被界定成在其羧基端包括残基c226或p230， 其中编号是根据如kabat中的eu索引。在一些实施例中，如下文更充分地描述，对例 如fc区进行氨基酸修饰以改变与一个或多个fcγr受体或与fcrn受体
的结合。
160.因此，如本文所用，“fc变异体”或“变异体fc”意指在fc结构域中包含氨基酸修饰 的蛋白质。本发明的fc变异体根据构成其的氨基酸修饰来定义。因此，举例来说，n434s 或434s是相对于亲本fc多肽在位置434处具有丝氨酸取代的fc变异体，其中编号是 根据eu索引。同样地，m428l/n434s定义相对于亲本fc多肽具有m428l和n434s 取代的fc变异体。wt氨基酸的身份可以不指明，在此情况下前述变异体称为 428l/434s。应注意，提供的取代次序是任意的，也就是说，例如428l/434s是与 m428l/n434s相同的fc变异体，以此类推。关于本发明中所讨论的与抗体有关的所有 位置，除非另外指出，否则氨基酸位置编号是根据eu索引。
161.如本文所用的“fab”或“fab区”意指包含vh、ch1、vl和cl免疫球蛋白结构域的 多肽。fab可指孤立的这种区域，或在全长抗体、抗体片段或fab融合蛋白的情况下的 这种区域。如本文所用的“fv”或“fv片段”或“fv区”意指包含单一抗体的vl和vh结构 域的多肽。如本领域的普通技术人员将了解，这些一般由两条链组成。
162.在本说明书通篇中，当提到可变结构域中的残基(大致是轻链可变区中的残基1-107 和重链可变区中的残基1-113)时，通常使用imtg编号系统或kabat编号系统(例如 kabat等人，同前文献(1991))。如kabat中的eu编号一般用于恒定结构域和/或fc结 构域。
163.cdr促进了抗体的抗原结合位点，或更具体地说，表位结合位点的形成。“表位
”ꢀ
是指与抗体分子可变区中的特异性抗原结合位点相互作用的决定子，称为互补位。表位 是分子的基团，如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的结构特征以及特定的电荷特征。 单一抗原可以具有超过一个表位。
164.表位可以包含直接参与结合的氨基酸残基(也称为表位的免疫显性组分)和不直接 参与结合的其它氨基酸残基，如被特异性抗原结合肽有效阻断的氨基酸残基；换句话说， 氨基酸残基位于特异性抗原结合肽的覆盖区内。
165.表位可以是构象表位或线性表位。构象表位由来自线性多肽链的不同区段的氨基酸 在空间上并列而产生。线性表位是由多肽链中的相邻氨基酸残基产生的表位。构象表位 和非构象表位的区别可以在于，在变性溶剂存在下，与构象表位的结合消失，但与非构 象表位的结合不消失。
166.呈独特空间构象的表位典型地包括至少3个且更通常至少5个或8-10个氨基酸。可 以在展示一种抗体阻断另一种抗体与靶抗原的结合的能力的简单免疫分析(例如“分 库”)中检验识别相同表位的抗体。特异性库描述于下文中。
167.在“抗体”的定义内包括抗体的“抗原结合部分”(还可与“抗原结合片段”、“抗体片段
”ꢀ
和“抗体衍生物”互换使用)。也就是说，出于本发明的目的，本发明抗体的最低功能要 求是它与pvrig抗原结合。如本领域的普通技术人员将了解，存在大量的保留抗原结 合能力但又具有替代性结构的抗原片段和衍生物，包括(但不限于)(i)由vl、vh、 cl和ch1结构域组成的fab片段；(ii)由vh和ch1结构域组成的fd片段；(iii)f(ab')2 片段，一种包含两个连接着的fab片段的二价片段；(vii)单链fv分子(scfv)，其中 vh结构域和vl结构域通过肽连接子连接，所述肽连接子允许两个结构域结合形成抗 原结合位点；(bird等人,1988,《科学(science)》242:423-426；huston等人,1988,《美 国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.u.s.a.)》85:5879-5883)242，通过引用完全 并入本文中)；(iv)“双
功能抗体”或“三功能抗体”，通过基因融合构造的多价或多特异 性片段(tomlinson等人,2000,《酶学方法(methods enzymol.)》326:461-479； wo94/13804；holliger等人,1993,《美国美国国家科学院院刊》90:6444-6448，全部 通过引用完全并入本文中)；(v)“结构域抗体”或“dab”(有时称为“免疫球蛋白单一可 变结构域”)，包括来自其它物种的单一抗体可变结构域，如啮齿动物(例如，如wo 00/29004中所公开)、护士鲨和骆驼科v-hh dab；(vi)smip(小分子免疫药物)、骆驼 抗体、纳米抗体以及ignar。
168.此外，抗体或其抗原结合部分(抗原结合片段、抗体片段、抗体部分)可以是通过 抗体或抗体部分与一个或多个其它蛋白质或肽的共价或非共价结合形成的较大的免疫 粘附分子(有时也称为“融合蛋白”)的一部分。免疫粘附分子的实例包括使用抗生蛋白 链菌素核心区来制造四聚scfv分子和使用半胱氨酸残基、标志物肽以及c端聚组氨酸 标记来制造经过生物素标记的二价scfv分子。例如fab和f(ab')2片段等抗体部分可以 使用常规技术从全抗体制备，例如分别对全抗体进行木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化。此外， 抗体、抗体部分和免疫粘附分子可以使用如本文所述的标准重组dna技术获得。
169.一般来说，本发明的抗pvrig抗体是重组抗体。如本文所用的“重组”泛指例如细胞 或核酸、蛋白质或载体等产品，表示所述细胞、核酸、蛋白质或载体已经通过引入异源 核酸或蛋白质或改变天然核酸或蛋白质而加以修饰，或所述细胞来源于如此修饰的细 胞。因此，举例来说，重组细胞表达天然(非重组)细胞形式内不存在的基因或表达原 本异常表达、低表达或完全不表达的天然基因。
170.如本文所用的术语“重组抗体”包括所有通过重组手段制备、表达、产生或分离的抗 体，如(a)从针对人类免疫球蛋白基因的转基因或转染体动物(例如，小鼠)分离 的抗体或由其制备的融合瘤(下文进一步所述)；(b)从经过转化以表达人类抗体的宿 主细胞分离的抗体，例如从转染瘤分离；(c)从重组性、组合性人类抗体库分离的抗体； 以及(d)通过任何其它涉及人类免疫球蛋白基因序列到其它dna序列的剪接的手段制 备、表达、产生或分离的抗体。这类重组人类抗体具有可变区，其中框架区和cdr区 源自人类生殖系免疫球蛋白序列。然而，在某些实施例中，这类重组人类抗体可能经历 体外突变诱发(或，当使用针对人类ig序列的转基因动物时，经历体内体细胞突变诱发) 并且因此，重组抗体的vh和v
l
区的氨基酸序列是虽然源自人类生殖系vh和v
l
序列并 且与这些序列相关，但不是天然就存在于人类抗体生殖系谱系内的序列。
171.a.任选的抗体工程改造
172.本发明抗体可以通过氨基酸取代进行修饰或工程改造以改变氨基酸序列。
[0173]“氨基酸取代”或“取代”在本文中意指用不同氨基酸替换亲本多肽序列中特定位置处 的氨基酸。具体来说，在一些实施例中，取代是针对特定位置处的并非天然产生的氨基 酸，不是在生物体内或任何生物体内天然产生的。举例来说，取代e272y是指变异体多 肽，在此情况下是fc变异体，其中在位置272处的谷氨酸被酪氨酸替换。为了清楚起 见，已经过工程改造以改变核酸编码序列但不改变起始氨基酸(例如将cgg(编码精氨 酸)换成cga(仍然编码精氨酸)来提高宿主生物体表达水平)的蛋白质不是“氨基酸 取代”；也就是说，尽管创建了编码相同蛋白质的新基因，但是如果蛋白质在特定起始 位置处具有相同氨基酸，那么它就不是氨基酸取代。
[0174]
如本文所论述，可以进行氨基酸取代来改变cdr对pvrig蛋白质的亲和力(包括 增
加和减少结合，如下文更充分地概述)，以及改变抗体的其它功能特性。举例来说， 抗体可以经过工程改造以在fc区内包括修饰，典型地用于改变抗体的一种或多种功能 特性，如血清半衰期、补体固定、fc受体结合和/或抗原依赖细胞的细胞毒性。此外， 根据本发明的至少一些实施例的抗体可以经过化学修饰(例如，可以将一个或多个化学 部分连接到抗体)或经过修饰以改变其糖基化，同样用于改变抗体的一种或多种功能特 性。这类实施例进一步描述于下文中。残基在fc区中的编号是kabat的eu索引的编号。
[0175]
在一个实施例中，对c
h1
的铰链区进行修饰以使得铰链区中的半胱氨酸残基的数量 发生改变，例如增加或减少。这种途径进一步描述于bodmer等人的第5,677,425号美国 专利中。改变ch1的铰链区中的半胱氨酸残基的数量以例如便于轻链和重链的组装或提 高或降低抗体的稳定性。
[0176]
在另一个实施例中，使抗体的fc铰链区突变以缩短抗体的生物半衰期。更具体来 说，将一个或多个氨基酸突变引入到fc铰链片段的ch2-ch3结构域界面区中，以使得 相对于天然fc铰链结构域葡萄球菌a蛋白(spa)结合，抗体具有减弱的spa结合。 这种途径进一步详细描述于ward等人的第6,165,745号美国专利中。
[0177]
在一些实施例中，可以在fc区中进行氨基酸取代，一般是为了改变与fcγr受体的 结合。如本文所用的“fcγ受体”、“fcγr”或“fcγr”意指结合igg抗体fc区并且由fcγr 基因编码的蛋白质家族的任何成员。在人类中，这个家族包括(但不限于)fcγri(cd64)， 包括同工型fcγria、fcγrib和fcγric；fcγrii(cd32)，包括同工型fcγriia(包括同 种异型h131和r131)、fcγriib(包括fcγriib-1和fcγriib-2)和fcγriic；以及fcγriii (cd16)，包括同工型fcγriiia(包括同种异型v158和f158)和fcγriiib(包括同种异 型fcγriiib-na1和fcγriiib-na2)(jefferis等人,2002,《免疫学快报(immunol lett)》 82:57-65，通过引用完全并入本文中)，以及任何未发现的人类fcγr或fcγr同工型或同 种异型。fcγr可以来自任何生物体，包括(但不限于)人类、小鼠、大鼠、兔和猴。小 鼠fcγr包括(但不限于)fcγri(cd64)、fcγrii(cd32)、fcγriii-1(cd16)和fcγriii-2 (cd16-2)以及任何未发现的小鼠fcγr或fcγr同工型或同种异型。
[0178]
存在许多可被用来改变与fcγr受体中的一个或多个的结合的适用fc取代。引起结 合增强以及结合减弱的取代都可能是有用的。举例来说，众所周知，与fcγriiia的结合 增强通常引起增强的adcc(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；细胞介导的反应，其中 表达fcγr的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上所结合的抗体并且随后引起靶细胞溶 解)。类似地，在一些情况下，与fcγriib的结合减弱(抑制性受体)也可能是有利的。 适用于本发明的氨基酸取代包括美国系列号11/124,620(尤其是图41)和第6,737,056 号美国专利中列出的那些，两个专利均明确地以全文引用的方式并并入本文中，并且尤 其是关于其中所公开的变异体。适用的特定变异体包括(但不限于)236a、239d、239e、 332e、332d、239d/332e、267d、267e、328f、267e/328f、236a/332e、239d/332e/330y、 239d、332e/330l、299t以及297n。
[0179]
另外，本发明抗体经过修饰以增加其生物半衰期。各种途径都是可能的。举例来说， 可以引入以下突变中的一种或多种：t252l、t254s、t256f，如ward的第6,277,375号 美国专利中所述。或者，为了增加生物半衰期，可以在c
h1
或c
l
区内改变抗体以含有 从igg的fc区的ch2结构域的两个环获得的挽救受体结合表位，如presta等人的第 5,869,046号和第
6,121,022号美国专利中所述。用于增加血清半衰期的额外突变公开于 第8,883,973号、第6,737,056号和第7,371,826号美国专利中，并且包括428l、434a、 434s和428l/434s。
[0180]
在其它实施例中，通过将至少一个氨基酸残基更换为不同的氨基酸残基来改变fc 区，从而改变抗体的效应子功能。举例来说，可以将一个或多个选自氨基酸残基234、 235、236、237、297、318、320和322的氨基酸替换为不同的氨基酸残基，以使得抗体 对效应配体的亲和力改变，但是保留亲本抗体的抗原结合能力。亲和力改变了的效应配 体可以是例如补体的fc受体或c1组分。这种途径进一步详细描述在winter等人的第 5,624,821号和第5,648,260号美国专利中。
[0181]
在另一个实例中，可以将一个或多个选自氨基酸残基329、331和322的氨基酸替 换为不同的氨基酸残基，以使得抗体具有改变了的c1q结合和/或降低或消除补体依赖 性细胞毒性(cdc)。这种途径进一步详细描述于idusogie等人的第6,194,551号美国专 利中。
[0182]
在另一个实例中，改变氨基酸位置231和239内的一个或多个氨基酸残基，从而改 变抗体固定补体的能力。这种途径进一步描述在bodmer等人的pct公开wo 94/29351 中。
[0183]
在又另一个实例中，通过修饰以下位置处的一个或多个氨基酸来修饰fc区以提高 抗体介导抗体依赖性细胞毒性(adcc)的能力和/或提高抗体对fcγ受体的亲和力：238、 239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、 278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、 305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、 335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、 430、434、435、437、438或439。这种途径进一步描述在presta的pct公开wo 00/42072 中。此外，人类igg1上关于fcγri、fcγrii、fcγriii和fcrn的结合位点已经映射并且 具有改良结合的变异体已有描述(参见shields,r.l.等人(2001)《生物化学杂志(j.biol. chem.)》276:6591-6604)。在位置256、290、298、333、334和339处的特异性突变显 示可改良与fcyriii的结合。另外，以下组合突变体显示可改良fcγriii结合： t256a/s298a、s298a/e333a、s298a/k224a和s298a/e333a/k334a。此外，如m252y/s254t/t256e或m428l/n434s等突变改良了与fcrn的结合并且增加了抗体循 环半衰期(参见chan ca和carter pj(2010)《自然综述免疫学(nature rev immunol)》 10:301-316)。
[0184]
在另一个实施例中，抗体可以经过修饰以消除体内fab臂交换。具体来说，这个过 程涉及igg4半分子(一条重链加一条轻链)在其它igg4抗体之间的交换，这种交换可 有效地产生功能上单价的双特异性抗体。重链的铰链区和恒定结构域的突变可以消除这 种交换(参见aalberse,rc,schuurman j.,2002,《免疫学(immunology)》105:9-19)。
[0185]
在另一个实施例中，抗体的糖基化经过修饰。举例来说，可以制得无糖基化抗体(即， 抗体缺乏糖基化)。可以改变糖基化来例如提高抗体对抗原的亲和力或降低效应子功能， 如adcc。这类碳水化合物修饰可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点 来实现，例如n297。举例来说，可以进行一个或多个氨基酸取代，促使一个或多个可 变区框架糖基化位点得以消除，从而消除所述位点处的糖基化。
[0186]
另外地或可替代地，可以将抗体制成具有改变的糖基化类型，如岩藻糖基残基量减 少的低岩藻糖基化抗体或平分型glcnac结构增加的抗体。已经表明这种改变的糖基化 模式会提高抗体的adcc能力。这种碳水化合物修饰可以通过例如在具有改变的糖基化 机制的宿主细胞中表达抗体来实现。具有改变的糖基化机制的细胞在本领域中已有描述 并
且可以用作宿主细胞，在所述宿主细胞中表达根据本发明的至少一些实施例的重组抗 体，从而产生具有改变的糖基化的抗体。举例来说，细胞系ms704、ms705和ms709 缺乏岩藻糖基转移酶基因fut8(α(1,6)岩藻糖基转移酶)，使得在ms704、ms705和ms709 细胞系中表达的抗体在其碳水化合物上缺乏岩藻糖。ms704、ms705和ms709 fut8细 胞系通过使用两个置换载体通过fut8基因在cho/dg44细胞中的靶向破坏而产生(参 见yamane等人的第20040110704号美国专利公开和yamane-ohnuki等人(2004)《生物 技术与生物工程(biotechnol bioeng)》87:614-22)。作为另一个例子，hanai等人的ep 1,176,195描述了一种具有功能被破坏的fut8基因的细胞系，它编码岩藻糖基转移酶， 使得在这类细胞系中表达的抗体通过减少或消除α1,6键相关酶而展现低岩藻糖基化。 hanai等人还描述了关于向结合到抗体的fc区的n-乙酰葡糖胺中添加岩藻糖具有低酶 活性或不具有酶活性的细胞系，例如大鼠骨髓瘤细胞系yb2/0(atcc crl 1662)。presta 的pct公开wo 03/035835描述了一种变异cho细胞系lec13细胞，它将岩藻糖连接 到asn(297)连接的碳水化合物上的能力降低，还导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩 藻糖基化(也参见shields,r.l.等人(2002)《生物化学杂志》277:26733-26740)。umana 等人的pct公开wo 99/54342描述了经过工程改造以表达糖蛋白修饰的糖基转移酶(例 如β(1,4)-n-乙酰葡糖胺基转移酶iii(gntiii))的细胞系，以使得在经过工程改造的细 胞系中表达的抗体展现增加的平分型glcnac结构，这使得抗体的adcc活性增加(也 参见umana等人(1999)《自然
·
生物技术(nat.biotech.)》17:176-180)。或者，可以使 用岩藻糖苷酶裂解掉抗体的岩藻糖残基。举例来说，岩藻糖苷酶α-l-岩藻糖苷酶从抗体 中去除岩藻糖基残基(tarentino,a.l.等人(1975)《生物化学(biochem.)》14:5516-23)。
[0187]
在本文中本发明所设想的另一种抗体修饰是聚乙二醇化或添加其它水溶性部分，典 型地聚合物，例如为了增强半衰期。可以使抗体聚乙二醇化，以例如提高抗体的生物(例 如，血清)半衰期。为了使抗体聚乙二醇化，抗体或其片段典型地与聚乙二醇(peg) (如peg的反应性酯或醛衍生物)在一个或多个peg基团能连接到抗体或抗体片段上的 条件下反应。优选地，通过与反应性peg分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化 反应或烷基化反应进行聚乙二醇化。如本文所用，术语“聚乙二醇”打算涵盖已被用于衍 生其它蛋白质的peg形式中的任一种，如单(c
1-c
10
)烷氧基或芳氧基聚乙二醇或聚乙二 醇-顺丁烯二酰亚胺。在某些实施例中，待聚乙二醇化的抗体是无糖基化抗体。使蛋白质 聚乙二醇化的方法是本领域中已知的并且可应用于根据本发明的至少一些实施例的抗 体。参见例如nishimura等人的ep 0 154 316和ishikawa等人的ep 0 401 384。
[0188]
除了为了改变与fcγr和/或fcrn的结合亲和力和/或提高体内血清半衰期所做的取 代之外，可以进行额外的抗体修饰，如下文进一步详细描述。
[0189]
在一些情况下，进行亲和力成熟。在cdr中的氨基酸修饰有时称为“亲和力成熟”。
ꢀ“
亲和力成熟的”抗体是在一个或多个cdr中具有一种或多种改变的抗体，所述改变促 使抗体对抗原的亲和力相比于不具有那些改变的亲本抗体来说改良。在一些情况下，虽 然罕见，但是可能需要降低抗体对其抗原的亲和力，但这一般不是优选的。
[0190]
在一些实施例中，在本发明的visg1抗体的一个或多个cdr中进行一个或多个氨 基酸修饰。一般来说，任何单一cdr中仅1或2或3个氨基酸被取代，并且在一组cdr 内一般做出不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个改变。然而，应了解，任何cdr 中的无取代、1个取代、2
个取代或3个取代的任意组合可以独立地并且任选地与任何 其它取代组合。
[0191]
可以进行亲和力成熟以使抗体对pvrig抗原的结合亲和力相比于“亲本”抗体提高 至少约10％到50-100-150％或更多，或1到5倍。优选的亲和力成熟的抗体对pvrig抗 原将具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。亲和力成熟的抗体通过已知程序产生。参见例 如marks等人,1992,《生物技术(biotechnology)》10:779-783，其描述了通过可变重 链(vh)和可变轻链(vl)结构域改组实现的亲和力成熟。以下文献中描述了cdr和/或框架残基的随机突变诱发：例如barbas等人1994,《美国国家科学院院刊》 91:3809-3813；shier等人,1995,《基因(gene)》169:147-155；yelton等人,1995,《免 疫学杂志(j.immunol.)》155:1994-2004；jackson等人,1995,《免疫学杂志》 154(7):3310-9；以及hawkins等人,1992,《分子生物学杂志》226:889-896。
[0192]
或者，可以在本发明抗体的一个或多个cdr中进行“沉默的(silent)”氨基酸修饰， 例如不显著改变抗体对抗原的亲和力。这么做的原因有很多，包括优化表达(如可以对 编码本发明抗体的核酸进行)。
[0193]
因此，在本发明抗体的cdr的定义内包括变异的cdr和抗体；也就是说，本发明 抗体可以在所列举的本发明抗体的一个或多个cdr中包括氨基酸修饰。另外，如下文 所概述，氨基酸修饰还能够独立地并且任选地在cdr外部的任何区域中进行，包括框 架区和恒定区。
[0194]
iv.pvrig抗体
[0195]
本发明提供抗pvrig抗体。(为方便起见，“抗pvrig抗体”和“pvrig抗体”可互 换使用)。本发明的抗pvrig抗体特异性结合到人类pvrig，并且优选是人类visg1 的ecd，如图25中所描绘。
[0196]
可以例如通过抗体具有至少约10-4
m、至少约10-5
m、至少约10-6
m、至少约10-7
m、 至少约10-8
m、至少约10-9
m、或者至少约10-10
m、至少约10-11
m、至少约10-12
m或 更大的kd来展现对pvrig或pvrig表位的特异性结合，其中kd是指特定的抗体
‑ꢀ
抗原相互作用的解离速率。典型地，特异性结合抗原的抗体对于对照分子的kd比pvrig 抗原或表位大20、50、100、500、1000、5,000、10,000或更多倍。
[0197]
然而，如实例中所示，为了与在nk和t细胞的表面上表达的pvrig的最佳结合， 抗体优选具有小于50nm并且最优选小于1nm的kd，其中小于0.1nm和小于1pm 和0.1pm适用于本发明方法中。
[0198]
此外，可以例如通过抗体对pvrig抗原或表位的ka或ka对于表位比对于对照大 至少20、50、100、500、1000、5,000、10,000或更多倍来展现对特定抗原或表位的特 异性结合，其中ka或ka是指特定的抗体-抗原相互作用的结合速率。
[0199]
在一些实施例中，本发明的抗pvrig抗体以100nm或更小、50nm或更小、10nm 或更小、或1nm或更小(即，更高的结合亲和力)或1pm或更小的kd结合到人类pvrig， 其中kd通过已知方法测定，例如表面等离子共振(spr，例如biacore分析)、elisa、 kinexa，并且最典型地是在25℃或37℃下的spr。
[0200]
a.特异性抗pvrig抗体
[0201]
本发明提供抗原结合结构域，包括全长抗体，其含有所列举的多组特定cdr，每组 6个cdr。
[0202]
本文中所述的抗体如下进行标记。抗体具有参考标号，例如“cpa.7.013”。这表示可 变重链和可变轻链的组合，如例如图38和图39中所描绘。“cpa.7.013.vh”是指 cpa.7.013的可变重链部分，而“cpa.7.013.vl”是可变轻链。“cpa.7.013.vhcdr1”、
ꢀ“
cpa.7.013.vhcdr2”、“cpa.7.013.vhcdr3”、“cpa.7.013.vlcdr1”、“cpa.7.013.vlcdr2
”ꢀ
和“cpa.7.013.vlcdr3”是指所指示的cdr。“cpa.7.013.hc”是指这个分子的整条重链(例 如，可变结构域和恒定结构域)，并且“cpa.7.013.lc”是指同一个分子的整条轻轻链(例 如，可变结构域和恒定结构域)。“cpa.7.013.h1”是指包含可变重链和轻链结构域的全长 抗体，包括人类igg1的恒定结构域(因此是h1；igg1、igg2、igg3和igg4序列显示 在图66中)。相应地，“cpa.7.013.h2”将是与人类igg2有关的cpa.7.013可变结构域。
ꢀ“
cpa.7.013.h3”将是与人类igg3有关的cpa.7.013可变结构域，并且“cpa.7.013.h4”将 是与人类igg4有关的cpa.7.013可变结构域。
[0203]
本发明进一步提供可变重链和轻链结构域以及全长重链和轻链。
[0204]
在多个实施例中，本发明抗体是人类抗体(源自噬菌体)并且阻断pvrig和pvlr2 的结合。如图52中所示，结合受体并且阻断受体-配体相互作用的cpa抗体如下，其组 分也概述了：
[0205]
cpa.7.001、cpa.7.001.vh、cpa.7.001.vl、cpa.7.001.hc、cpa.7.001.lc和 cpa.7.001.h1、cpa.7.001.h2、cpa.7.001.h3、cpa.7.001.h4；cpa.7.001.vhcdr1、 cpa.7.001.vhcdr2、cpa.7.001.vhcdr3、cpa.7.001.vlcdr1、cpa.7.001.vlcdr2以及 cpa.7.001.vlcdr3；
[0206]
cpa.7.003、cpa.7.003.vh、cpa.7.003.vl、cpa.7.003.hc、cpa.7.003.lc、 cpa.7.003.h1、cpa.7.003.h2、cpa.7.003.h3、cpa.7.003.h4；cpa.7.003.vhcdr1、 cpa.7.003.vhcdr2、cpa.7.003.vhcdr3、cpa.7.003.vlcdr1、cpa.7.003.vlcdr2以及 cpa.7.003.vlcdr3；
[0207]
cpa.7.004、cpa.7.004.vh、cpa.7.004.vl、cpa.7.004.hc、cpa.7.004.lc、 cpa.7.004.h1、cpa.7.004.h2、cpa.7.004.h3、cpa.7.004.h4；cpa.7.004.vhcdr1、 cpa.7.004.vhcdr2、cpa.7.004.vhcdr3、cpa.7.004.vlcdr1、cpa.7.004.vlcdr2以及 cpa.7.004.vlcdr3；
[0208]
cpa.7.006、cpa.7.006.vh、cpa.7.006.vl、cpa.7.006.hc、cpa.7.006.lc、 cpa.7.006.h1、cpa.7.006.h2、cpa.7.006.h3、cpa.7.006.h4；cpa.7.006.vhcdr1、cpa.7.006.vhcdr2、cpa.7.006.vhcdr3、cpa.7.006.vlcdr1、cpa.7.006.vlcdr2以及 cpa.7.006.vlcdr3；
[0209]
cpa.7.008、cpa.7.008.vh、cpa.7.008.vl、cpa.7.008.hc、cpa.7.008.lc、 cpa.7.008.h1、cpa.7.008.h2、cpa.7.008.h3、cpa.7.008.h4；cpa.7.008.vhcdr1、 cpa.7.008.vhcdr2、cpa.7.008.vhcdr3、cpa.7.008.vlcdr1、cpa.7.008.vlcdr2以及 cpa.7.008.vlcdr3；
[0210]
cpa.7.009、cpa.7.009.vh、cpa.7.009.vl、cpa.7.009.hc、cpa.7.009.lc、 cpa.7.009.h1、cpa.7.009.h2、cpa.7.009.h3、cpa.7.009.h4；cpa.7.009.vhcdr1、 cpa.7.009.vhcdr2、cpa.7.009.vhcdr3、cpa.7.009.vlcdr1、cpa.7.009.vlcdr2以及 cpa.7.009.vlcdr3；
cpa.7.045.vlcdr3。
[0241]
如本文所论述，本发明进一步提供以上组分的变异体，包括cdr中的变异体，如 上文所概述。另外，可变重链可以与本文中的“vh”序列具有80％、90％、95％、98％或 99％的同一性，和/或当使用fc变异体时，含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或 更多氨基酸改变。提供这样的可变轻链，其可以与本文中的“vl”序列具有80％、90％、 95％、98％或99％的同一性，和/或当使用fc变异体时，含有1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10个或更多氨基酸改变。类似地，提供这样的重链和轻链，其与本文中的“hc”和“lc
”ꢀ
序列具有80％、90％、95％、98％或99％的同一性，和/或当使用fc变异体时，含有1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多氨基酸改变。
[0242]
此外，本发明提供许多cha抗体，它们是由融合瘤产生的鼠类抗体。如本领域中 众所周知，当放置到人类框架可变重链和可变轻链区中时或当可变重链和轻链结构域被 人源化时，六个cdr是适用的。
[0243]
因此，本发明提供包含以下cha组cdr的抗体，通常是全长或scfv结构域，其 序列显示在图41中：
[0244]
cha.7.502.vhcdr1、cha.7.502.vhcdr2、cha.7.502.vhcdr3、cha.7.502.vlcdr1、 cha.7.502.vlcdr2以及cha.7.502.vlcdr3。
[0245]
cha.7.503.vhcdr1、cha.7.503.vhcdr2、cha.7.503.vhcdr3、cha.7.503.vlcdr1、 cha.7.503.vlcdr2以及cha.7.503.vlcdr3。
[0246]
cha.7.506.vhcdr1、cha.7.506.vhcdr2、cha.7.506.vhcdr3、cha.7.506.vlcdr1、 cha.7.506.vlcdr2以及cha.7.506.vlcdr3。
[0247]
cha.7.508.vhcdr1、cha.7.508.vhcdr2、cha.7.508.vhcdr3、cha.7.508.vlcdr1、 cha.7.508.vlcdr2以及cha.7.508.vlcdr3。
[0248]
cha.7.510.vhcdr1、cha.7.510.vhcdr2、cha.7.510.vhcdr3、cha.7.510.vlcdr1、 cha.7.510.vlcdr2以及cha.7.510.vlcdr3。
[0249]
cha.7.512.vhcdr1、cha.7.512.vhcdr2、cha.7.512.vhcdr3、cha.7.512.vlcdr1、 cha.7.512.vlcdr2以及cha.7.512.vlcdr3。
[0250]
cha.7.514.vhcdr1、cha.7.514.vhcdr2、cha.7.514.vhcdr3、cha.7.514.vlcdr1、 cha.7.514.vlcdr2以及cha.7.514.vlcdr3。
[0251]
cha.7.516.vhcdr1、cha.7.516.vhcdr2、cha.7.516.vhcdr3、cha.7.516.vlcdr1、 cha.7.516.vlcdr2以及cha.7.516.vlcdr3。
[0252]
cha.7.518.vhcdr1、cha.7.518.vhcdr2、cha.7.518.vhcdr3、cha.7.518.vlcdr1、 cha.7.518.vlcdr2以及cha.7.518.vlcdr3。
[0253]
cha.7.520_1.vhcdr1、cha.7.520_1.vhcdr2、cha.7.520_1.vhcdr3、 cha.7.520_1.vlcdr1、cha.7.520_1.vlcdr2以及cha.7.520_1.vlcdr3。
[0254]
cha.7.520_2.vhcdr1、cha.7.520_2.vhcdr2、cha.7.520_2.vhcdr3、 cha.7.520_2.vlcdr1、cha.7.520_2.vlcdr2以及cha.7.520_2.vlcdr3。
[0255]
cha.7.522.vhcdr1、cha.7.522.vhcdr2、cha.7.522.vhcdr3、cha.7.522.vlcdr1、 cha.7.522.vlcdr2以及cha.7.522.vlcdr3。
[0256]
cha.7.524.vhcdr1、cha.7.524.vhcdr2、cha.7.524.vhcdr3、cha.7.524.vlcdr1、 cha.7.524.vlcdr2以及cha.7.524.vlcdr3。
[0257]
cha.7.526.vhcdr1、cha.7.526.vhcdr2、cha.7.526.vhcdr3、cha.7.526.vlcdr1、 cha.7.526.vlcdr2以及cha.7.526.vlcdr3。
[0258]
cha.7.527.vhcdr1、cha.7.527.vhcdr2、cha.7.527.vhcdr3、cha.7.527.vlcdr1、 cha.7.527.vlcdr2以及cha.7.527.vlcdr3。
[0259]
cha.7.528.vhcdr1、cha.7.528.vhcdr2、cha.7.528.vhcdr3、cha.7.528.vlcdr1、 cha.7.528.vlcdr2以及cha.7.528.vlcdr3。
[0260]
cha.7.530.vhcdr1、cha.7.530.vhcdr2、cha.7.530.vhcdr3、cha.7.530.vlcdr1、 cha.7.530.vlcdr2以及cha.7.530.vlcdr3。
[0261]
cha.7.534.vhcdr1、cha.7.534.vhcdr2、cha.7.534.vhcdr3、cha.7.534.vlcdr1、 cha.7.534.vlcdr2以及cha.7.534.vlcdr3。
[0262]
cha.7.535.vhcdr1、cha.7.535.vhcdr2、cha.7.535.vhcdr3、cha.7.535.vlcdr1、 cha.7.535.vlcdr2以及cha.7.535.vlcdr3。
[0263]
cha.7.537.vhcdr1、cha.7.537.vhcdr2、cha.7.537.vhcdr3、cha.7.537.vlcdr1、 cha.7.537.vlcdr2以及cha.7.537.vlcdr3。
[0264]
cha.7.538_1.vhcdr1、cha.7.538_1.vhcdr2、cha.7.538_1.vhcdr3、 cha.7.538_1.vlcdr1、cha.7.538_1.vlcdr2以及cha.7.538_1.vlcdr3。
[0265]
cha.7.538_2.vhcdr1、cha.7.538_2.vhcdr2、cha.7.538_2.vhcdr3、 cha.7.538_2.vlcdr1、cha.7.538_2.vlcdr2以及cha.7.538_2.vlcdr3。
[0266]
cha.7.543.vhcdr1、cha.7.543.vhcdr2、cha.7.543.vhcdr3、cha.7.543.vlcdr1、cha.7.543.vlcdr2以及cha.7.543.vlcdr3。
[0267]
cha.7.544.vhcdr1、cha.7.544.vhcdr2、cha.7.544.vhcdr3、cha.7.544.vlcdr1、 cha.7.544.vlcdr2以及cha.7.544.vlcdr3。
[0268]
cha.7.545.vhcdr1、cha.7.545.vhcdr2、cha.7.545.vhcdr3、cha.7.545.vlcdr1、 cha.7.545.vlcdr2以及cha.7.545.vlcdr3。
[0269]
cha.7.546.vhcdr1、cha.7.546.vhcdr2、cha.7.546.vhcdr3、cha.7.546.vlcdr1、 cha.7.546.vlcdr2以及cha.7.546.vlcdr3。
[0270]
cha.7.547.vhcdr1、cha.7.547.vhcdr2、cha.7.547.vhcdr3、cha.7.547.vlcdr1、 cha.7.547.vlcdr2以及cha.7.547.vlcdr3。
[0271]
cha.7.548.vhcdr1、cha.7.548.vhcdr2、cha.7.548.vhcdr3、cha.7.548.vlcdr1、 cha.7.548.vlcdr2以及cha.7.548.vlcdr3。
[0272]
cha.7.549.vhcdr1、cha.7.549.vhcdr2、cha.7.549.vhcdr3、cha.7.549.vlcdr1、 cha.7.549.vlcdr2以及cha.7.549.vlcdr3。
[0273]
cha.7.550.vhcdr1、cha.7.550.vhcdr2、cha.7.550.vhcdr3、cha.7.550.vlcdr1、 cha.7.550.vlcdr2以及cha.7.550.vlcdr3。
[0274]
如上，这几组cdr还可以是如上文所述的氨基酸变异体。
[0275]
另外，可变重链和可变轻链的框架区可以如本领域中已知般进行人源化(视需要采 用cdr中产生的偶然变异体)，并且因此可以产生图41的vh和vl链的人源化变异体。 此外，人源化可变重链和轻链结构域可以接着与人类恒定区融合，如来自igg1、igg2、 igg3和igg4的恒定区。
[0276]
具体来说，如本领域中已知，鼠类vh和vl链可以如本领域中已知般进行人源化， 例如使用ncbi网站的igblast程序，如ye等人《核酸研究(nucleic acids res.)》 41:w34-w40(2013)中所概述，所述文献关于人源化方法以全文引用的方式并入本文中。 igblast采用鼠类vh和/或vl序列并且将其与已知的人类生殖系序列库进行比较。如 本文中所示，关于在本文中产生的人源化序列，所用的数据库是imgt人类vh基因 (f+orf，273个生殖系序列)和imgt人类vlκ基因(f+orf，74个生殖系序列)。 选择五个示例性cha序列：cha.7.518、cha.7.530、cha.7.538_1、cha.7.538_2以及 cha.7.524(关于vh和vl序列，参见图41)。关于人源化的这个实施例，5个全都选 择人类生殖系ighv1-46(等位基因1)作为接受体序列并且选择人类重链ighj4(等位 基因1)连接区(j基因)。关于四个(cha.7.518、cha.7.530、cha.7.538_1和cha.7.538_2) 中的三个，选择人类生殖系igkv1-39(等位基因1)作为接受体序列并且选择人类轻链igkj2(等位基因1)(j基因)。j基因选自在国际immunogenetics信息系统 www.imgt.org下汇编的人类连接区序列。cdr根据abm定义下定义(参见 www.bioinfo.org.uk/abs/)。图88描绘了人源化序列以及用于优化与pvrig的结合的一 些潜在改变。
[0277]
cha抗体的特异性人源化抗体包括图88、图89和图90中所示的那些。如本领域 的普通技术人员将了解，每个人源化可变重链(人源化重链；hh)和可变轻链(人源 化轻链；hl)序列可以与人类igg1、igg2、igg3和igg4的恒定区组合。也就是说， cha.7.518.hh1是第一人源化可变重链，并且cha.7.518.hh1.1是全长重链，包含具有 igg1恒定区的“hh1”人源化序列(cha.7.518.hh1.2是具有igg2的cha.7.518.hh1等)。
[0278]
在一些实施例中，本发明的抗pvrig抗体包括这样的抗pvrig抗体，其中不同的 抗pvrig抗体的vh和v
l
序列可以“混合和匹配”以产生其它抗pvrig抗体。这类经过
ꢀ“
混合和匹配”的抗体的pvrig结合可以使用以上所述的结合分析来测试，例如elisa。 在一些实施例中，当vh和v
l
链经过混合和匹配时，来自特定vh/v
l
配对的vh序列被 结构上类似的vh序列替换。同样地，在一些实施例中，来自特定vh/v
l
配对的v
l
序列 被结构上类似的v
l
序列替换。举例来说，同源抗体的vh和v
l
序列尤其适合进行混合 和匹配。
[0279]
因此，本发明抗体包含选自以下组成的组的cdr氨基酸序列：(a)如本文中所列 的序列；(b)与(a)中所指定的那些cdr氨基酸序列相差1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10个或更多氨基酸取代的序列；(c)与(a)或(b)中所指定的序列具有90％或更 大、95％或更大、98％或更大、或99％或更大的序列同一性的氨基酸序列；(d)具有由 某种多核苷酸编码的氨基酸序列的多肽，所述多核苷酸具有编码本文中所列的氨基酸的 核酸序列。
[0280]
在pvrig抗体的定义中另外包括与本文中所列举的pvrig抗体共有同一性的抗 体。也就是说，在某些实施例中，根据本发明的抗pvrig抗体包含重链和轻链可变区， 所述重链和轻链可变区分别包含与优选的抗pvrig免疫分子的分离后的抗pvrig氨基 酸序列同源的氨基酸序列，其中抗体保留亲本抗pvrig抗体的所期望的功能特性。两 个序列之间的同一性百分比是序列所共有的相同位置的数量的函数(即，同源性％＝相 同位置的数量/位置的总数
×
100)，考虑到空位的数量和每个空位的长度，需要引入这 两个来进行两个序列的最佳比对。如下文非限制性实例中所述，两个序列之间的序列比 较和同一性百分比的测定可以使用数学算法实现。
[0281]
两个氨基酸序列之间的同一性百分比可以使用已并入到align程序(2.0版)中的
产生针对人类pvrig的额外抗体。因此，可以通过传统方法产生额外抗pvrig抗体， 如对小鼠进行免疫(有时使用dna免疫接种，例如aldevron所用的)，接着针对人类 pvrig蛋白质和融合瘤产生进行筛选，进行抗体纯化和回收。
[0291]
v.核酸组合物
[0292]
还提供了编码本发明的抗pvrig抗体的核酸组合物，以及含有核酸的表达载体和 经过核酸和/或表达载体组合物转化的宿主细胞。如本领域的普通技术人员将了解，因为 遗传密码的简并，所以本文中描绘的蛋白质序列可以由任何数量的可能的核酸序列编 码。
[0293]
编码pvrig抗体的核酸组合物将取决于抗体的形式。传统上，含有两条重链和两 条轻链的四聚抗体由两个不同核酸编码，一个编码重链并且一个编码轻链。可以将这些 抗体放到单一表达载体或两个表达载体中，如本领域中已知，转化到宿主细胞中，在宿 主细胞中，它们表达形成本发明的抗体。在一些实施例中，例如当使用scfv构建体时， 一般使用编码可变重链-连接子-可变轻链的单一核酸，其可以插入到表达载体中以便转 化到宿主细胞中。可以将核酸放到含有恰当的转录和翻译控制序列的表达载体中，转录 和翻译控制序列包括(但不限于)信号和分泌序列、调控序列、启动子、复制起点、选 择基因等。
[0294]
用于表达根据本发明的至少一些实施例的重组抗体的优选的哺乳动物宿主细胞包 括中国仓鼠卵巢(cho细胞)、per.c6、hek293以及如本领域中已知的其它细胞。
[0295]
核酸可存在于全细胞中、细胞溶解产物中、或采用经过部分纯化的或基本上纯的形 式。核酸在通过标准技术纯化去掉其它细胞组分或其它污染物(例如其它细胞核酸或蛋 白质)时得以“分离”或“变成基本上纯的”，标准技术包括碱/sds处理、cscl分带(csclbanding)、柱谱、琼脂糖凝胶电泳以及本领域中众所周知的其它技术。
[0296]
为了产生scfv基因，将编码vh和v
l
的dna片段可操作地连接到另一个编码柔性 连接子，例如编码氨基酸序列(gly4-ser)3的片段，以使得vh和v
l
序列可表达为相邻的 单链蛋白质，且v
l
和vh区通过柔性连接子连接(参见例如bird等人(1988)《科学》 242:423-426；huston等人(1988)《美国国家科学院院刊》85:5879-5883；mccafferty 等人,(1990)《自然(nature)》348:552-554)。
[0297]
vi.抗pvrig抗体的配制
[0298]
在实践以上方法时所用的组合物可以配制成包含适合于所期望的递送方法的 载体的药物组合物。合适的载体包括当与组合物组合时保留组合物的抗肿瘤功 能并且一般不与患者的免疫系统反应的任何材料。实例包括(但不限于)许多标准药物 载体中的任一种，如无菌磷酸盐缓冲盐水溶液、抑菌水等等(一般参见《雷明顿的药物 科学(remington's pharmaceutical sciences)》第16版,a.osal.编,1980)。可接受的载体、 赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括缓冲剂，如磷酸盐、 柠檬酸盐、乙酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十 八烷基二甲基苯甲基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵(benzalkonium chloride)；苄索 氯铵(benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基 苯甲酸甲酯或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇以及间甲酚)；低分子量(小于 约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如 聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸； 单糖、双糖以及其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如edta；糖， 如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖
醇；甜味剂和其它调味剂；填料，如微晶纤维素、 乳糖、玉米淀粉和其它淀粉；粘合剂；添加剂；着剂；成盐抗衡离子，如钠；金属络 合物(例如，zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如tween.tm.、 pluronics.tm.或聚乙二醇(peg)。
[0299]
在一个优选实施例中，包含本发明抗体的药物组合物可以呈水溶性形式，如作为药 学上可接受的盐存在，这意味着包括酸加成盐和碱加成盐。“药学上可接受的酸加成盐
”ꢀ
是指保留了自由基质的生物有效性并且在生物学上或其它方面没有不合需要的那些盐， 用无机酸和有机酸形成，无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等等，有机酸如乙 酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、顺丁烯二酸、丙二酸、丁二酸、反丁烯二酸、酒石 酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、杏仁酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等等。
ꢀ“
药学上可接受的碱加成盐”包括衍生自无机碱的盐，如钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、 镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐等等。特别优选的是铵盐、钾盐、钠盐、钙盐以 及镁盐。衍生自药学上可接受的有机无毒碱的盐包括以下的盐：伯胺、仲胺和叔胺；取 代胺，包括天然产生的取代胺；环胺；以及碱性离子交换树脂，如异丙胺、三甲胺、二 乙胺、三乙胺、三丙胺和乙醇胺。体内投药所用的配制品优选地是无菌的。这通过用无 菌滤膜过滤或其它方法很容易实现。
[0300]
优选呈无菌水溶液形式的、包含本发明抗体的药物组合物的投予可以通过多种方式 进行，包括(但不限于)皮下和静脉内。在一些情况下皮下投药可能是优选的，因为患 者可以自行服用药物组合物。许多蛋白质疗法的药效还不足以允许在可接受的最大体积 中配制有效剂量进行皮下投药。这个问题在某种程度上可以通过使用包含精氨酸盐 酸盐、组氨酸和聚山梨醇酯的蛋白质配制品来解决(参见wo 04091658)。本发明的fc 多肽因为例如效力增加、血清半衰期改良或溶解度增强，所以可能更适合皮下投药。
[0301]
如本领域中已知，蛋白质疗法通常通过iv输注或药团递送。本发明的抗体也可以 使用这类方法递送。举例来说，投药可以通过静脉，通过静脉内输注0.9％氯化钠作为输 注媒剂。
[0302]
另外，许多递送系统中的任何递送系统在本领域中是已知的并且可以用于投予本发 明的fc变异体。实例包括(但不限于)用脂质体、微颗粒、微球体(例如pla/pga微 球体)等包裹。或者，可以使用多孔的、非多孔的或凝胶状材料的植入物，包括膜或纤 维。缓释系统可以包含聚合物材料或基质，如聚酯、水凝胶、聚(乙烯醇)、聚丙交酯、 l-谷氨酸和乙基-l-谷氨酸盐的共聚物、乙烯-乙酸乙烯酯、乳酸-乙醇酸共聚物，如 lupron depot.rtm.；以及聚-d-(-)-3-。本文中公开的抗体还可以配制为免 疫脂质体。脂质体是包含各种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂的小囊泡，适用于向哺 乳动物递送剂。含有抗体的脂质体通过本领域中已知的方法制备，如以下所述： epstein等人,1985,《美国国家科学院院刊》,82:3688；hwang等人,1980,《美国国家 科学院院刊》,77:4030；第4,485,045号美国专利；第4,544,545号美国专利；以及pctwo 97/38731。具有增强的循环时间的脂质体公开于第5,013,556号美国专利中。脂质体 的组分通常排列成双层形式，类似于生物膜的脂质排列。尤其有用的脂质体可以通过逆 相蒸发法用脂质组合物产生，所述脂质组合物包含磷脂酰胆碱、胆固醇和peg衍生化的 磷脂酰乙醇胺(peg-pe)。将脂质体挤出通过规定孔径的过滤器，得到具有所期望的直 径的脂质体。在脂质体内任选地含有化疗剂或其它活性剂(gabizon等人,1989,《美 国国立癌症研究所杂志(j national cancer inst)》81:1484)。
[0303]
抗体还可以被包埋在通过以下方法制备的微胶囊中，包括(但不限于)凝聚技术、 界面聚合(例如使用羟甲基纤维素或明胶微胶囊或聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶态药 物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)以及粗乳 液。这类技术公开于《雷明顿的药物科学》第16版,osol,a.编,1980中。可以制备缓释 制剂。缓释制剂的合适实例包括固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质呈成型物品 形式，例如膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙 烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(第3,773,919号美国专利)、l-谷氨酸和γ乙基-l-谷 氨酸盐的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如 lupron depot.rtm.(其为由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate) 组成的可注射微球体)、聚d-(-)-3-以及prolease.rtm.(可购自阿尔凯默斯 (alkermes))，这是一种基于微球体的递送系统，由并入到聚-dl-丙交酯-共-乙交酯 (plg)基质中的所期望的生物活性分子组成。
[0304]
在一个优选实施例中，选择或预防有效的给药量和投药频率。如本领域中已知， 可能需要针对蛋白质降解、全身性对比局部递送和新蛋白酶合成速率以及年龄、体重、 总体健康、性别、饮食、投药时间、药物相互作用和病况的严重程度做出调整，并且这 些调整将由本领域中的普通技术人员通过常规实验来确定。
[0305]
配制品中的抗体的浓度可以在约0.1到100重量％的范围内变化。在一个优选实施 例中，fc变异体的浓度在0.003到1.0摩尔(molar)的范围内。为了患者，可以投 予有效剂量的本发明的fc变异体。“有效剂量”在本文中意指对被投药者产生 作用的剂量。准确剂量将取决于目的，并且将由本领域中的普通技术人员使用已知 技术确定。剂量可以在每千克体重0.0001到100mg或更大的范围内，例如每千克体重 0.1、1、10或50mg，其中1到10mg/kg是优选的。
[0306]
vii.抗pvrig抗体的使用方法
[0307]
一旦制成，本发明的抗pvrig抗体就可用于许多不同应用中。
[0308]
a.性用途
[0309]
本发明的抗pvrig抗体可用于患者，如一般具有与pvrig相关的病况的人类 受试者。如本文所用的术语“”是指性和防治性或预防性措施，在此实例中 是指癌症的；然而，此外如下所述，还提供了使用抗体和药物组合物来传染病、 脓毒症和/或自身免疫病况，和/或抑制在基因疗法后不合需要的免疫激活。需要的 受试者包括已经患有癌症的受试者以及要预防癌症的受试者。因此，在本文中待的 哺乳动物可能已被诊断为患有癌症或可能倾向于或易患癌症。如本文所用，术语“
”ꢀ
是指对上述癌性疾病、病症或病况进行预防、延迟其发作、将其治愈、使其逆转、使其 减弱、使其减轻、使其降到最低、对其进行抑制、中断其有害影响或使其可辨别的症状 稳定。还包括管理如上所述的癌症。“管理”意指降低疾病的严重程度、降低疾病的 发作频率、缩短这类发作的持续时间、降低这类发作的严重程度、减缓/减少癌细胞生长 或增殖、减缓至少一种症状的进程、改善至少一个可测量的身体参数等。举例来说，免 疫刺激性抗pvrig免疫分子应该促进t细胞或nk或细胞因子对靶细胞的免疫力，靶 细胞例如癌细胞、被感染细胞或病原体细胞，并且从而通过耗尽疾病病况中所涉及的细 胞来癌症或传染病。反之，免疫抑制性抗pvrig免疫分子应该降低t细胞或nk 活性和/或减少一些免疫疾病的疾病病理学中
瘤、胚细胞瘤、肉瘤以及白血病。这类癌症的更具体实例包括鳞状细胞癌、肺癌(包括 小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric/stomachcancer)(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、 肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌 (kidney/renal cancer)、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌和各种类型的头颈癌、 以及b细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤(non-hodgkin's lymphoma； nhl)；小淋巴细胞性(sl)nhl；中级/滤泡性nhl；中级弥漫性nhl；高级免疫母 细胞性nhl；高级成淋巴细胞性nhl；高级小非裂解细胞nhl；肿块性病变nhl；套 细胞淋巴瘤；aids相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症( macroglobulinemia))；慢性淋巴细胞性白血病(cll)；急性成淋巴细胞性白血病(all)； 毛细胞白血病；慢性成骨髓细胞性白血病；多发性骨髓瘤和移植后淋巴组织增生病症 (ptld)。
[0319]
能够用本发明的其它癌症包括(但不限于)癌瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤以 及白血病或淋巴恶性肿瘤。这类癌症的更具体实例包括结肠直肠癌、膀胱癌、卵巢癌、 黑素瘤、鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌)、 腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、 肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液 腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌和各种类型的头颈癌、以及b 细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)；小淋巴细胞性(sl)nhl； 中级/滤泡性nhl；中级弥漫性nhl；高级免疫母细胞性nhl；高级成淋巴细胞性nhl； 高级小非裂解细胞nhl；肿块性病变nhl；套细胞淋巴瘤；aids相关淋巴瘤；和瓦尔 登斯特伦巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞性白血病(cll)；急性成淋巴细胞性白血病 (all)；毛细胞白血病；慢性成骨髓细胞性白血病；和移植后淋巴组织增生病症(ptld)， 以及与母斑病(phakomatoses)相关的的异常血管增生、水肿(如与脑肿瘤相关的的水 肿)和梅格斯综合征(meigs'syndrome)。优选地，癌症选自以下组成的组：结肠直肠癌、 乳腺癌、直肠癌、非小细胞肺癌、非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)、肾细胞癌、前列腺癌、 肝癌、胰腺癌、软组织肉瘤、卡波西肉瘤(kaposi's sarcoma)、类癌样癌、头颈癌、黑 素瘤、卵巢癌、间皮瘤以及多发性骨髓瘤。在一个示例性实施例中，癌症是早期或晚期 (包括转移性)膀胱癌、卵巢癌或黑素瘤。在另一个实施例中，癌症是结肠直肠癌。能 够用本发明的癌性病况包括表达或不表达pvrig的癌症并且进一步包括非转移性 或非浸润性以及浸润性或转移性癌症，其中免疫细胞、基质细胞或发生病变的细胞的 pvrig表达抑制抗肿瘤反应和抗浸润性免疫反应。本发明方法尤其适合于血管化肿 瘤。
[0320]
如实例中所示，pvrig在各种来源的许多不同肿瘤中过表达和/或与肿瘤淋巴细胞 浸润相关(如通过与cd3、cd4、cd8和pd-1表达的相关性所展示)，并且因此适用于 任何癌症，包括(但不限于)前列腺癌、肝癌(hcc)、结肠直肠癌、卵巢癌、子 宫内膜癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、子宫颈癌、头颈癌、甲状腺癌、睾丸癌、泌尿道上 皮癌、肺癌、黑素瘤、非黑素瘤皮肤癌(鳞状细胞癌和基底细胞癌)、神经胶质瘤、肾 癌(rcc)、淋巴瘤(非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)和霍奇金氏淋巴瘤(hd))、急性骨髓 性白血病(aml)、t细胞急性成淋巴细胞性白血病(t-all)、弥漫性大b细胞淋巴瘤、 睾丸生殖细胞肿瘤、间皮瘤以及食道癌。
[0321]“癌症疗法”在本文中是指任何预防或癌症或改善一种或多种癌症症状的方法。 典型地，这类疗法将包含单独投予或与化疗或放疗或其它生物制剂和用于增强其活性
组 合投予免疫刺激性抗pvrig抗体(包括抗原结合片段)，即在pvrig的表达抑制抗肿 瘤反应和化疗或放疗的功效或生物功效的个体中投予。
[0322]
2.癌症组合疗法
[0323]
如本领域中已知，包含靶向免疫疗法靶标的抗体和对疾病病况具有特异性的额 外剂的组合疗法正展现出巨大的前景。举例来说，在免疫疗法领域中，使用化疗剂 (小分子药物或抗肿瘤抗体)与如抗pd-1的免疫肿瘤学抗体存在许多有前景的组合疗法， 并且因此，本文中所概述的抗pvrig抗体可以按相同的方式被取代。可以根据本发明 使用任何展现抗癌活性的化疗剂；说明书中描述了各种非限制性实例。
[0324]
组合疗法的功效显著增加的潜在科学原理主张，只有当预先存在待“释放”的强的抗 肿瘤免疫反应时，当通路被阻断时，作为单一疗法的免疫检查点阻断才会诱导肿瘤消退。 然而，在大多数患者和肿瘤类型中，内源性抗肿瘤免疫反应较弱，并且因此抗肿瘤免疫 力的诱导需要有效阻断免疫检查点，如图1中所示。根据本发明的至少一些实施例，在 癌症免疫疗法中使用pvrig特异性抗体、抗体片段、结合物和包含其的组合物按组合 疗法所有类型的癌症。
[0325]
术语“与
……
组合”和“共投予”不限于所述预防剂或剂精确地同时投予。相反， 其意指抗pvrig抗体和其它药剂按顺序并且在时间间隔内投予，以使得它们可以共同 起作用，得到的益处比仅用本发明的抗pvrig抗体或仅用其它药剂的大。抗pvrig 抗体和其它药剂叠加地起作用是优选的，并且它们协同地起作用是尤其优选的。这类分 子适当地按针对既定目的的有效量以组合形式存在。有经验的开业医生能够凭经验或通 过考虑药剂的药物动力学和作用模式来确定每种剂的合适剂量以及合适的投药时 间安排和方法。
[0326]
因此，本发明抗体可以与一种或多种其它方案或药剂同时投予。额外的方 案或药剂可以用于改良抗pvrig抗体的功效或安全性。此外，额外的方案或药剂 可以用于相同的疾病或共病(comorbidity)，而不是用于改变pvrig抗体的作用。 举例来说，本发明的pvrig抗体可以与化疗、放疗或化疗和放疗一起投予给患者。
[0327]
本发明的pvrig抗体可以与一种或多种其它的预防剂或剂组合投予，包括(但 不限于)细胞毒性剂、化疗剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂、激酶抑制剂、抗血 管生成剂、心脏保护剂、免疫刺激剂、免疫抑制剂、促进血液细胞增殖的药剂、血管生 成抑制剂、蛋白质酪氨酸激酶(ptk)抑制剂或其它剂。
[0328]
根据至少一些实施例，抗pvrig免疫分子可以与本领域中已知的任何癌症护 理标准(如可见于例如http://www.cancer.gov/cancertopics)组合使用。
[0329]
举例来说，如本文所述，组合疗法可以包括抗pvrig抗体与至少一种其它剂 或免疫调节剂、其它化合物或免疫疗法或免疫刺激性策略的组合，包括(但不限于)肿 瘤疫苗；过继性t细胞疗法；treg耗竭；抗体(例如，贝伐单抗(bevacizumab)、爱必 妥(erbitux))；肽；肽体；小分子；化疗剂，如细胞毒性剂和细胞抑制剂(例如，紫杉 醇(paclitaxel)、顺铂(cisplatin)、长春瑞滨(vinorelbine)、多西他赛(docetaxel)、吉 西他滨(gemcitabine)、替莫唑胺(temozolomide)、伊立替康(irinotecan)、5fu、卡铂 (carboplatin))；免疫修饰剂，如干扰素和白介素；免疫刺激性抗体；生长激素或其它细 胞因子；叶酸；维生素；矿物质；芳香酶抑制剂；rnai；组蛋白去乙酰化酶抑制剂；蛋 白酶体抑
(trabedersen)、ly2157299、ly210976；阻断treg募集到肿瘤组织，包括趋化因子受体 抑制剂，如ccr4/ccl2/ccl22通路。
[0337]
在一些实施例中，抗pvrig抗体与以下所述的用于抑制免疫抑制性肿瘤微环境的 任何选项组合使用，包括发挥免疫抑制活性的细胞因子和酶的抑制剂，如ido(吲哚胺
ꢀ‑
2,3-双加氧酶)抑制剂；促进免疫抑制微环境的抗炎性细胞因子的抑制剂，如il-10、 il-35、il-4和il-13；其减少treg并且有利于dc分化。
[0338]
在一些实施例中，抗pvrig抗体与以下所述的用于靶向mdsc(骨髓来源的抑制 性细胞)的任何选项组合使用，包括通过维生素d3或维生素a代谢物(如视黄酸、全 反式视黄酸(atra))促进其分化成不具有抑制功能的成熟骨髓细胞；通过cox2抑制 剂、磷酸二酯酶5抑制剂(如西地那非(sildenafil))、ros抑制剂(如硝基阿司匹林 (nitroaspirin))抑制mdsc抑制活性。
[0339]
在一些实施例中，抗pvrig抗体与免疫刺激性抗体或其它增强抗肿瘤免疫反应的 药剂组合使用(pardoll《实验医学杂志(j exp med.)》2012；209(2):201-209)。免疫 刺激性抗体通过直接调节免疫功能，即阻断其它抑制性靶标或增强免疫刺激性蛋白质， 促进抗肿瘤免疫。根据本发明的至少一些实施例，用于癌症免疫疗法的抗pvrig免疫 分子与靶向额外的免疫检查点的拮抗性抗体组合使用，所述拮抗性抗体包括抗ctla4 mab，如伊匹单抗、曲美单抗(tremelimumab)；抗pd-1，如纳武单抗(nivolumab) bms-936558/mdx-1106/ono-4538、amp224、ct-011、mk-3475；抗pdl-1拮抗剂， 如bms-936559/mdx-1105、medi4736、rg-7446/mpdl3280a；抗lag-3，如imp-321； 抗tim-3；抗btla；抗b7-h4；抗b7-h3；抗vista；靶向免疫刺激性蛋白质的激动 性抗体，包括抗cd40 mab，如cp-870,893、鲁卡木单抗(lucatumumab)、达西珠单抗 (dacetuzumab)；抗cd137 mab，如bms-663513乌瑞鲁单抗(urelumab)、pf-05082566； 抗ox40 mab，如抗ox40；抗gitr mab，如trx518；抗cd27 mab，如cdx-1127； 以及抗icos mab。
[0340]
在一些实施例中，抗pvrig抗体与细胞因子组合使用。许多细胞因子正作为用于 癌症免疫疗法的增强抗肿瘤免疫反应的药剂处于临床前或临床研发阶段，尤其包括： il-2、il-7、il-12、il-15、il-17、il-18和il-21、il-23、il-27、gm-csf、ifnα(干 扰素α)、ifnβ和ifnγ。然而，功效通常由于严重的副作用和不良的药物动力学特 性而受到阻碍。因此，除了全身性投予细胞因子之外，为了改良其药物动力学以及其功 效和/或毒性，可以采用各种策略来递送性细胞因子和其在肿瘤位点的定位，包括抗 体-细胞因子融合分子(免疫细胞因子)、与聚乙二醇化学结合(聚乙二醇化)、细胞因子 在自体完整肿瘤细胞中的转基因表达、细胞因子基因并入到dna疫苗中、用于递送细 胞因子基因的重组病毒载体等。在免疫细胞因子的情况下，细胞因子与肿瘤特异性抗体 或抗体片段的融合允许定向递送并且因此改良了功效和药物动力学，而且减少了副作 用。
[0341]
在一些实施例中，抗pvrig抗体与癌症疫苗组合使用。性癌症疫苗允许改良t 细胞的致敏和改良抗原呈递，并且可以用作用于增强抗肿瘤免疫反应的剂(mellmani.等人,2011,《自然》,480:22-29；schlom j,2012,《美国国立癌症研究所杂志(j natlcancer inst)》；104:599-613)。
[0342]
若干类型的性癌症疫苗处于临床前和临床研发阶段。这些包括例如：
[0343]
1)完整肿瘤细胞疫苗，其中在手术期间移出的癌细胞经过以增强其免疫原
性， 并且注射到患者中以诱导针对肿瘤细胞中的抗原的免疫反应。肿瘤细胞疫苗可以是自体 的，即患者自身的肿瘤，或同种异体的，其典型地含有两个或三个指定肿瘤类型的确定 的并且经过表征的人类肿瘤细胞系，如gvax疫苗平台。
[0344]
2)肿瘤抗原疫苗，其中投予肿瘤抗原(或几种肿瘤抗原的组合)、通常是蛋白质或 肽来增强免疫系统(可能与佐剂和/或树突状细胞的免疫调节剂或引诱剂一起，如 gm-csf)。肿瘤抗原可能对某一类型的癌症具有特异性，但是它们并不针对特定患者。
[0345]
3)可以使用基于载体的肿瘤抗原疫苗和dna疫苗作为稳定提供用于刺激抗肿瘤免 疫反应的抗原的方式。将编码肿瘤抗原的载体注射到患者中(可能与促炎性或其它引诱 剂一起，如gm-csf)，在体内被细胞溶解，产生特异性抗原，特异性抗原随后将激起 所期望的免疫反应。载体可以用于一次递送超过一种肿瘤抗原来提高免疫反应。另外， 重组病毒、细菌或酵母载体将触发其自身免疫反应，这些免疫反应也可以增强整体免疫 反应。
[0346]
4)溶瘤病毒疫苗，如oncovex/t-vec，其涉及瘤内注射优先感染癌细胞的条件复 制型单纯疱疹病毒。病毒还经过工程改造表达gm-csf，能够在癌细胞内部复制，引起 癌细胞溶解，释放出新病毒和一批肿瘤抗原，并在该过程中分泌gm-csf。因此，这类 溶瘤病毒疫苗增强dc在肿瘤微环境中刺激抗肿瘤免疫反应的功能。
[0347]
5)树突状细胞疫苗(palucka和banchereau,2102,《自然综述癌症(nat.rev. cancer)》,12(4):265-277)：树突状细胞(dc)吞噬肿瘤细胞并且将肿瘤抗原呈递给肿 瘤特异性t细胞。在这种途径中，从癌症患者中分离出dc并对其进行预致敏以呈递肿 瘤特异性t细胞。为此目的可以使用若干方法：给dc加载肿瘤细胞或溶解产物；给 dc加载肿瘤抗原的融合蛋白或肽；使肿瘤抗原与靶向dc的mab偶联。将dc在存在 刺激因子(如gm-csf)的情况下加以处理，离体活化并成熟，并且然后重新输注回到 患者中，以便激起对癌细胞的免疫反应。树突状细胞还能够通过给患者注射经过工程改 造以分泌刺激性细胞因子(如gm-csf)的经过辐射的完整肿瘤细胞而在体内预致敏。 类似途径可以用单核细胞进行。西普鲁塞-t(sipuleucel-t)(provenge)是已被批准用 于晚期前列腺癌的性癌症疫苗，是树突状细胞疫苗的实例。
[0348]
在一些实施例中，抗pvrig抗体与过继性t细胞疗法或过继性细胞转移(act) 组合使用，它涉及离体鉴别和扩增天然产生的自体肿瘤特异性t细胞，然后将所述t细 胞过继性转移回到癌症患者中(restifo等人,2013,《癌症免疫与免疫疗法(cancerimmunol.immunother.)》62(4):727-36(2013)电子版2012年12月4日)。在离体扩增之 后被输注回到患者中的细胞能够对肿瘤起作用并介导肿瘤破坏。在这种过继转移之前， 可以通过辐射和/或化疗使宿主免疫耗竭。淋巴细胞耗竭(lymphodepletion)、过继性细 胞转移和t细胞生长因子(如il-2)的组合能够在肿瘤患者中产生长期肿瘤根除。更新 颖的途径涉及正常外周血t细胞的离体基因修饰以赋予针对肿瘤相关抗原的特异性。举 例来说，可以将具有特别好的抗肿瘤反应的t细胞的tcr的克隆插入到病毒表达载体 中并用于感染来自待患者的自体t细胞。另一种选择是使用嵌合抗原受体(car)， car基本上是嵌合的免疫球蛋白-tcr分子，也被称作t体(t-body)。car具有抗体 样特异性并且识别靶细胞表面上的mhc无限制结构(结合胞外靶标的模块)，被移植到 能够活化t细胞的tcr胞内结构域上(restifo等人《癌症免疫与免疫疗法》62(4):727-36 (2013)电子版2012年12月4日；和shi等人,《自然》493:111-115 2013)。
[0349]
pvrig抗体和一种或多种其它剂可以依次投予或同时投予。组合物可以与药剂 联系在一起(作为免疫复合体)或可以与药剂分开投予。在后一种情况(分开投予)下， 组合物可以在药剂之前、在药剂之后或与药剂并行投予，或可以与其它已知疗法共投予， 其它已知疗法例如抗癌疗法，例如辐射。
[0350]
根据本发明的至少一些实施例的人源化抗pvrig免疫分子与化疗剂的共投予提供 通过不同机制起作用的两种抗癌剂，对人类肿瘤细胞产生细胞毒性作用。这类共投予能 够解决因为肿瘤细胞的耐药性的发展或抗原性的改变而导致肿瘤细胞不与抗体起反应 的问题。在其它实施例中，受试者可以另外用调节(例如增强或抑制)fcy或fcy受体 的表达或活性的药剂处理，例如通过用细胞因子处理受试者。
[0351]
还可以使用靶特异性效应细胞作为剂，例如与根据本发明的至少一些实施例的 组合物(例如，人类抗体、多特异性和双特异性分子)相连的效应细胞。用于靶向的效 应细胞可以是人类白细胞，如巨噬细胞、中性粒细胞或单核细胞。其它细胞包括嗜酸性 粒细胞、自然杀伤细胞和其它含igg或iga受体的细胞。如果需要，那么可以从待 的受试者获得效应细胞。靶特异性效应细胞可以作为细胞于生理学上可接受的溶液中的 悬浮液投予。细胞的投予量可以是大约10-8
到10-9
，但将取决于目的而改变。一般 来说，量足以获得在靶细胞处的定位，例如表达pvrig蛋白质的肿瘤细胞，并且足以 例如通过例如吞噬作用实现细胞杀死。投药途径还可以不同。
[0352]
采用了靶特异性效应细胞的疗法可以结合其它用于去除所靶向细胞的技术进行。举 例来说，使用根据本发明的至少一些实施例的组合物(例如，人类抗体、多特异性和双 特异性分子)的抗肿瘤疗法和/或配备有这些组合物的效应细胞可以结合化疗使用。另外， 组合免疫疗法可以用于指导两个不同的细胞毒性效应细胞体朝向肿瘤细胞排斥反应。 举例来说，与抗fc-γri或抗cd3相连的抗pvrig免疫分子可以结合igg或iga受体 特异性结合剂使用。
[0353]
根据本发明的至少一些实施例的双特异性和多特异性分子还能够用于调整效应细 胞上的fcγr或fcγr水平，如通过给细胞表面上的受体加帽(capping)和消除细胞表 面上的受体。还可以出于此目的使用抗fc受体的混合物。
[0354]
还可以在存在补体的情况下使用根据本发明的至少一些实施例的组合物(例 如，人类抗体、替代性支架多特异性和双特异性分子以及免疫结合物)，其具有补体结 合位点，如来自结合补体的igg1、igm2或igm3或igm的一部分。在一个实施例中， 用根据本发明的至少一些实施例的结合剂和恰当的效应细胞离体处理包含靶细胞的细 胞体可以补充上添加补体或含有补体的血清。包被有根据本发明的至少一些实施例的 结合剂的靶细胞的吞噬作用可以通过补体蛋白质的结合得到改良。在另一个实施例中， 包被有根据本发明的至少一些实施例的组合物(例如，人类抗体、多特异性和双特异性 分子)的靶细胞还能够被补体溶解。在又另一个实施例中，根据本发明的至少一些实施 例的组合物不活化补体。
[0355]
根据本发明的至少一些实施例的组合物(例如，人类抗体、替代性支架多特异 性和双特异性分子以及免疫结合物)还可以与补体一起投予。因此，根据本发明的至少 一些实施例，存在包含人类抗体、多特异性或双特异性分子和血清或补体的组合物。这 些组合物的有利之处在于，补体非常靠近人类抗体、多特异性或双特异性分子。或者， 根据本发明的至少一些实施例的人类抗体、多特异性或双特异性分子可以与补体或血清 分开投予。
[0356]
根据本发明的至少一些实施例的抗pvrig免疫分子可以用作中和抗体。中和抗体 (nab)是能够结合并且中和或抑制特异性抗原，从而抑制抗原的生物效应的抗体。nab 将通过阻断药剂活性所需的重要表面分子或通过干扰药剂与其在靶细胞上的受体的结 合来部分或完全地消除药剂的生物作用。
[0357]
根据本发明的额外方面，剂可以用来防止t细胞活性的病理性抑制，如针对癌 细胞的t细胞活性。
[0358]
因此，根据本发明的额外方面，提供一种如本文中所列举的癌症和/或用于促进 免疫刺激的方法，所述方法通过向有需要的受试者投予有效量的剂和/或药物组合物 中的任一种，药物组合物包含任何剂并且进一步包含药学上可接受的稀释剂或载 体。
[0359]
根据至少一些实施例，免疫细胞，优选t细胞，可以与剂体内或离体接触以调 整免疫反应。与剂接触的t细胞可以是任何表达t细胞受体的细胞，所述t细胞受 体包括α/β和γ/δt细胞受体。t细胞包括所有表达cd3的细胞，包括也表达cd4和 cds的t细胞亚组。t细胞包括初始细胞和记忆细胞和效应细胞，如cd8+细胞毒性t 淋巴细胞(ctl)。t细胞还包括以下细胞，如th1、tc1、th2、tc2、th3、th9、th17、 th22、treg、滤泡辅助细胞(t
fh
)和tr1细胞。t细胞还包括nkt细胞inkt、α/βnkt 和γ/δnkt细胞，以及类似的独特类别的t细胞谱系。
[0360]
pvrig阻断抗体还能够与使表达fcα或fcγ受体的效应细胞靶向肿瘤细胞的双特异 性抗体组合使用(参见例如第5,922,845号和第5,837,243号美国专利)。双特异性抗体 可以用来靶向两个单独的抗原。举例来说，已经使用抗fc受体/抗肿瘤抗原(例如， her-2/neu)双特异性抗体使巨噬细胞靶向肿瘤位点。这种靶向可以更有效地活化肿瘤特 异性反应。这些反应的t细胞臂可通过使用pvrig阻断强化。或者，可以通过使用结 合到肿瘤抗原和树突状细胞特异性细胞表面标志物的双特异性抗体，将抗原直接递送给 dc。
[0361]
肿瘤通过各种各样的机制避开宿主免疫监视。这些机制中的很多可以通过使肿瘤所 表达的免疫抑制性蛋白质失活来解决。这些尤其包括tgf-β(kehrl,j.等人(1986)《实 验医学杂志(j.exp.med.)》163:1037-1050)、il-10(howard,m.和o'garra,a.(1992) 《今日免疫学(immunology today)》13:198-200)和fas配体(hahne,m.等人(1996)《科 学》274:1363-1365)。各自针对这些实体的抗体可以与抗pvrig组合使用来抵消免疫 抑制剂的作用并且促进宿主的肿瘤免疫反应。
[0362]
其它可以用于活化宿主免疫反应的抗体可以与抗pvrig组合使用。这些抗体包括 树突状细胞表面上活化dc功能和抗原呈递的分子。抗cd40抗体能够有效地替代t细 胞辅助活性(ridge,j.等人(1998)《自然》393:474-478)并且可结合pvrig抗体使用 (ito,n.等人(2000)《免疫生物学(immunobiology)》201(5)527-40)。还可以提供以下 抗体来提高t细胞活化水平：针对t细胞共刺激分子的活化抗体，如ox-40(weinberg, a.等人(2000)《免疫学(immunol)》164:2160-2169)、4-1bb(melero,i.等人(1997)《自 然
·
医学(nature medicine)》3:682-685(1997))和icos(hutloff,a.等人(1999)《自 然》397:262-266)，以及阻断负性共刺激分子的活性的抗体，如ctla-4(例如，第 5,811,097号美国专利，易普利姆玛(implimumab))或btla(watanabe,n.等人(2003)《自 然
·
免疫学(nat immunol)》4:670-9)、b7-h4(sica,g l等人(2003)《免疫(immunity)》 18:849-61)、pd-1。目前使用骨髓移植
来造血来源的各种肿瘤。虽然这种有移 植物抗宿主疾病的后果，但是可以从移植物抗肿瘤反应获得益处。可以使用pvrig 阻断来提高供体移植的肿瘤特异性t细胞的有效性。
[0363]
还存在若干实验方案，为了针对肿瘤的抗原特异性t细胞，这些方案涉及抗原 特异性t细胞的离体活化和扩增以及这些细胞到接受者中的过继转移(greenberg,r.和 riddell,s.(1999)《科学》285:546-51)。这些方法还可以用于活化对如cmv的感染 物的t细胞反应。预期在抗pvrig免疫分子存在下离体活化可以提高过继转移的t细 胞的频率和活性。
[0364]
任选地，针对pvrig的抗体可以与免疫原性剂组合，免疫原性剂如癌细胞、经过 纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和碳水化合物分子)、细胞以及经过编码免疫刺激 性细胞因子的基因转染的细胞(he等人(2004)《免疫学杂志》173:4919-28)。可以使 用的肿瘤疫苗的非限制性实例包括用于结肠癌的muc1的肽、用于卵巢癌的 muc-1/cea/tricom的肽或经过转染以表达细胞因子gm-csf的肿瘤细胞(下文进一 步论述)。
[0365]
在人类中，一些肿瘤已经显示出免疫原性，如rcc。预期通过升高pvrig阻断t 细胞活化的阈值，我们期望在宿主中活化肿瘤反应。
[0366]
pvrig阻断可能在与疫苗接种方案组合时最有效。已经设计了许多针对肿瘤进行疫 苗接种的实验策略(参见rosenberg,s.,2000,癌症疫苗的发展(development of cancervaccines),asco教育文集spring:60-62；logothetis,c.,2000,asco教育文集spring: 300-302；khayat,d.2000,asco教育文集spring:414-428；foon,k.2000,asco教育文 集spring:730-738；还参见restifo,n.和sznol,m.,癌症疫苗(cancer vaccines),第61 章,第3023-3043页devita,v.等人(编),1997,《癌症：肿瘤学原理与实践(cancer: principles and practice of oncology)》.第五版)在这些策略中的一种策略中，使用自体 或同种异体肿瘤细胞来制备疫苗。这些细胞疫苗已经显示在肿瘤细胞经过转导以表达 gm-csf时最有效。gm-csf已被证明是用于肿瘤疫苗接种的强效抗原呈递活化剂 (dranoff等人(1993)《美国国家科学院院刊》90:3539-43)。
[0367]
各种肿瘤中的基因表达和大规模基因表达模式的研究已经得出了所谓的肿瘤特异 性抗原的定义(rosenberg,s a(1999)《免疫》10:281-7)。在许多情况下，这些肿瘤 特异性抗原是在肿瘤中和出现肿瘤的细胞中表达的分化抗原，例如黑素细胞抗原 gp100、mage抗原和trp-2。更重要的是，这些抗原中的许多已被证明是宿主中所发现 的肿瘤特异性t细胞的靶标。为了产生对这些蛋白质的免疫反应，可以结合在肿瘤中表 达的一批重组蛋白和/或肽使用pvrig阻断。这些蛋白质通常被免疫系统视为自体抗原 并且因而对其具有耐受性。肿瘤抗原还可以包括蛋白质端粒酶，端粒酶是合成染体的 端粒所需要的并且在大于85％的人类癌症中和在仅有限数量的体细胞组织中表达(kim, n等人(1994)《科学》266:2011-2013)。(可以通过各种手段保护这些体细胞组织不被 免疫攻击)。肿瘤抗原还可以是因为改变蛋白质序列或在两个不相关序列之间产生融合 蛋白(即费城染体(philadelphia chromosome)中的bcr-ab1)的体细胞突变而在癌细 胞中表达的“新抗原(neo-antigen)”，或来自b细胞肿瘤的独特型(idiotype)。
[0368]
其它肿瘤疫苗可以包括来自人类癌症中所涉及的病毒的蛋白质，所述病毒如人乳头 瘤病毒(hpv)、肝炎病毒(hbv和hcv)和卡波西氏疱疹肉瘤病毒(khsv)。可以结 合pvrig
效。因此，虽然可以进行标准的功效分析，如癌症负荷、肿瘤大小、转移的存在或程度 的评估等，但是还可以基于免疫状态评估来评定免疫肿瘤学。这可以用许多方式进 行，包括体外和体内分析。举例来说，可以与“旧式(old fashioned)”测量一起评估免疫 状态变化(例如，在ipi后icos+cd4+t细胞的存在)，“旧式”测量如肿瘤负荷、 大小、浸润性、ln参与、转移等。因此，可以评估以下中的任一个或全部：pvrig对 cd4
+
t细胞活化或增殖、cd8
+
t(ctl)细胞活化或增殖、cd8
+
t细胞介导的细胞毒 性活性和/或ctl介导的细胞耗竭、nk细胞活性和nk介导的细胞耗竭的抑制作用； pvrig对treg细胞分化和增殖和treg或骨髓来源的抑制细胞(mdsc)介导的免疫抑 制或免疫耐受性的增强作用；和/或pvrig对通过免疫细胞产生的促炎性细胞因子的影 响，例如通过t细胞或其它免疫细胞产生的il-2、ifn-γ或tnf-α。
[0379]
在一些实施例中，通过使用例如cfse稀释法、免疫效应细胞的ki67胞内染以及 3h-胸苷掺入法评估免疫细胞增殖来评定。
[0380]
在一些实施例中，通过评估基因表达的增加量或活化相关标志物的增加的蛋白质水 平以及通过cd107a的表面表达测量的细胞脱粒来评定，所述标志物包括以下中的 一个或多个：cd25、cd69、cd137、icos、pd1、gitr、ox40。
[0381]
一般来说，如本领域中已知般进行基因表达分析。参见例如goodkind等人,《计算 机与化学工程(computers and chem.eng.)》29(3):589(2005)；han等人,《生物信息 学与生物学见解(bioinform.biol.insights)》11/15/15 9(增刊1):29-46；campo等人, 《现代病理学(nod.pathol.)》2013年1月；26增刊1:s97-s110，其基因表达测量技术 以引用的方式明确并入本文中。
[0382]
一般来说，蛋白质表达测量也类似地如本领域中已知般进行，参见例如wang等人, 用于生物标志物发现的基于毛细管电泳的蛋白质组技术的最新进展(recent advances incapillary electrophoresis-based proteomic techniques for biomarker discovery),《分子 生物学方法(methods.mol.biol.)》2013:984:1-12；taylor等人,《生物医学研究(biomedres.)》第2014卷,文章编号361590,8页；becerk等人,《突变研究(mutat.res)》2011 年6月17日:722(2):171-182，其测量技术明确地以引用的方式并入本文中。
[0383]
在一些实施例中，通过评估众多细胞参数来评定通过靶细胞活力检测测量的细胞毒 性活性，从而评定，所述细胞参数如酶活性(包括蛋白酶活性)、细胞膜渗透性、 细胞粘附、atp产生、辅酶产生以及核苷酸吸收活性。这些分析的特定实例包括(但不 限于)台盼蓝(trypan blue)或pi染、
51
cr或
35
s释放法、ldh活性、mtt和/或 wst分析、钙黄绿素-am分析、基于发光的分析以及其它分析。
[0384]
在一些实施例中，通过评定通过细胞因子产生测量的t细胞活性，使用细胞因子， 使用众所周知的技术，细胞内测量培养物上清液来评定，所述细胞因子包括(但不 限于)ifnγ、tnfα、gm-csf、il2、il6、il4、il5、il10、il13。
[0385]
因此，可以使用评估以下中的一个或多个的分析来评定：(i)免疫反应的增加； (ii)αβ和/或γδt细胞的活化的增加；(iii)细胞毒性t细胞活性的增加；(iv)nk和/ 或nkt细胞活性的增加；(v)αβ和/或γδt细胞抑制的缓解；(vi)促炎性细胞因子分 泌的增加；(vii)il-2分泌的增加；(viii)干扰素γ产生的增加；(ix)th1反应的增加； (x)th2反应的
如通过流式细胞仪或通过ihc所测量。反应减少指示免疫刺激活性。恰当的减少与增加 相同，概述于下文中。
[0400]
在一个实施例中，信号通路分析测量m2巨噬细胞的前致肿瘤性(pro-tumorigenic) 活性的增加或减小，如例如通过细胞因子分泌或通过活化标志物的表达的变化所测量。 反应减少指示免疫刺激活性。恰当的减少与增加相同，概述于下文中。
[0401]
在一个实施例中，信号通路分析测量n2中性粒细胞增加的增加或减少，如例如通 过流式细胞仪或通过ihc所测量。反应减少指示免疫刺激活性。恰当的减少与增加相同， 概述于下文中。
[0402]
在一个实施例中，信号通路分析测量n2中性粒细胞的前致肿瘤性活性的增加或减 小，如例如通过细胞因子分泌或通过活化标志物的表达的变化所测量。反应减少指示免 疫刺激活性。恰当的减少与增加相同，概述于下文中。
[0403]
在一个实施例中，信号通路分析测量t细胞活化的抑制的增加或减少，如例如通过 细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如cd137、cd107a、pd1等活化标志物的表达的 变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了恰当的活性增加。
[0404]
在一个实施例中，信号通路分析测量ctl活化的抑制的增加或减少，如例如通过直 接杀死如例如癌细胞的靶细胞或通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如cd137、 cd107a、pd1等活化标志物的表达的变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。下文概 述了恰当的活性增加。
[0405]
在一个实施例中，信号通路分析测量αβ和/或γδt细胞耗竭的增加或减少，如例如 通过活化标志物的表达的变化所测量。反应减少指示免疫刺激活性。恰当的减少与增加 相同，概述于下文中。
[0406]
在一个实施例中，信号通路分析测量αβ和/或γδt细胞反应的增加或减少，如例如 通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如cd137、cd107a、pd1等活化标志物的表 达的变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了恰当的活性增加。
[0407]
在一个实施例中，信号通路分析测量抗原特异性记忆反应的刺激的增加或减少，如 例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如cd45ra、ccr7等活化标志物的表达 的变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了恰当的活性增加。.
[0408]
在一个实施例中，信号通路分析测量癌细胞的细胞凋亡或溶解的增加或减少，如例 如通过细胞毒性分析(如例如mtt、cr释放、calcine am)或通过基于流式细胞仪的 分析(如例如cfse稀释或碘化丙啶染等)所测量。活性增加指示免疫刺激活性。下 文概述了恰当的活性增加。
[0409]
在一个实施例中，信号通路分析测量对癌细胞的细胞毒性或细胞抑制作用的刺激的 增加或减少，如例如通过细胞毒性分析(如例如mtt、cr释放、calcine am)或通过 基于流式细胞仪的分析(如例如cfse稀释或碘化丙啶染等)所测量。活性增加指示 免疫刺激活性。下文概述了恰当的活性增加。
[0410]
在一个实施例中，信号通路分析测量癌细胞的直接杀死的增加或减少，如例如通过 细胞毒性分析(如例如mtt、cr释放、calcine am)或通过基于流式细胞仪的分析(如 例如cfse稀释或碘化丙啶染等)所测量。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了 恰当的活性增加。
[0411]
在一个实施例中，信号通路分析测量th17活性的增加或减小，如例如通过细胞因 子分泌或通过增殖或通过活化标志物的表达的变化所测量。活性增加指示免疫刺激活 性。下文概述了恰当的活性增加。
[0412]
在一个实施例中，信号通路分析测量补体依赖性细胞毒性和/或抗体依赖性细胞介导 的细胞毒性的诱导的增加或减少，如例如通过细胞毒性分析(如例如mtt、cr释放、 calcine am)或通过基于流式细胞仪的分析(如例如cfse稀释或碘化丙啶染等)所 测量。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了恰当的活性增加。
[0413]
在一个实施例中，例如通过直接杀死如例如癌细胞的靶细胞或通过细胞因子分泌或 通过增殖或通过如例如cd137、cd107a、pd1等活化标志物的表达的变化测量t细胞 活化。关于t细胞，增殖、细胞表面活化标志物(例如，cd25、cd69、cd137、pd1)、 细胞毒性(杀死靶细胞的能力)以及细胞因子产生(例如，il-2、il-4、il-6、ifnγ、 tnf-a、il-10、il-17a)的增加将指示与增强的癌细胞杀死一致的免疫调节。
[0414]
在一个实施例中，例如通过直接杀死如例如癌细胞的靶细胞或通过细胞因子分泌或 通过如例如cd107a等活化标志物的表达的变化测量nk细胞活化。关于nk细胞，增 殖、细胞毒性(杀死靶细胞并提高cd107a、颗粒酶和穿孔素表达的能力)、细胞因子产 生(例如，ifnγ和tnf)以及细胞表面受体表达(例如，cd25)的增加将指示与增强 的癌细胞杀死一致的免疫调节。
[0415]
在一个实施例中，例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过活化标志物的表达的变 化测量γδt细胞活化。
[0416]
在一个实施例中，例如通过细胞因子分泌或通过活化标志物的表达的变化测量th1 细胞活化。
[0417]
活性或反应的恰当增加(或减少，如上文所概述的恰当的)是相比于在参考样品或 对照样品中的信号增加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％ 或98％到99％的百分比，参考样品或对照样品例如不含本发明的抗pvrig抗体的测试 样品。类似地，相比于参考样品或对照样品至少一倍、两倍、三倍、四倍或五倍的增加 展现出功效。
[0418]
4.病原体感染的
[0419]
根据至少一些实施例，与能够癌症的原因相同，抗pvrig抗体可以任选地用 于传染病：慢性感染通常以病毒特异性t细胞反应的不同程度的功能性障碍为特征 并且这种缺陷是宿主不能消除持续存在的病原体的主要原因。虽然一开始在早期感染期 间产生了功能性效应t细胞，但是这些功能性效应t细胞在慢性感染的过程中因为长久 暴露于外来抗原，导致t细胞耗竭，所以逐渐失去了功能。耗竭t细胞表达高水平的多 个共抑制性受体，如ctla-4、pd-1和lag3(crawford等人,《免疫学当前观点(curropin immunol.)》2009；21:179-186；kaufmann等人,《免疫学杂志》2009；182:5891-5897； sharpe等人,《自然
·
免疫学(nat immunol)》2007；8:239-245)。临床上在具有慢性病毒 感染的患者中观察到了耗竭t细胞过表达pd-1，慢性病毒感染包括hiv、hcv和hbv (crawford等人,《免疫学当前观点》2009；21:179-186；kaufmann等人,《免疫学杂志》 2009；182:5891-5897；sharpe等人,《自然
·
免疫学》2007；8:239-245)。已在额外病原体 中对这种通路做了一些调查，额外病原体包括其它病毒、细菌和寄生虫(hofmeyer等人, 《生物医学和生物技术杂志(j biomed biotechnol.)》第2011卷,文章编号451694；bhadra 等人,《美国国家科学院院刊》
2011；108(22):9196-201)。举例来说，使用通过标准的盲 肠结扎穿孔法诱导的脓毒症模型证明pd-1通路参与了细菌感染的控制。在此模型中在 经过保护不会发生脓毒症诱发的死亡的基因敲除小鼠中缺少pd-1(huang等人,pnas 2009:106；6303-6308)。
[0420]
可以通过阻断如pd-1或ctla-4的共抑制通路(rivas等人,《免疫学杂志》 2009；183:4284-91；golden-mason等人,《病毒学杂志(j virol.)》2009；83:9122-30； hofmeyer等人,《生物医学和生物技术杂志》第2011卷,文章编号451694)，由此允许 恢复抗病毒免疫功能，从而逆转t细胞耗竭。通过阻断pd-1/pd-l1通路深入研究了共 抑制阻断病毒感染的潜能，其在若干动物感染模型中证明有效，包括恒河猴的 急性和慢性猿猴免疫缺陷病毒(siv)感染(valu等人,《自然》2009；458:206-210)； 以及小鼠慢性病毒感染模型，如淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)(barber等人, 《自然》2006；439:682-7)，和sjl/j小鼠的泰勒氏鼠脑脊髓炎病毒(theiler's murineencephalomyelitis virus；tmev)模型(duncan和miller《公共科学图书馆
·
综合(plosone.)》2011；6:e18548)。在这些模型中，pd-1/pd-l1阻断改良了抗病毒反应并且提高 了持续存在的病毒的清除率。另外，pd-1/pd-l1阻断增加了体液免疫，其表现为血浆中 的特异性抗病毒抗体的产生增加，这与改良的细胞反应组合引起血浆病毒负荷减小并且 存活率提高。
[0421]
如本文所用，术语“传染性病症和/或疾病”和/或“感染”可互换使用，包括任何由致病 生物媒介物在个别宿主生物体中的存在和/或生长引起的病症、疾病和/或病况。如本文 所用，术语“感染”包含以上病症、疾病和/或病况，展现临床明显的病痛(即，疾病的特 征医学体症和/或症状)和/或其大部分或所有病程都无症状。如本文所用，术语“感染
”ꢀ
也包含由外来抗原的持续存在引起的病症、疾病和/或病况，外来抗原导致t细胞表现 型耗竭，其特征在于功能减弱，这显示为增殖和细胞因子产生减少。如本文所用，术语
ꢀ“
传染性病症和/或疾病”和/或“感染”进一步包括以下所列的由细菌感染、病毒感染、真菌 感染和/或寄生虫感染引起的传染性病症、疾病和/或病况中的任一种。
[0422]
抗pvrig抗体可以单独投予，或如本文所述任选地与一种或多种用于细菌感 染、病毒感染、真菌感染的其它剂组合投予。
[0423]
也就是说，向被感染的受试者投予抗pvrig抗体，抗pvrig抗体拮抗至少一种 pvrig介导的对免疫的作用，例如其对细胞毒性t细胞或nk活性的抑制作用和/或其 对促炎性细胞因子的产生的抑制作用，或抑制pvrig对treg的刺激作用，从而促使被 感染细胞或病原体的耗竭或杀死，并且基于受试者的免疫细胞对病原体或被感染细胞的 杀死的增强，可能引起疾病缓解。
[0424]
5.脓毒症的
[0425]
根据至少一些实施例，使用抗pvrig抗体来脓毒症。如本文所用，术语“脓毒 症”或“脓毒症相关病况”涵盖脓毒症、重度脓毒症、脓毒性休克、全身炎症反应综合征 (sirs)、菌血症、败血症、毒血症、脓毒性综合征。
[0426]
抑制性蛋白的上调近来显现为脓毒症中免疫抑制的潜在关键机制中的一种。举例来 说，pd-1/pdl-1通路似乎是脓毒症结果的决定因素，通过抗菌免疫反应调节有效性与损 害之间微妙的平衡。在实验模型中在脓毒症期间，腹膜巨噬细胞和血液单核细胞显著地 增加pd-1水平，这与细胞功能障碍的发展有关(huang等人2009pnas 106:6303-6308)。 类似地，在具有脓毒性休克的患者中，pd-1在外周t细胞上的表达和pdl-1在单核细 胞上的表达
显著上调(zhang等人2011《危急护理(crit.care)》15:r70)。最新的动 物研究显示，在脓毒症中，通过抗pd1或抗pdl1抗体阻断pd-1/pdl-1通路改良了存 活率(brahmamdam等人2010《白细胞生物学杂志(j.leukoc.biol.)》88:233-240； zhang等人2010《危急护理(critical care)》14:r220；chang等人2013《危急护理》 17:r85)。类似地，在脓毒症中，用抗ctla4抗体阻断ctla-4改良了存活率(inoue 等人2011《休克(shock)》36:38-44；chang等人2013《危急护理》17:r85)。综 合而言，这些发现表明，包括负性共刺激分子在内的抑制性蛋白的阻断是用于预防脓毒 症的有害作用的潜在途径(goyert和silver,《白细胞生物学杂志》,88(2):225-226, 2010)。
[0427]
根据一些实施例，本发明提供使用抗pvrig抗体脓毒症，单独或与已知的可 有效脓毒症的剂组合，如在脓毒症早期的高炎症阶段(hyperinflammatory phase) 阻断细胞因子风暴(cytokine storm)的那些疗法，和/或为了解决脓毒症诱导的免疫抑制 阶段，具有免疫刺激作用的疗法。
[0428]
与脓毒症的标准护理组合，如“重度脓毒症和脓毒性休克的国际管理指南 (international guidelines for management of severe sepsis and septic shock)”(dellinger 等人2013《重症监护医学(intensive care med)》39:165-228)所建议，其中一些在下 文中描述。
[0429]
具有针对所有可能的病原体的活性的广谱抗生素(细菌和/或真菌始于诊断出脓 毒症，但未鉴别到特异性病原体时)，例如头孢噻肟(cefotaxime)替卡 西林(ticarcillin)和克拉维酸(clavulanate)哌拉西林(piperacillin)和 三唑巴坦(tazobactam)亚胺培南(imipenem)和西司他汀(cilastatin) 美罗培南(meropenem)克林霉素(clindamycin)(cleocin)、 甲硝唑(metronidazole)头孢曲松(ceftriaxone)环丙沙星 (ciprofloxacin)头孢吡肟(cefepime)左氧氟沙星(levofloxacin) 万古霉素(vancomycin)或所列药物的任何组合。
[0430]
血管加压药：例如去甲肾上腺素、多巴胺、肾上腺素、血管加压素
[0431]
类固醇：例如氢化可的松(hydrocortisone)、地塞米松(dexamethasone)或氟氢可 的松(fludrocortisone)，静脉内或以其它方式
[0432]
收缩性疗法：例如用于具有心肌功能障碍的脓毒症患者的多巴酚丁胺
[0433]
重组人活化蛋白c(rhapc)，如屈曲可净α(drotrecogin alfa)(活化)(drotaa)。
[0434]
β-阻断剂额外减少局部和全身性发炎。
[0435]
代谢干预，如丙酮酸盐、丁二酸盐或大剂量胰岛素替代。
[0436]
与新颖的潜在脓毒症疗法组合：
[0437]
spla2-iia的选择性抑制剂(如ly315920na/s-5920)。原理：在重度脓毒症中，在 发炎期间释放的iia型分泌型磷脂酶a2(spla2-iia)增加，并且血浆水平与存活率成 反比。
[0438]
磷脂乳液(如gr270773)。原理：临床前和离体研究显示，脂蛋白结合并中和内毒 素，并且实验性动物研究证明，在投予脂蛋白时避免了脓毒性死亡。内毒素中和与脂蛋 白颗粒中的磷脂的量相关。
[0439]
抗tnf-α抗体：原理：肿瘤坏死因子-α(tnf-α)诱导了很多在脓毒症中观察到的 病
理生理学体症和症状。
[0440]
抗cd14抗体(如ic14)。原理：如cd14的上游识别分子在发病机制中起关键作 用。细菌细胞壁组分结合到cd14和骨髓细胞上的共受体，引起细胞活化和促炎性介质 的产生。在动物和人类内毒素血症模型中，抗cd14单克隆抗体(ic14)显示可减少脂 多糖诱导的反应。
[0441]
toll样受体(tlr)的抑制剂和其下游信号通路。原理：传染性微生物在其表面上 呈现高度保守的大分子(例如，脂多糖、肽聚糖)。当这些大分子被免疫细胞表面上的 模式识别受体(称为toll样受体[tlr])识别时，引发了宿主的免疫反应。这可能造成 具有脓毒症特征的过量全身炎症反应。若干tlr的抑制被评估为潜在的脓毒症疗法，尤 其是tlr4，针对革兰氏阴性细菌外膜脂多糖或内毒素的受体。靶向tlr4表达和通路 的各种药物具有脓毒症潜能(wittebole等人2010《炎症介质(mediators ofinflammation)》第10卷文章编号568396)。在这些药物中有靶向tlr4、可溶性tlr4 的抗体、他汀类药物(statins)(如)、(ketamine)、 烟碱类似物、依立托仑(eritoran)(e5564)、瑞沙托维(resatorvid)(tak242)。另外， 其它tlr的拮抗剂，如氯喹(chloroquine)、用中和抗体(抗tlr-2)抑制tlr-2。
[0442]
兰索拉唑(lansoprazole)，通过其对socs1(细胞因子分泌的抑制因子)的作用
[0443]
talactoferrin或重组人乳铁蛋白。原理：乳铁蛋白是在分泌物和免疫细胞中发现的 具有抗感染和消炎特性的糖蛋白。talactoferrinα是重组形式的人乳铁蛋白，具有类似的 特性并且在维持胃肠粘膜屏障完整性方面起重要作用。talactoferrin在动物脓毒症模型 中和在患有重度脓毒症的患者的临床试验中显示出功效(guntupalli等人《危重病急救 医学(crit care med.)》2013；41(3):706-716)。
[0444]
乳脂肪球egf因子viii(mfg-e8)，一种在凋亡细胞与吞噬细胞之间的桥连分子， 有助于凋亡细胞的吞噬作用。
[0445]
‘
胆碱能抗炎通路’的激动剂，如烟碱和类似物。原理：刺激迷走神经减少了细胞因 子或免疫系统介质的产生，并且阻断了炎症。这种神经“回路”称为“炎症反射”，通过从 神经末梢释放的乙酰胆碱对在巨噬细胞上表达的烟碱型乙酰胆碱受体(α7nachr)的α7 亚单元的特异性作用进行，这种机制称为
‘
胆碱能抗炎通路’。在全身炎症、休克和脓毒 症的多个模型中，通过迷走神经刺激或药物α7激动剂活化这个通路预防了组织损伤 (matsuda等人2012《日本医科大学学报(j nippon med sch.)》79:4-18；huston 2012《外 科感染(surg.infect.)》13:187-193)。
[0446]
靶向炎性体通路的剂。原理：炎性体通路大大促进了脓毒症中的炎症反应，并 且关键要素负责将过渡区从局部炎症驱动到有害的高炎症宿主反应(cinel和opal 2009 《危重病急救医学》37:291-304；matsuda等人2012《日本医科大学学报》79:4-18)。
[0447]
干细胞疗法。原理：间充质干细胞(msc)通过其以下能力展现出多种有利特性： 归巢到受损伤组织，活化常驻干细胞，分泌旁分泌信号以限制全身性和局部炎症反应， 有利地调整免疫细胞，通过减少受威胁组织中的细胞凋亡和刺激血管新生来促进组织愈 合，并且展现直接抗微生物活性。这些作用与脓毒症动物模型中减少的器官功能障碍和 改良的存活率相关，其所提供的证据证明，msc可能是适用的辅助剂(wannemuehler 等人2012《外科研究杂志(j.surg.res.)》173:113-26)。
[0448]
抗pvrig抗体与其它免疫调节剂的组合，其它免疫调节剂如免疫刺激性抗体、细 胞因子疗法、免疫调节药物。这类药剂引起免疫反应性增加，尤其是在免疫防御(无论 是先天性的和/或适应性的)已降低的情况下，如在脓毒症诱发的低炎症和免疫抑制病况 中。通过加强宿主免疫力的剂逆转脓毒症诱发的免疫瘫痪可以降低继发性感染的发 病率并且改良已证实免疫抑制的患者的结果(hotchkiss等人2013《柳叶刀传染病 (lancet infect.dis.)》13:260-268；payen等人2013《危急护理》17:118)。
[0449]
免疫刺激性抗体通过直接调节免疫功能，即阻断其它抑制性蛋白或通过增强共刺激 蛋白，促进免疫反应。脓毒症的实验模型已显示，在脓毒症中，通过抗体阻断如pd-1、 pdl-1或ctla-4的抑制性蛋白进行免疫刺激提高了存活率(brahmamdam等人2010 《白细胞生物学杂志》88:233-240；zhang等人2010《危急护理》14:r220；chang等 人2013《危急护理》17:r85；inoue等人2011《休克》36:38-44)，表明这类免疫刺 激剂可作为预防脓毒症诱发的免疫抑制的有害作用的潜在疗法(goyert和silver《白细 胞生物学杂志》88(2):225-226,2010)。免疫刺激性抗体包括：1)靶向抑制性免疫检查 点的拮抗性抗体包括抗ctla4 mab(如伊匹单抗、曲美单抗)、抗pd-1(如纳武单抗 bms-936558/mdx-1106/ono-4538、amp224、ct-011、lambrozilumab mk-3475)、抗 pdl-1拮抗剂(如bms-936559/mdx-1105、medi4736、rg-7446/mpdl3280a)；抗lag-3 (如imp-321)、抗tim-3、抗btla、抗b7-h4、抗b7-h3、抗vista。2)增强免疫刺 激性蛋白的激动性抗体包括抗cd40 mab(如cp-870,893、鲁卡木单抗、达西珠单抗)、 抗cd137 mab(如bms-663513乌瑞鲁单抗、pf-05082566)、抗ox40 mab(如抗ox40)、 抗gitr mab(如trx518)、抗cd27 mab(如cdx-1127)以及抗icos mab。
[0450]
直接刺激免疫效应细胞并增强免疫反应的细胞因子可以与抗gen抗体组合用于脓 毒症疗法：il-2、il-7、il-12、il-15、il-17、il-18和il-21、il-23、il-27、gm-csf、ifnα(干扰素α)、ifnβ、ifnγ。原理：基于细胞因子的疗法直接尝试刺激患者自身的 免疫系统。脓毒症的实验模型已显示，在脓毒症中，如il-7和il-15的细胞因子的投予 促进了t细胞活力并且产生改良的存活率(unsinger等人2010《免疫学杂志》 184:3768-3779；inoue等人2010《免疫学杂志》184:1401-1409)。干扰素γ(ifnγ) 体外逆转了脓毒症诱发的单核细胞免疫瘫痪。体内研究显示，ifnγ在人类中在体内部分 逆转了免疫瘫痪。ifnγ和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)恢复脓毒症患者的 经过离体刺激的白细胞的免疫能力(mouktaroudi等人《危急护理》2010；14:p17； leentjens等人《美国呼吸和重症护理医学杂志(am j respir crit care med)》第186 卷,第838-845页,2012)。
[0451]
免疫调节药物，如胸腺素α1。原理：胸腺素α1(tα1)是天然产生的胸腺肽，充当 先天性和适应性免疫系统的内源性调节因子。它在世界范围内用于与免疫功能障碍 相关的疾病，包括病毒感染，如b型和c型肝炎、某些癌症，并且用于疫苗增强。尤其， 免疫调节研究的最新进展指出了ta1处理在脓毒性患者中的有利作用(wu等人《危急 护理》2013,17:r8)。
[0452]
在上述脓毒症疗法中，优选地患有脓毒症或因为毒性感染而有患上脓毒症的风险的 受试者，例如对抗生素或其它药物具有耐药性的受试者，将被投予根据本发明的免疫刺 激性抗pvrig抗体或抗原结合片段，所述抗体拮抗至少一种pvrig介导的对免疫的作 用，例如其对细胞毒性t细胞或nk活性的抑制作用和/或其对促炎性细胞因子的产生的 抑制作用，或抑制pvrig对treg的刺激作用，从而促使被感染细胞或病原体的耗竭或 杀死，并且基
异体序列的cdr的抗体，或与cpa.7.001到cpa.7.050中的任一个竞争结合的抗体，并 且尤其是结合pvrig并阻断受体结合的抗体，包括cpa.7.001、cpa.7.003、cpa.7.004、 cpa.7.006、cpa.7.008、cpa.7.009、cpa.7.010、cpa.7.011、cpa.7.012、cpa.7.013、 cpa.7.014、cpa.7.015、cpa.7.017、cpa.7.018、cpa.7.019、cpa.7.021、cpa.7.022、cpa.7.023、cpa.7.024、cpa.7.033、cpa.7.034、cpa.7.036、cpa.7.040、cpa.7.046、 cpa.7.047、cpa.7.049以及cpa.7.050。另外，还可以使用结合但不阻断的抗体，包括 cpa.7.016、cap.7.020、cpa.7.028、cpa.7.030、cpa.7.038、cpa.7.044以及cpa.7.045。
[0462]
如本领域的普通技术人员将了解，关于离体或体外分析，可以使用鼠类抗体，并且 因此可以使用以下中的任一个的可变重链和轻链结构域进行诊断，包括采用其它形式的 cdr组：cha.7.502、cha.7.503、cha.7.506、cha.7.508、cha.7.510、cha.7.512、 cha.7.514、cha.7.516、cha.7.518、cha.7.520.1、cha.7.520.2、cha.7.522、cha.7.524、 cha.7.526、cha.7.527、cha.7.528、cha.7.530、cha.7.534、cha.7.535、cha.7.537、 cha.7.538.1、cha.7.538.2、cha.7.543、cha.7.544、cha.7.545、cha.7.546、cha.7.547、 cha.7.548、cha.7.549以及cha.7.550。
[0463]
在多个实施例中，诊断抗体经过标记。“标记”在本文中意指本文中所公开的抗体连 接有一种或多种元素、同位素或化合物以便实现在筛选或诊断程序中进行检测。一般来 说，标记分成几类：a)免疫标记，其可以是作为由抗体识别的融合伴侣并入的表位；b) 同位素标记，其可以是放射性同位素或重同位素；c)小分子标记，其可以包括荧光染 料和比染料，或如生物素等能够实现其它标记方法的分子；以及d)如允许全身成像 的颗粒(包括用于超声标记的气泡)或顺磁标记等标记。标记可以并入到抗体中的任何 位置并且可以在蛋白质表达期间体外或体内并入，如本领域中已知。
[0464]
诊断可以通过投予允许如下所述的全身成像的诊断抗体体内进行，或对从患者中取 出的样品体外进行。“样品”在此情况下包括任何数量的事物，包括(但不限于)体液(包 括(但不限于)血液、尿液、血清、淋巴、唾液、肛门和阴道分泌物、汗液以及精液)， 以及组织样品，如由相关组织的活检产生的样品。
[0465]
在一些实施例中，进行体内成像，包括(但不限于)超声波、ct扫描、x射线、 mri和pet扫描以及光学技术，如使用针对肿瘤的光标记在体表附近进行的光学技术。
[0466]
与pvrig相关的疾病的体内成像可以通过任何合适的技术进行。举例来说，可以 使用99tc标记或用另一种发射β射线的同位素标记来标记抗pvrig抗体。这种技术的 变化形式可以包括使用磁共振成像(mri)相对于伽马照相机技术改良成像。
[0467]
在一个实施例中，本发明提供一种体内成像方法，其中抗pvrig抗体结合到检测 促进剂，将所结合的抗体如通过注射到血流中来投予给宿主，并且分析标记抗体在宿主 中的存在情况和位置。通过这种技术和本文中提供的任何其它诊断方法，本发明提供了 一种针对人类患者或从人类患者取得的生物样品中疾病相关细胞的存在进行筛选的方 法。
[0468]
关于诊断成像，放射性同位素可以直接地或通过使用中间官能团间接地结合到抗 pvrig抗体。适用的中间官能团包括螯合剂，如乙二胺四乙酸和二乙烯三胺五乙酸(参 见例如第5,057,313号美国专利)，在涉及放射性同位素结合的抗pvrig抗体的这类诊 断分析中，递送给患者的结合的抗pvrig抗体的剂量典型地通过以下维持在尽可能低 的水平：针对最小半衰期、最短体内停留和最少同位素量的最佳组合选择同位素，所述 最佳组合将允
许检测和精确测量。
[0469]
除了放射性同位素和不透射线的试剂之外，可以使用结合到染料(如具有生物素
‑ꢀ
抗生蛋白链菌素复合体)、造影剂、荧光化合物或分子以及用于磁共振成像(mri)的增 强剂(例如，顺磁性离子)的抗pvrig抗体来进行诊断方法(参见例如第6,331,175号 美国专利，其描述了mri技术和结合到mri增强剂的抗体的制备)。这类诊断/检测试 剂可以选自磁共振成像中所用的试剂和荧光化合物。
[0470]
为了给抗pvrig抗体加载放射性金属或顺磁性离子，可能需要使抗体与这样的试 剂反应，所述试剂具有长尾，长尾上连接有多个螯合基团以便结合离子。这类尾部可以 是聚合物，如聚赖氨酸、多糖，或其它具有侧接基团的衍生化或可衍生化链，侧接基团 上可以结合螯合基团，如卟啉、多元胺、冠醚、双硫缩氨基脲、聚肟以及已知适用于这 种目的的类似基团。
[0471]
螯合物可以使用标准化学法与抗pvrig抗体偶合。螯合物通常通过能够以极小的 免疫反应性损失和极少的聚集和/或内部交联与分子成键的基团来与抗pvrig抗体连 接。
[0472]
可能适用的金属螯合物组合的实例包括2-苯甲基-dtpa和其单甲基和环己基类似 物，与60到4,000kev的一般能量范围内的诊断同位素一起使用以便放射性成像 (radio-imaging)，诊断同位素如
125
i、
123
i、
124
i、
62
cu、
64
cu、
18
f、
111
in、
67
ga、
99
tc、
94
tc、 11
c、
13
n、5o和
76
br。
[0473]
标记包括放射性核素、放射性造影剂、顺磁性离子、金属、荧光标记、化学发光标 记、超声造影剂以及感光剂。这类诊断剂是众所周知的并且可以使用任何此类已知诊断 剂。诊断剂的非限制性实例可以包括放射性核素，如110in、111in、177lu、18f、52fe、 62cu、64cu、67cu、67ga、68ga、86y、90y、89zr、94mtc、94tc、99mtc、120i、 123i、124i、125i、131i、154-158gd、32p、11c、13n、15o、186re、188re、51mn、 52mmn、55co、72as、75br、76br、82mrb、83sr或其它γ、β或正电子发射体。
[0474]
有用的顺磁性离子可以包括铬(iii)、锰(ii)、铁(iii)、铁(ii)、钴(ii)、镍(iii)、铜(iii)、 钕(iii)、钐(iii)、镱(iii)、钆(iii)、钒(ii)、铽(iii)、镝(iii)、钬(iii)或铒(iii)，金属造影剂 可以包括镧(iii)、金(iii)、铅(ii)或铋(iii)。
[0475]
超声造影剂可以包含脂质体，如气体填充的脂质体。不透射线的诊断剂可以选自化 合物、钡化合物、镓化合物以及铊化合物。
[0476]
这些螯合物和类似的螯合物当与非放射性金属(如锰、铁和钆)络合时可以适用于 与抗pvrig抗体相关的mri诊断方法。大环螯合物如nota、dota和teta可用于 各种金属和放射性金属，最确切地说，分别用于镓、钇和铜的放射性核素。此类金属
‑ꢀ
螯合物络合物可以通过针对所关注的金属调适环大小而变得非常稳定。其它环类螯合物 也可能适合于诊断方法中，如大环聚醚，大环聚醚是稳定地结合如223ra的核素所感兴 趣的。
[0477]
因此，本发明提供诊断性抗pvrig抗体结合物，其中抗pvrig抗体结合物与造影 剂(如用于磁共振成像、计算机断层扫描或超声造影增强剂)或放射性核素结合，放射 性核素可以是例如γ、β、α、俄歇电子(auger electron)或正电子发射同位素。
[0478]
抗pvrig抗体还可以适用于例如检测所关注的抗原在特异性细胞、组织或血清中 的表达。关于诊断应用，抗体典型地将用体外分析可检测部分标记。如本领域的普通技 术人员将了解，存在各种合适的标记用于体外测试。用于本发明的这个方面的合适的染 料包
括(但不限于)荧光镧系元素络合物，包括铕和铽的络合物、荧光素、罗丹明 (rhodamine)、四甲基罗丹明、伊红(eosin)、赤藓红(erythrosin)、香豆素、甲基香豆 素、量子点(也称为“纳米晶体”；参见美国系列号09/315,584，特此通过引用并入)、芘、 孔雀石绿(malacite green)、芪(stilbene)、荧光黄(lucifer yellow)、cascade blue.tm.、 德克萨斯红(texas red)、cy染料(cy3、cy5等)、alexa染料(包括alexa)、藻红素、 氟硼荧(bodipy)以及richard p.haugland的第6版《分子探针手册(molecular probeshandbook)》中所述的其它染料，其特此明确地通过引用并入。
[0479]
接着可以评定经过染的组织的放射性计数作为肿瘤中pvrig相关肽的量的指示。 通过使用这类技术获得的图像可以用于评定pvrig在患者、哺乳动物或组织中的生物 分布，例如在使用pvrig作为浸润性癌细胞的存在的生物标志物的情况下。
[0480]
实例
[0481]
参考了2016年2月19日提交的名为“pvrig多肽和方法(pvrigpolypeptides and methods of treatment)”的ussn xx，要求ussn到2015 年2月19提交的ussn 62/118,235和2015年3月31日提交的ussn 62/141,168的优先 权，其全部明确地以全文引用的方式并入本文中。
[0482]
实例1：pvrig蛋白质的表达分析
[0483]
实例1a：
[0484]
分析gds3113数据集(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/gdsbrowser？acc＝gds3113) 以鉴别具有淋巴器官特异性模式的基因。pvrig因为在初级和次级淋巴器官中的高表达 而被鉴别为具有淋巴细胞特异性，初级和次级淋巴器官包括外周血、骨髓、脾脏、淋巴 结、扁桃体以及胸腺(图2)。其它组织类型是阴性的或显示背景水平的表达。为了调查 整个免疫细胞体内哪些特定的细胞类型表达pvrig，分析来自基因表达综合数据库 (gene expression omnibus)(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)的额外数据集，如本文在“方 法”部分中所述。对衍生自外周血和骨髓的免疫细胞体进行分析。pvrig在b细胞谱 系和t细胞谱系中的淋巴细胞中表达，包括初始cd8 t细胞、效应细胞和记忆细胞(图 3)。另外，pvrig在nk细胞中表达并且在inkt体中具有最高表达(图4)。在实验 模型中，当用合成激动剂刺激时，淋巴细胞的inkt体充当抗肿瘤免疫的强效活化剂。 然而，在一些情况下，inkt细胞可以抗肿瘤免疫的充当抑制剂和调节剂(《临床与发育 免疫学(clin dev immunol.)》2012；2012:720803)。此外，在基于inkt细胞的免疫疗 法的早期临床试验中证明，在肺癌和头颈癌中，配体脉冲式抗原呈递细胞处理和/或体外 活化的inkt细胞的输注是安全和良好耐受的(《临床免疫学(clin immunol.)》2011 年8月；140(2):167-76.)。
[0485]
关于pvrig表达的关键问题是肿瘤浸润性淋巴细胞(til)是否保留pvrig在肿 瘤微环境中的表达。来自滤泡性淋巴瘤、乳腺癌和结肠癌的til的表达数据的分析显示 pvrig在肿瘤浸润性til中的明显表达。在结肠癌实例中，看到了对免疫浸润性细胞的 特异性，因为仅在cd45阳性体(白细胞特异性标志物)中发现了表达，并且在epcam 阳性体(上皮细胞特异性标志物)中或在cd45阴性epcam阴性(基质细胞体) 中未发现表达。虽然cd45不是淋巴细胞特异性标志物，但是另一个表达说明推断出它 在淋巴细胞体上表达(图5a结肠癌，图5b乳腺癌和图5c滤泡性淋巴瘤)。
[0486]
本文中所示的mrna表达数据指示，pvrig在淋巴细胞中和在肿瘤浸润性淋巴细 胞
(til)中表达。这些结果连同pvrig抑制活性一起提出了分子在t细胞中的抑制作 用，表明针对pvrig的抑制性抗体提高了pvrig对til的抑制作用并且因此使得til 能够诱导针对癌症的免疫反应。因为所提出的作用机制是针对肿瘤浸润性til的，而不 是对肿瘤细胞直接作用，所以任何具有免疫浸润性的癌症都是使用pvrig抑制性抗体 进行的候选者。
[0487]
方法：从geo站点以soft格式下载原始数据。在原始数据呈mas5格式的情况 下，无需处理即获得数据。如果数据呈log mas5形式，那么将数据转换为线性数据。 如果数据呈rma格式，那么下载cel文件(原始数据)并且使用mas5重新分析。如 果原始cel文件不可用，那么使用rma格式。
[0488]
接着针对affy数据根据第95百分位数使数据通过乘法归一化。所分析的数据集： gse49910、gse47855、gse39397、gse36765、gse27928。
[0489]
实例1b
[0490]
基于ucsc已知基因模型(http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenpath/hg19/database/ knowngene.txt.gz)产生转录组参考。首先比对所有rna测序读数与转录组序列。这种 比对允许进行非唯一映射，因为同种型共用许多外显子。接着基于转录组匹配给每个读 数指定基因组坐标和外显子接合点。剩余未映射的读数通过考虑一个或多个外显子接合 点直接与基因组比对。最后，将读数计数如bo等人(《生物信息学(bioinformatics)》2010, 26(4):493-500)所述归一化并且如trapnell等人(《自然
·
生物技术》2010年5 月；28(5):511-5)所述转换为基因表达值。
[0491]
如图6中所示，基于基因型组织表达(gtex)数据(http://www.nature/ng/ journal/v45/n6/full/ng.2653.html；http://www.gtexportal.org/home/)，pvrig主要在血细胞 中表达并且在各种正常组织中的表达程度较低。根据癌症基因组图谱(the cancergenome atlas；tcga)(http://cancergenome.nih.gov/)，在癌组织中观察到了相同结果， 其中在如b细胞淋巴瘤和aml的血液癌症中看到了高表达(图7)。使用gtex和tcga 数据，通过鉴别具有与pvrig高度相关的表达模式的基因，产生各种癌症和正常组织 的基因表达特征。
[0492]
对每种肿瘤类型进行相关性分析并且仅考虑这样的相关性，其中对于至少50个样 品，在相同的肿瘤类型中，两种基因均表达超过0rpkm。针对相互作用蛋白质、通路 和疾病基因的富集测试这些基因表达特征。计算每个肿瘤类型的富集p值并且使用平均 log(p值)对评分的基因集进行排序。在各种癌症中观察到了淋巴细胞和t细胞的明显 特征，如图8中所示。举例来说，在蛋白质相互作用中评分最高的基因是il2，意味着 在大多数癌症中，已知与il2相互作用的基因与pvrig的相关性比偶然预期的高。进 一步分析显示，在癌组织中的pvrig表达比正常的高。虽然在图5中在大多数正常实 体组织中pvrig的中位值表达水平低于1，但在图6中在许多癌症中它明显高于1。举 例来说，当在图7中并列比较时，黑素瘤pvrig的表达高于正常皮肤(图9)。我们进 一步表征了癌症中的过表达源。pvrig在t细胞中高度表达并且与癌症中的t细胞标 志物非常相关。在图10中，pvrig与cd3、cd4和cd8的相关性显示为三个癌症类型 中的实例，即肺腺癌、结肠腺癌和黑素瘤。另外，pvrig与pd1高度相关，pd1是已 知在t细胞上表达的确认用于癌症免疫疗法的靶标(图10)。
[0493]
针对相互作用蛋白质、通路和疾病基因的富集测试这些基因表达特征。在各种癌症 中观察到了淋巴细胞和t细胞的明显特征，如图8中所示。我们进一步分析了pvrig 与
pd1的相关性并且在其于各个肿瘤中的表达之间显示出高相关性，包括乳腺、肺、胰 腺和肾脏(表2)。pd-1和pvrig均在活化的t细胞上高度表达。在癌症中，pvrig 显示与t细胞标志物的高相关性，即cd8a、cd4和cd3g(图13)。综合而言，这些 数据说明pvrig的癌症表达与肿瘤浸润性淋巴细胞相关。
[0494]
方法：基因相关性：将fpkm值变换为log2(fpkm+0.1)。关于基因中的至少一种， 值满足log2(fpkm+0.1)《log2(0.1)的样品忽略不计。计算2个列表(每个基因一个列表) 的皮尔逊相关系数(pearson correlation coefficient；pcc)和回归线的最小均方估计量。 值低于0.5的pcc以及在测试2个基因的表达水平之间的线性相关性时无法显示显著值 的pcc忽略不计。
[0495]
基因富集分析：从genego metacore(https://portal.genego)、reactome (http://www.reactome.org)和kegg通路(http://www.genome.jp/kegg)获得通路、相互 作用和疾病数据。为了鉴别在指定基因列表内富集的通路和过程，实施基于超几何的富 集分析。使用r程序(http://www.r-project.org)按以下指令计算超几何p值：phyper(x
ꢀ‑
1,m,n-m,k and lower.tail＝false)，其中x是基因列表中是通路成员的基因的数量， m是通路中的基因数量，n是所有通路中的独特基因的总数，并且k是列表中存在于至 少一个通路中的基因的数量。所得p值指示在指定基因列表的大小下特定通路偶然富集 的可能性。对基因相互作用应用相同分析程序，其中将所有与指定基因相互作用的基因 处理为通路；或对与疾病相关的基因应用相同分析程序，其中所有相关基因处理为通路。 参见图64。
[0496]
在癌症中，pvrig表达与耗竭t细胞相关。从tcga选择以下4个标志物具有高 (第4四分位数)表达的癌症样品：cd8、pd-1、tim-3和tigit。接着将癌症样品分成 高水平、无改变和低水平的4个标志物的组合表达。在任何低表达标志物(低或不具有 耗竭t细胞)中均未检测到pvrig。绝大部分与高水平耗竭t细胞相关的肿瘤表达高 水平的pvrig(图22)。
[0497]
实例1c：
[0498]
评估人类和非人类灵长类pvrig rna和蛋白质在细胞系和原代白细胞中的表达。
[0499]
方案
[0500]
工程改造过的过表达细胞的facs分析：使用以下细胞系评定抗人类pvrig抗体的 特异性：hek亲本细胞和hek hpvrig过表达细胞。在dmem(gibco)+10％胎牛血 清(gibco)+glutamax(gibco)中培养这些细胞。关于hek hpvrig过表达细胞，还 向培养基中添加0.5μg/ml嘌呤霉素(gibco)进行正选择。关于facs分析，收集所有 对数生长期的细胞系并且在96孔板中每孔接种50,000到100,000个细胞。以单点稀释 液(5μg/ml)或从30μg/ml开始的8点滴定系列在冰上添加抗人类pvrig抗体(人类 igg1，higg1)和其相应对照，持续30分钟到1小时。滴定系列按1:3或1:3.3倍连续 稀释进行。使用facs canto ii(bd生物科学(bd biosciences))采集数据并且使用flowjo (treestar)和prism(graphpad)软件分析。
[0501]
人类细胞系的facs分析：使用以下细胞系评定抗人类pvrig抗体的表达和特异性： jurkat、ca46、nk-92、ov-90、hepg2和nci-h441。在rpmi培养基+10％胎牛血清、 glutamax、非必需氨基酸(gibco)、丙酮酸钠(gibco)和青霉素/链霉素(gibco)中培 养jurkat、ca46和nci-h441细胞。在rpmi培养基+25％胎牛血清、glutamax、非必需 氨基酸、丙酮酸钠、青霉素/链霉素和500u/ml il-2(安迪生物科技公司(r&d systems)) 中培养nk-92细胞。在mcdb 105培养基(西格玛)与培养基199(西格玛)的1:1混 合物中培养ov-90细胞，mcdb 105培养
基含有最终浓度1.5g/l的碳酸氢钠(生命技 术公司(life technologies))，培养基199含有最终浓度2.2g/l的碳酸氢钠和最终浓度 15％的胎牛血清。在dmem+10％胎牛血清+glutamax中培养hepg2细胞。关于facs 分析，收集所有对数生长期的细胞系并且在96孔板中每孔接种50,000到100,000个细 胞。以单点稀释液(5μg/ml)或从30μg/ml开始的8点滴定系列在冰上添加抗人类pvrig 抗体(higg1)和其相应对照，持续30分钟到1小时。滴定系列按1:3或1:3.3倍连续 稀释进行。使用facs canto ii采集数据并且使用flowjo和prism软件分析。
[0502]
初始人类原代白细胞的facs分析：通过外周血(斯坦福血库)的ficoll(通用电 气医疗集团(ge healthcare))梯度分离获得原代白细胞。将白细胞作为经过分离的外 周血单核细胞(pbmc)于10％dmso(西格玛)、90％胎牛血清混合物中以介于1
×
107与5
×
107个细胞/毫升之间的密度冷冻在液氮中。为了评定pvrig在pbmc上的蛋白质 表达，设计针对主要免疫亚组的抗体鸡尾酒，包括人类抗pvrig抗体。以单点稀释液 (5μg/ml)或在一些情况下从10或30μg/ml开始的8点滴定系列在冰上添加抗人类 pvrig抗体(higg1)和其相应对照，持续30分钟到1小时。
[0503]
简单来说，向复苏的pbmc中添加抗体鸡尾酒混合物，以5
×
105到1
×
106个细胞/ 孔接种，然后是fc受体阻断和活/死染(aqua live/dead，生命技术公司)。将抗体鸡 尾酒与pbmc一起在冰上孵育30分钟到1小时。接着洗涤pbmc并且使用facs cantoii通过facs采集数据。使用flowjo和prism软件分析数据。所分析的免疫亚组包括 cd56暗淡nk细胞、cd56明亮nk细胞、cd4+t细胞、cd8+t细胞、非常规t细胞 (例如，nkt细胞和t细胞)、b细胞以及单核细胞。
[0504]
活化的人类效应淋巴细胞的facs分析：在一些情况下，评定pvrig在从全pbmc 分离或在全pbmc制剂中的活化的效应淋巴细胞亚组上的表达。用细胞因子的组合、抗 体和细胞因子的组合或致病性产品刺激效应淋巴细胞。pvrig在活化细胞上的表达的 facs分析按类似于上文针对初始原代白细胞所述的分析进行。
[0505]
为了研究pvrig在经过刺激的nk细胞上的表达，分离cd56+细胞并在细胞因子 的各种鸡尾酒中在nk细胞培养基(rpmi+10％胎牛血清、glutamax、青霉素/链霉素、 非必需氨基酸、丙酮酸钠和β-巯基乙醇[gibco])中培养1到3天。使用抗人类cd56+ 微珠(美天旎生物技术公司(miltenyi biotec))或人类nk细胞分离试剂盒(美天旎生 物技术公司)根据制造商的说明书分选nk细胞。用于模拟nk细胞的细胞因子的鸡尾 酒包括il-2、il-12、il-15、il-2/il-12、il-2/il-15、il-12/il-15(安迪生物科技公司)。
[0506]
为了研究pvrig在经过刺激的t细胞上的表达，使用cd4+或cd8+微珠(美天旎 生物技术公司)分离cd4+或cd8+t细胞。将分离后的细胞在各种活化条件存在下在t 细胞培养基(rpmi+10％胎牛血清、glutamax、青霉素/链霉素、非必需氨基酸、丙酮酸 钠)中培养3天。用于刺激分离后的t细胞的条件包括用il-2或驱动t细胞成为某些 表现型(例如，th1、th2、th17和t调节表现型)的细胞因子鸡尾酒进行人类戴诺磁 珠刺激(与cd3/cd28抗体偶联的珠粒，生命技术公司)。th1驱动性细胞因子是重组性 il-12(安迪生物科技公司)和抗il-4中和抗体(biolegend)。th2驱动条件是重组性il-4 (安迪生物科技公司)和抗ifn-γ中和抗体(biolegend)。th17驱动条件是重组性il-6 (安迪生物科技公司)、tgf-β(安迪生物科技公司)、il-23(安迪生物科技公司)和抗 il-4和抗ifnγ中和抗体。t调节驱动条件是重组
pvrig在cyno pbmc上的蛋白质表达，设计针对主要免疫亚组的抗体鸡尾酒，包括人 类抗pvrig抗体。以单点稀释液(5μg/ml)添加抗人类pvrig抗体(higg1)和其相 应对照。
[0514]
简单来说，向pbmc中添加抗体鸡尾酒混合物，以5
×
105到1
×
106个细胞/孔接种， 然后进行fc受体阻断和活/死染。将抗体鸡尾酒与pbmc一起在冰上孵育30分钟到1 小时。接着洗涤pbmc并且使用facs canto ii通过facs采集数据。使用prism软件 分析数据。所分析的免疫亚组包括cd16+淋巴细胞、cd14+/cd56+单核细胞/骨髓细胞 和cd3+t细胞。
[0515]
原代食蟹猴白细胞的rna表达分析：评定rna表达的原代白细胞是cd56+、cd16+ 和cd56-/cd16-亚组。使用非人类灵长类cd56和cd16正选择试剂盒根据制造商的说 明书(美天旎生物技术公司)分离细胞体。在分选之后，将细胞溶解在350μl的rlt 缓冲液中并且在使用前储存在-80℃下。
[0516]
在使用当天，使用凯杰微型试剂盒根据制造商的说明书从溶解细胞产生rna。使用 应用生物系统公司高容量cdna反转录试剂盒产生cdna。使用taqman引物和应用生 物系统公司taqman快速先进主混合物，使用cdna进行qpcr。由美国compugen公司 设计并由金斯瑞(genscript)制造用于检测cyno pvrig的两组引物。序列和引物代码 是：
[0517]
引物组1
[0518]
正向：cttgtgttcaccacctctgg
[0519]
反向：tgttctcatcgcaggaggtc
[0520]
引物组2
[0521]
正向：ttggctgtggatacctcctt
[0522]
反向：ataagggtcgtggagagcag
[0523]
β-肌动蛋白引物用于管家并且所用引物组是taqman目录号：mf04354341_g1。通过 对ct值进行定量来评定转录物的表达并且通过2
(-δδct)
法计算相对表达。还通过传统 rt-pcr使用2.5％琼脂糖凝胶对由pvrig引物和β-肌动蛋白引物产生的产物进行了大 小分析。使用应用生物系统公司step one plus仪器获得qpcr数据。
[0524]
结果
[0525]
pvrig抗体识别在过表达细胞上的pvrig：为了筛选对pvrig具有特异性的抗体， 我们评定了由噬菌体周期产生的抗体结合经过工程改造以过表达pvrig的hek细胞系 的能力。大部分来自这个周期的抗体在重新格式化为人类igg1后结合到hek hpvrig 细胞，但是亲和力不同。此外，这些抗体中的大部分还显示出与hek亲本细胞系的低 背景结合，指示针对pvrig的高特异性。图27显示了pvrig抗体的特异性的一个实 例。在这个噬菌体周期中产生的抗体与hek hpvrig细胞相对于对照的所有结合特征的 汇总呈现在图31中。
[0526]
人类pvrig rna在一系列癌细胞系中表达：为了初步筛选能够用于评定抗体的 pvrig蛋白质表达的细胞系，我们检查了如通过生物信息学评定pvrig rna高的细胞 系的癌细胞系图谱。我们发现了四个在商业上容易获得的细胞系是pvrig rna的高表 达子，我们选择它们来进行qpcr分析验证。这些细胞系是jurkat、ca46、raji和daudi。
[0527]
当进行qpcr分析时，我们检测了所有四个细胞系中的pvrig rna，与生物信息 学分析一致(图28)。作为阴性对照，我们包括了具有相对较低的pvrig rna表达的 expi细胞。
[0528]
人类pvrig rna在t细胞和nk细胞中表达：为了初步筛选亚组中如被我们的抗 体所检测的可能是pvrig蛋白质阳性的pbmc，我们分选了主要的pbmc亚组并且通 过qpcr检查
了pvrig rna表达。比较pvrig rna在cd56+nk细胞、cd4+t细胞、 cd8+t细胞和cd14+单核细胞中的水平与在jurkat、hek亲本和hek hpvrig细胞系 中的水平。如图29中所示，当针对hek gfp细胞归一化时，在cd4+t细胞、cd8+t 细胞和cd56+nk细胞中检测到了最高并且最多高50倍的pvrig rna。类似于图28， jurkat细胞也显示了阳性表达。相比之下，cd14+单核细胞相对于hek gfp细胞未显示 出更高的pvrig表达，指示非常低的pvrig rna表达。
[0529]
除了分析初始pbmc之外，还在各种刺激条件下活化选定体(效应淋巴细胞)并 且评定pvrig rna的表达。更具体来说，nk细胞用刺激细胞因子的各种组合活化， 而t细胞则在存在或不存在极化细胞因子的情况下用人类活化剂戴诺磁珠或葡萄球菌肠 毒素b(seb)进行多克隆活化(详情参见方案部分)。如图30a和b中所示，在各种 刺激条件后，在nk细胞和t细胞中的pvrig rna表达均大体上增加，增加程度取决 于个别供体。更具体来说，图30a显示了在初始的和活化的cd4 t细胞和nk细胞中的 pvrig rna表达。图30b显示在初始的和活化的cd8 t细胞中的pvrig rna表达。
[0530]
pvrig抗体最显著地识别初始的和活化的原代免疫亚组中在nk细胞上的pvrig蛋白质：在确认了初始的和活化的pbmc亚组中pvrig rna表达的rna表达模式后， 我们使用我们的pvrig抗体组来评定蛋白质表达。我们首先评定了在初始的pbmc亚 组中的pvrig表达。展示最高水平的pvrig的体是nk细胞。cd4+和cd8+t细胞 显示低水平的pvrig，而b细胞和单核细胞不具有可检测的表达。如由我们的抗体检测 到的在nk细胞和cd8+t细胞上的表达的汇总显示在图32中。其它次要亚组也展示了 pvrig表达并且包括非常规t细胞，如nkt细胞和γδt细胞。在我们所获得的和分析 的所有供体中，在pbmc亚组上的表达模式非常相似。
[0531]
当在各种刺激条件(包括多克隆模拟、细胞因子刺激和mlr)之后评定pvrig蛋 白质时，在任何pbmc亚组上都不存在稳定的pvrig上调，包括nk细胞和cd4+和 cd8+t细胞。此外，用gm-csf和il-4体外极化为树突状细胞的单核细胞不显示可检 测的pvrig表达，与在非极化的单核细胞上所看到的一致。
[0532]
通过一定比例的pvrig抗体检测细胞系上的pvrig：除了对pbmc进行pvrig 蛋白质表达筛选之外，我们还想要了解它是否也在癌细胞系上表达。使用通过rna表 达鉴别的阳性细胞株(图28)，我们选择在jurkat和ca46细胞上筛选我们的抗体，因 为它们相对于我们的管家基因显示最低的绝对ct值。我们还选择了一系列阴性细胞系 来进一步验证我们的抗体的特异性，抗体包括ov-90、nci-h441和hepg2。我们的抗 体中的一部分的确检测到了在jurkat和ca46细胞上的pvrig蛋白质表达(图31)，但 未在阴性细胞系上检测到。jurkat和ca46上的pvrig检测的实例显示在图33中，代 表性抗体为cpa.7.021。在两个细胞系中，在jurkat和ca46上的表达彼此完全符合并 且表达强度是相似的。
[0533]
pvrig抗体检测在expi细胞上瞬时表达的食蟹猴pvrig：为了评定我们的抗人类 pvrig抗体对于食蟹猴药理学研究的临床前适用性，我们想要了解我们的抗体是否能够 与食蟹猴pvrig(cpvrig)交叉反应。我们的抗体的一部分能够检测瞬时转染到expi 细胞上的cpvrig(图29)。产生阴性染的抗体(cpa.7.021)和产生阳性染的抗体 (cpa.7.024)的实例显示在图34中。
[0534]
检测在食蟹猴pbmc中的pvrig rna：在评定cyno pbmc上的pvrig蛋白质之 前，我们首先想要确定cyno pbmc亚组中的pvrig rna表达谱。因为不存在cpvrig 引物组，所以我
们设计了两组定向于cpvrig基因上的两个独特位点的引物。一个引物 组对cpvrig的x2变异体具有特异性，而另一组能够获取(pick up)x1和x2变异体。 如图35中所示，当相互比较时，两个引物组能够以类似水平检测cpvrig rna。此外， 不同于在效应淋巴细胞(nk和t细胞)中存在不同于单核细胞的独特pvrig rna特 征的人类pbmc，在来自所评定的所有供体的所有pbmc亚组中，cpvrig rna按类似 水平表达。
[0535]
食蟹猴pbmc上的pvrig蛋白质表达非常低或是阴性的：在确定了cyno pbmc的 cpvrig rna谱之后，我们使用选定的一组抗人类pvrig抗体针对cyno pbmc上的 cpvrig蛋白质的存在进行筛选。选择用来筛选pbmc的抗体是基于其结合cpvrig瞬 时细胞的能力和/或功能活性。如图36中所示，我们能够从一系列抗体检测cd16+淋巴 细胞亚组(nk细胞)上低表达水平的cpvrig，但cd3+淋巴细胞亚组(t细胞)和cd14+ cd56+骨髓亚组(单核细胞)不能。尽管存在这份数据，但是相对于对照显示阳性检测 的那些抗体(如由黑实线表示)与能够结合cpvrig瞬时细胞的那些抗体并不相关。 举例来说，cpa.7.021的染水平超过cpa.7.024，尽管前者不与cpvrig瞬时细胞结合 (参见图36)。
[0536]
总结和结论：使用抗体噬菌体平台，我们已经能够成功产生针对人类pvrig抗原 的单克隆抗体。使用经过工程改造的过表达细胞以及一系列癌细胞系，我们证明了，我 们的抗体对pvrig抗原很有特异性，并且能够检测与rna表达相关的蛋白质表达。在 人类pbmc亚组的分析之后，我们证明了，pvrig蛋白质在nk细胞上的表达是最高 的，在常规cd3+t细胞上低表达，并且在b细胞和骨髓细胞上不可检测。在这些细胞 类型暴露于各种刺激条件之后，表达无显著变化。通过评定我们的一组抗体与过表达细 胞的结合，我们还证明了这组抗体可与食蟹猴(cyno)pvrig抗原交叉反应。然而，这 组抗体与cyno pbmc的低水平结合、缺乏与rna的蛋白质相关性以及其与过表达细胞 (相比于pbmc)结合的能力的不协调的组合指示，cyno pbmc上的pvrig抗原可能非 常低/是阴性的，或相比于过表达细胞，它以一种不同的/更复杂的形式表达。
[0537]
实例1d：
[0538]
pvrig在来自健康供体的pbmc亚组中的表达：测试pvrig在来自健康供体的 pbmc亚组中的表达(设门策略显示在图1a中)。在测试样品中，pvrig显示在健康供 体pbmc(n＝5)的cd8+t细胞(数据未示出)、cd8α+γδt细胞(数据未示出)、双 阴性γδt细胞(数据未示出)上表达，并且还以较温和的程度在cd4+t细胞(数据未 示出)上表达。
[0539]
实例1e
[0540]
pvrig与pd1、tigit和hla-dr在卵巢癌腹水、mss crc的pbl中以及在静息和同种异体活化的健康pbmc中的共表达：pvrig与tigit一起在卵巢癌腹水中在 cd8+t细胞上共表达(数据未示出)。在这个样品中，观察到了与pd-1表达水平重叠 的混合pvrig表达水平。hla-dr的低水平与pvrig的低表达水平相关。在这个特定 样品中在cd4+t细胞上观察到了极低水平的pvrig，指示与pd1、tigit和hla-dr 无相关性。
[0541]
在mss crc患者的pbl中，pvrig与tigit在cd8+t细胞上共表达(数据未示 出)。在这个样品中观察到了pvrig的低表达水平，这与低水平的tigit和hla-dr相 关。来自这个患者的til具有小cd8+体，其针对表面pvrig染呈阳性，针对pd1 和tigit也呈阳性(数据未示出)。胞内染揭示了显著的pvrig染，反映了pd-1 的表达模式，显示了两个独特的体，它们是pd1-pvrig-和pd1+pvrig+(数据未示 出)。胞内pvrig+d8+t细胞似乎与hla-dr
+和tigit+较好的相关。cd4+t细胞表 面上的pvrig不可检测并且pd1+体中仅少数cd4+细胞显示阳性胞内pvrig染。 因为胞内pvrig+体极小，所以难以确定pvrig是否与tigit和hla-dr共表达。
[0542]
在健康的pbmc中，cd8 t细胞上的pvrig染反映了pd-1和tigit的表达模 式，显示了独特的pd1-pvrig-和pd1+pvrig+体以及独特的tigit-pvrig-和 tigit+pvrig+体(数据未示出)。未在cd4+细胞上检测到pvrig。有趣的是，在同 种异体活化之后，在cd4+上观察到了pvrig和pd-1的共表达(但cd8+上没有)(数 据未示出)。
[0543]
总而言之，证明了pvrig在来自卵巢癌腹水的cd8+t细胞、mss crc患者的pbl 中与tigit共表达，并且在健康供体的pbmc中与pd-1共表达，并且在来自健康供体 的同种异体活化的pbmc的cd4+t细胞中与pd1共表达。
[0544]
实例1f
[0545]
pvrig在来自健康pbmc、脐尿管癌、结肠直肠癌、卵巢癌腹水和肺癌的淋巴细胞体上的表达：结果：分析健康供体的pbmc和扁桃体中以及来自脐尿管癌、结肠直肠 癌、卵巢癌腹水、肺癌和黑素瘤的til中，pvrig在cd4+和cd8+t细胞、nk细胞 上和在cd4+和cd8+nkt细胞上的表达。
[0546]
在健康供体的pbmc(n＝5)中和在卵巢癌腹水til(n＝1)中，在nk细胞(数据 未示出)和cd8+nkt细胞(数据未示出)上检测到了高水平的pvrig表达，并且在 cd8+t细胞(数据未示出)和cd4+nkt(数据未示出)上也检测到了较低程度的表 达。在一些pbmc中，cd4+t细胞的pvrig染也呈阳性，然而表达水平非常低(数 据未示出)。
[0547]
另外，检测来自所测试的6个结肠直肠癌til中的两个结肠直肠癌til和肺癌til (n＝3)(数据未示出)的cd4+t细胞上和来自脐尿管癌til(n＝1)的nk细胞上的pvrig 表达。
[0548]
因为测试样品中缺少til，所以未在黑素瘤til中检测到pvrig表达。
[0549]
实例1g
[0550]
进行额外评估以鉴别人类和小鼠细胞系中过表达pvrig的附加组织。
[0551]
试剂：人类pvrig taqman探针(生命技术公司)hs04189293_g1，目录号4331182； 用于管家基因(hskg)的taqman探针(生命技术公司)人类rpl19 mm 01577060_gh、 人类hprt1 hs02800695_m1、人类sdha hs00417200_m1、人类pbgd hs00609296_g1 以及人类tata box hs00375874_g1。小鼠pvrig taqman探针(生命技术公司) cc70l8h、cc6rn19定制taqman探针。用于管家基因(hskg)的taqman探针(生 命技术公司)小鼠rpl19：mm02601633_g1。abi taqman快速先进主混合物，零件号 4444557，应用生物系统。来自美国典型培养物保藏中心(american type culturecollection；atcc)和细胞系服务部(cell line service；cls)的商业人类和小鼠癌细胞 系详述于表1中。用rnaeasy微型试剂盒(凯杰目录号74014)从人类和小鼠细胞系中 提取rna。使用高容量cdna反转录试剂盒(应用生物系统公司目录号4368814)产生 cdna。商业小鼠多克隆抗pvrig ab maxpab(b01)，亚诺法(abnova)，目录号 h00079037-b01，1:200稀释。小鼠igg1，生命技术公司，目录号mg100，1:200稀释。 商业小鼠多克隆抗pvrig ab，西格玛，目录号ab1407935，10μg/ml。谱纯小鼠igg， 完整分子，jackson，目录号015-000-003，10μg/ml。山羊抗小鼠-pe，jackson，目录号 115-116-146，1:100稀释。定制多克隆大鼠抗小鼠pvrig，批号20153456c.1，aldevron， 10μg/ml。定制大鼠全igg，批号gv20884.1，aldevron，10μg/ml。山羊抗大鼠-pe，jackson， 目录
号112-116-143，1:100稀释。与af647结合的抗人类pvrig-cpa.7.024migg1，10 μg/ml。与af647结合的抗人类pvrig-cpa.7.050migg1，10μg/ml。与af647结合的 抗人类pvrig-cpa.7.005migg1，10μg/ml。与af647结合的抗人类pvrig-cpa.7.002 migg1，10μg/ml。与a647结合的西那吉斯(synagis)igg1，10μg/ml。与af647结合 的抗人类pvrig-cpa.7.021migg1，10μg/ml。与a647结合的西那吉斯igg2，10μg/ml。 兔多克隆抗pvrig ab，西格玛，目录号hpa047497，1:300稀释。山羊抗兔-hrp，jackson， 目录号111-035-003，1:100稀释。vioblue，可固定的活力染450，bd生物科学，目 录号562247，1:1000稀释。人类trustain fcx，biolegend，目录号422302。大鼠抗小鼠 cd16/cd32 fc阻断，bd，目录号553142。ingenio电穿孔溶液，mirus，目录号mir50114。 on-targetplus人类pvrig sirna-smartpool，dharmacon，目录号l-032703-02。 非靶向sirna的on target plus，dharmacon，目录号d-001810-01-05。研究中所用 的人类细胞系显示在图54中。
[0552]
转录物表达.定量rt-pcr(qrt-pcr)：根据制造商的方案预先形成人类和小鼠细 胞系(上文在表1和表2中详述)的rna(1-5μg)提取。根据制造商的方案(在20μl cdna混合反应中稀释1μg rna)制备cdna。如上所述制备的cdna经过1:10稀释 (表示每反应25ng rna)，用作qrt-pcr反应的模板，使用基因特异性taqman探针(详 述于材料和方法1.1 1-4中)。使用quantstudio 12k装置进行检测。记录这样的循环，其 中反应实现了阈值荧光水平(ct＝阈值循环)，并且使用所述循环来计算rt反应中的相 对转录物数量。使用方程式q＝2^-ct计算绝对数量。所得相对数量针对管家基因、 mrpl19或hrpl19的相对数量归一化。
[0553]
通过蛋白质印迹(wb)检测蛋白质表达：使用全细胞提取物(45μg用于癌细胞系， 并且30μg用于过表达细胞系和阴性对照细胞系)，通过wb分析人类pvrig在人类细 胞系中的表达。商业兔多克隆抗人类pvrig pab，西格玛，目录号hpa047497，在5％ bsa/tbst中1:300稀释，接着是过氧化物酶结合的第二抗体山羊抗兔(jackson，目录 号111-035-003)，在5％乳tbst中1:20,000稀释。
[0554]
通过流式细胞仪(facs)分析蛋白质表达：通过facs分析pvrig蛋白质的细胞 表面表达。用在pbs中1:1000稀释过的vioblue试剂给人类或小鼠细胞系染。将细 胞在室温下孵育15分钟，并且然后用pbs洗涤一次。将用于内源性蛋白质分析的细胞 系与上文在材料部分中所列的fc受体阻断溶液(根据制造商的程序使用2.5μl/反应的 人类阻断剂和1μl/反应的小鼠阻断剂)一起预孵育。为了检测人类pvrig蛋白质，用 商业多克隆抗人类pvrig或通过稀释到浓度为10μg/ml或1:200稀释(分别针对西格 玛ab和针对mab或针对亚诺法ab)的定制单克隆抗人类pvrig mab(inc生产，详 述于上文材料和方法部分中)或相同浓度的igg1同种型对照、然后是山羊抗小鼠pe结 合抗体对细胞进行染。
[0555]
为了检测小鼠pvrig蛋白质，用稀释到浓度为10μg/ml的定制大鼠多克隆抗小鼠 pvrig pab(aldevron)或相同浓度的大鼠igg全分子作为同种型对照、然后是经过1:100 稀释的驴抗大鼠pe结合抗体对细胞进行染。
[0556]
pvrig敲低：通过sirna的瞬时转染进行内源性人类pvrig的敲低。100pmolpvrig sirna池或乱序sirna的转染通过电穿孔，使用amaxa nucleofector装置和 mirus ingenio电穿孔溶液，如上文材料和方法中所列的并且根据制造程序进行。转染 48小时后，收集细胞，通过qrt-pcr和facs进一步分析。
[0557]
结果：通过qrt-pcr，pvrig转录物在人类和小鼠细胞系中的内源性表达
[0558]
人类细胞系：为了证实人类细胞系(图54中所列)中pvrig转录物的存在，使用 如上文在材料和方法中所描述的特异性taqman探针进行qrt-pcr。如图56中所示。 使用taqman探针hs04189293_g1，在jurkat(a、b)、hut78(a、b)和hl60(b) 细胞系中观察到了相对较高水平的人类pvrig转录物。在thp1、rpmi8226(b)细胞 系中观察到了较低的转录物水平。所有其它细胞系显示极低的转录物或没有转录物。
[0559]
通过qrt-pcr，pvrig转录物在小鼠细胞系中的内源性表达：为了证实小鼠细胞 系(图55中所列)中pvrig转录物的存在，使用如上文在材料和方法中所述的特异性 taqman探针进行qrt-pcr。如图57中所示，使用taqman探针cc70l8h，在nih/3t3、 renca、sai/n和j774a.1(a)细胞系中观察到了相对较高水平的小鼠pvrig转录物。 在ct26(a)和b-104-1-1(b)细胞系中观察到了较低的转录物水平。所有其它细胞系 显示极低的转录物。
[0560]
通过wb，pvrig蛋白质在人类细胞系中的内源性表达：使用如上文在材料和方法 中所述的商业抗人类pvrig pab(西格玛，hpa047497)，对如图54中详述的各种人类 癌细胞系溶解产物进行pvrig蛋白质内源性表达的wb分析。作为阳性对照，使用过 表达pvrig的稳定hek293细胞池的全细胞提取物，而经过空载体转染的细胞充当阴 性对照。如图58中所示。在阳性对照hek293过表达细胞(泳道2)中以及在jurkat 细胞系(泳道3)中检测到了对应于约35kd的蛋白质条带。在充当阴性对照的空载体 细胞(泳道1)中和在zr75-1人类细胞系(泳道4)中均未检测到人类pvrig的表达。
[0561]
通过facs，pvrig蛋白质在人类和小鼠细胞系中的内源性表达：
[0562]
人类细胞系：为了证实人类pvrig的细胞表面内源性表达，如上文在材料和方法 中所述测试各种人类细胞系(详述于图54中)。用商业抗体(亚诺法)或用同种型对照、 然后是第二山羊抗小鼠pe ab对细胞系进行染。通过facs进行分析。相比于同种型 对照结合，在jurkat人类癌细胞系中观察到了亚诺法抗体的结合。在所测试的其它细胞 系中未观察到亚诺法抗体的结合：关于capan2和zr75-1相比于同种型对照结合，使用 西格玛商业抗体对各种人类细胞系(jurkat、hut78、karpas299和nk-yts)进行额外 facs分析，仅在jurkat细胞中观察到结合，但其它细胞系未观察到结合(数据未示出)。
[0563]
通过测试本发明的各种单克隆抗体的结合，对人类pvrig在jurkat细胞系中的内 源性确认进行进一步分析。用五个与af647结合的抗人类pvrig定制mab(cpa.7.024、 cpa.7.050、cpa.7.005、cpa.7.002和cpa.7.021)或用与af647结合的相对同种型对照 抗体对jurkat细胞系进行染。通过facs进行分析。相比于同种型对照表达，仅通过 cpa.7.021和cpa.7.050在jurkat人类细胞系中观察到了人类pvrig的表达。通过使用 其它三个mab，在jurkat细胞系中未观察到人类pvrig的结合。
[0564]
小鼠细胞系：为了证实小鼠pvrig的细胞表面内源性表达，如上文材料和方法中 所述测试各种小鼠细胞系：j774a.1、nih/3t3、sai/n和renca(详述于图55中)。用定 制多克隆大鼠抗小鼠pvrig ab(aldevron)或用同种型对照(aldevron)，然后是第二 山羊抗大鼠pe ab对细胞系进行染。通过facs进行分析。通过aldevron多克隆ab， 在任何所测试的小鼠细胞系中均未观察到小鼠pvrig蛋白质的结合(数据未示出)。
[0565]
人类细胞系中的人类pvrig的敲低：为了进一步证实pvrig蛋白质在jurkat细胞 系中的内源性表达，如材料和方法中所述，使用人类pvrig sirna池进行敲低。sirna 转染48小时后，收集细胞，通过qrt-pcr和facs进一步分析。
[0566]
通过qpcr测试人类细胞系中的人类pvrig的敲低：如材料和方法中所述，通过 qrt-pcr分析，如图59中所示，经过人类pvrig sirna池转染的jurkat细胞中的人类 pvrig转录物水平(右侧直方图条柱)相比于经过乱序sirna转染的细胞(左侧直方 图条柱)显著降低。
[0567]
通过facs，所测试的人类细胞系中的人类pvrig的敲低：通过facs进一步分析 相同的sirna转染细胞中的人类pvrig膜表达。如图60中所示，人类pvrig蛋白质 的膜表达在经过pvrig sirna转染的细胞(绿的cpa.7.021mab或红的西格玛ab) 中相比于经过乱序sirna转染的细胞(橙)降低。通过使用西格玛ab，jurkat细胞 系中的倍数变化(抗pvrig对比同种型对照)从8倍降到3.3倍，或通过使用cpa.7.021 mab，从15.3倍降到2.8倍。
[0568]
此报告包括关于在人类和小鼠细胞系中在rna水平上和在蛋白质水平上的pvrig 于细胞系中的内源性表达的初始数据。
[0569]
通过qrt-pcr、wb和facs测试各种人类癌细胞系的pvrig内源性表达。
[0570]
通过使用商业多克隆ab(西格玛和亚诺法)和小鼠单克隆ab(inc)，在jurkat细 胞系中观察到了人类pvrig的细胞表面表达，如分别在图4a和图4b中所示。这些观 察结果与如图1a和b中所示的rna转录水平和如图3中所示的wb结果相关。
[0571]
通过敲低实验额外确认jurkat细胞系中的内源性人类pvrig，确认rna转录物在 pvrig sirna转染之后明显减少，如图5中所示，并且还通过商业ab和通过单克隆 ab观察到jurkat细胞系中的蛋白质细胞表面表达降低，如图6中所示。
[0572]
通过qrt-pcr和facs测试各种小鼠细胞系的pvrig内源性表达。在转录水平上， 在j774a.1、nih/3t3、sai/n和renca细胞系中观察到pvrig的存在，如图2a和b中 所示。但是在由多克隆ab(aldevron)检测的这些所测试的细胞系中未观察到小鼠pvrig 的膜表达(数据未示出)。图61和图62指示这份报告中所述的发现的汇总，突出了通 过敲低确认显示出qpcr与facs之间的相关性的细胞系。
[0573]
实例1h
[0574]
本实验的目的是评估pvrig蛋白质在从人类黑素瘤样品分离并且在存在黑素瘤特 异性抗原和il2的情况下繁殖的静息的或活化的人类(肿瘤浸润性淋巴细胞)til上的 表达。产生针对人类pvrig的胞外结构域(ecd)的人类mab。这些ab直接用alexaflour 647标记，以便通过facs分析检查pvrig在细胞上的表达。
[0575]
材料和方法
[0576]
til：在这个实验系列中，使用来自从三名黑素瘤患者切除的转移瘤的三个不同的 肿瘤浸润性淋巴细胞(til)：1)til-412-hla-a2-mart1特异性；2)til-f4-hla-a2-gp100 特异性；以及3)til-209-hla-a2-gp100特异性。在实验开始之前，使人类til(》90％ cd8+)解冻24小时。在12ml补充有300u/ml的rhil2(biolegend 509129)的til培 养基(imdm+10％人类血清+1％glutamax+1％丙酮酸钠+1％非必需氨基酸+1％青霉素
‑ꢀ
链霉素)中解冻细胞。使细胞从冷冻中恢复24小时。
[0577]
分析条件：在恢复之后，在四种不同条件下测试til：1)静息，采用300u/ml的 il2(biolegend目录号589106)；2)t细胞的多克隆活化，使用1μg/ml的板结合抗cd3 抗体(ebioscience克隆okt3，目录号16-0037-85)+2μg/ml的抗cd28抗体(ebioscience 克隆cd28.2目录号16-0289-85)+300u/ml的il2。3)与mel888(lims id:cl-216) 黑素瘤细胞
(hla-a2阴性)共培养(1:1)和4)与mel624(lims id cl-218)黑素瘤 细胞(hla-a2+mart1/gp100阳性)共培养(1:1)。
[0578]
在静息/活化/共培养12小时之后，通过facs测试细胞的pvrig表达以及pvrig 通路的其它成员和其它表面标志物的表达。
[0579]
染细胞：12小时后收集细胞并用pbs洗涤两次。在室温下用补充有1/1000的可 固定活力染efluor 450(bd horizon目录号562247)的pbs给细胞染20分钟。在 染之后，用pbs洗涤细胞两次，并在冰上用补充有1/25的人类truestain fc阻断液 (biolegend，422302)的facs缓冲液(pbs+0.5％bsa+2mm edta+0.05％叠氮化 物)染15分钟。在fc阻断之后，在冰上用ab给细胞染30分钟并且浓度列于表1 中。
[0580][0581][0582]
在染之后，将细胞洗涤一次并且再悬浮于facs缓冲液中进行分析。使用补偿珠 粒(bd，552843)进行补偿校正。用以上抗体给一个珠粒染30分钟。用与细胞染 相同的浓度进行珠粒染。在珠粒染之后，在macsquant facs机器上根据标准程序 进行补偿。在macsquant分析仪(美天旎)上采集所有样品并且使用tree star flowjo 软件(v10.0.8)分析数据。
[0583]
pvrig在人类静息til上表达：将静息til与单独的300u/ml的il2培养12小时， 针对pvrig表达进行染并且通过facs分析。til的设门策略：首先根据fcs:ssc 图中的大小和粒度对淋巴细胞设门，然后根据fsc-h和fsc-a对单一细胞设门，然后 根据vioblue:fsc图中的活力染料染对活细胞设门，然后根据cd8:fsc图中的cd8 染对cd8
+
细胞设门。然后根据pvrig染在直方图中绘制pvrig的表达水平。
[0584]
人类til上的pvrig表达在用抗cd3 ab+抗cd28 ab活化后下调：将人类til与 抗cd3 ab+抗cd28 ab+il2培养12小时，针对pvrig表达进行染并且通过facs 分析。相比于静息til，所检查的所有三个til的表面上的pvrig表达都在活化后下调 (数据未示出)。
[0585]
人类til上的pvrig表达在与mel888共培养后略微下调：将人类til与mel888 细胞共培养12小时，针对pvrig表达进行染并且通过facs分析。相比于静息til， 所检查的所有三个til的表面上的pvrig表达都在与mel888共培养后略微下调。
[0586]
人类til上的pvrig表达在与mel624共培养后下调：将人类til与mel624细胞 共培养12小时，针对pvrig表达进行染并且通过facs分析。相比于静息til，所 检查的所有三个til的表面上的pvrig表达都在与mel624共培养后略微下调。
[0587]
其它通路成员在静息til上的表达：将人类til单独与il2共培养12小时，针对 cd96、pvr、pvrl2、tigit和dnam1的表达进行染并且通过facs分析。cd96、 tigit和dnam1在所检查的所有三个til上表达。pvr也在所有三个til的表面上表 达，但是表达水平相对较低。未在任何til上检测到pvrl2。
[0588]
其它通路成员在经过抗cd3 ab和抗cd28 ab活化的til上的表达：将人类til与 抗cd3 ab和抗cd28 ab培养12小时，针对cd96、pvr、pvrl2、tigit和dnam1 的表达进行染并且通过facs分析。在用抗cd3 ab+抗cd28 ab活化后，cd96下调， pvr略微上调，tigit略微上调并且dnam1也上调。
[0589]
其它通路成员在与mel888共培养的til上的表达：将人类til与mel888细胞共培 养12小时，针对cd96、pvr、pvrl2、tigit和dnam1的表达进行染并且通过facs 分析。在与mel888共培养后，cd96下调，pvr高度上调，tigit和dnam1下调，pvrl2 也略微被诱导。
[0590]
其它通路成员在与mel624共培养的til上的表达：将人类til与mel624细胞共培 养12小时，针对cd96、pvr、pvrl2、tigit和dnam1的表达进行染并且通过facs 分析。根据图1执行设门策略。在与mel624共培养后，cd96下调，pvr高度上调， tigit稳定或略微上调，dnam1下调并且pvrl2略微被诱导。
[0591]
pd1在til上的表达：将人类til单独与il2培养12小时或用抗cd3 ab+抗cd28 ab活化或与mel888或与mel624细胞共培养，针对pd1的表达进行染并且通过facs 分析。如在图16和图17中可以看出，pd1仅在静息til412上表达。发现在与mel888 共培养后pd1表达无变化。但是，在与mel624共培养后或在用抗cd3 ab+抗cd28 ab 活化后，所有三个til中的pd1皆上调。
[0592]
总结和结论：针对所测试的所有til：
[0593]
●
抗pvrig-cpa.7.021ab染til(高达2.6倍)
[0594]
●
在用抗cd3 ab+抗cd28 ab活化12小时后或在与mel624共培养后，pvrig 表达下调(几乎下调到背景水平)。
[0595]
●
静息til表达cd96、tigit和dnam1(分别高达35、12和79倍)
[0596]
●
在活化或与不相关的(hla-a2-)黑素瘤共培养后，cd96表达下调(从高达35 倍到约11倍)
[0597]
●
在用αcd3/cd28 ab活化后，dnam1表达上调(从高达79倍到102倍)，但是 在til与mel共培养后剧烈下调(低至8倍)。
[0598]
●
在til与mel888细胞系共培养后，tigit表达略微下调，并且在与mel624共培 养或用抗cd3 ab+抗cd28 ab活化后，稳定且略微上调。
[0599]
●
pd1表达在活化后上调(从0到18倍)
[0600]
●
在til与黑素瘤共培养后检测到高水平的pvr(从《2倍到18倍)。
[0601]
静息til-412显示pd1阳性染。til-f4对pd1也略呈阳性，然而til-209是阴 性的。在不同条件下测试的所有参数的表达水平的改变的汇总可见于表2中。
[0602]
表2：
[0603] +il2+αcd3+αcd28+il2+mel888+mel624pvrig1.4-2.60-121.3-1.70-1.2cd9623-3512.7-1611.7-17.611.1-16.6
8倍)高于cd4+细胞(3倍)，并且在活化后表达减弱(图71a、b和c)。在活 化的第3到6天，在cd8+(4-5倍)和cd4+(2-3倍)t细胞上的pvrig表达增加， 如在图71中可以看到。
[0620]
另外，也在mart1和209静息til上观察到了pvrig表达，并且在活化后表达降 低(图72a、b和c)。在活化的第3到6天，pvrig表达相比于活化的第1到2天增 加，如在图72中可以看到。
[0621]
实例2：表达pvrig的稳定转染细胞池的产生和表征
[0622]
产生过表达pvrig人类和小鼠蛋白质的重组性稳定细胞系池，将其用于测定pvrig 对免疫的影响、用于pvrig表征并且用于鉴别基于pvrig的免疫调节剂。
[0623]
材料和方法：
[0624]
试剂：dna构建体：
[0625]
人类pvrig flag puc57
[0626]
人类pvrig flag pcdna3.1
[0627]
人类pvrig flag pmscv
[0628]
重组细胞：
[0629]
hek293 pcdna3.1人类pvrig flag
[0630]
hek293 pmscv人类pvrig flag
[0631]
商业抗体：
[0632]
抗pvrig，西格玛目录号hpa047497，兔多克隆
[0633]
抗pvrig，亚诺法目录号h00079037，b01-小鼠多克隆
[0634]
使用pcr反应并且对pcr产物测序来进行小鼠pvrig的全长验证。
[0635]
使用三对引物(表3)。
[0636]
表3：用于小鼠全长验证的引物的序列
[0637][0638]
作为pcr反应的模板，使用nih 3t3细胞系的cdna或三组商业cdna的混合物：
[0639]
1.第i组cdna，小鼠，biochain，目录号c8334501(心脏、脑、肾脏、肝脏)。
[0640]
2.第ii组cdna，小鼠，biochain，目录号c8334502(肺、胰腺、脾脏、骨骼肌)。
[0641]
3.cdna，clontech，目录号637301(脑、心脏、第7天胚胎、睾丸、脾脏)。
[0642]
表达构建体
[0643]
通过基因合成(金斯瑞)进行人类和小鼠pvrig-flag的全长克隆，在puc57载体 中
稀释过的可固定的活力染450(bd，562247)将1
×
105个细胞在室温下染10分钟。 然后向细胞中添加经过1:200稀释的小鼠多克隆抗pvrig(亚诺法，目录号 h00079037-b01)或小鼠igg1同种型对照(生命技术公司)，然后用山羊抗小鼠-pe (jackson，目录号115-116-146)染。
[0667]
过表达人类pvrig-flag蛋白质的hek293稳定池细胞的表达验证结果
[0668]
为了证实pvrig蛋白质在稳定转染的hek293细胞池中的表达，如材料和方法中 所述，使用抗flag抗体或抗pvrig抗体(亚诺法)，通过蛋白质印迹分析全细胞提取物。 图24中所示的结果展示了对应于表达人类pvrig的hek293细胞池的提取物中预期约 33kda的蛋白质大小的条带，但在经过空载体转染的细胞中没有。
[0669]
为了证实pvrig蛋白质的细胞表面表达，如材料和方法中所述，使用小鼠抗pvrigpab(亚诺法)，通过facs分析过表达pvrig-flag pcdna3.1载体的经过稳定转染的 hek293细胞。图25中所呈现的结果显示，小鼠抗pvrig pab与稳定地表达人类 pvrig-flag的细胞(灰)的结合高于经过空载体转染的细胞(浅灰)所观察到的。
[0670]
实例3：pvrig-ecd ig融合蛋白产生
[0671]
pvrig mecd-mig融合蛋白(参见图103)由小鼠pvrig的ecd融合小鼠igg2a 的fc组成，在probiogen(德国)在cho-dg44细胞中通过培养稳定细胞池12天，然 后对所收集的细胞进行蛋白a纯化和制备型sec纯化以去除聚集体而产生。在5mm柠 檬酸钠、5mm磷酸钠/钾、140mm nacl、0.01％吐温(tween)ph 5.5中配制最终产物。
[0672]
所用表达载体是probiogen的pbg-gpex6。先后通过cmv/ef1混合启动子、多腺 苷酸化信号pa-1驱动pvrig基因。载体含有允许使用嘌呤霉素选择转染后细胞的嘌呤 霉素n-乙酰基-转移酶基因，以及允许使用甲氨蝶呤(methotrexate)(mtx)选择转染 后细胞的二氢叶酸还原酶基因。
[0673]
pvrig hecd-hig融合蛋白(参见图103)由人类pvrig的ecd融合人类igg1的 fc组成，在铰链处含c220、c226和c229的s突变，在金斯瑞(中国)通过在cho-3e7 细胞中瞬时转染，培养6天，然后对所收集的细胞进行蛋白a纯化而产生。在pbs ph 7.2 中配制最终产物。
[0674]
所用表达载体是哺乳动物表达载体ptt5，其中由cmv启动子驱动pvrig基因。
[0675]
实例4：pvrig在人类pbl上的表达和pvrig-fc与黑素瘤细胞系的结合
[0676]
pvrig是一种新颖的免疫检查点蛋白质，不希望因为单一的理论功能将它限制为t 细胞上的cd28样受体。在本研究中，评估了pvrig在人类外周血淋巴细胞上的表达和 pvrig-ecd-ig(由人类pvrig的胞外结构域融合人类igg1组成)与黑素瘤细胞系的 结合。
[0677]
材料和方法
[0678]
使用在hla-a2情况下呈递mart-1抗原的三个人类黑素瘤细胞系(sk-mel-23、 mel-624和mel-624.38)作为ctl的靶标。不表达hla-a2的mel-888充当阴性对照。
[0679]
从tel hashomer血库获得来自健康的人类供体的血块黄层(buffy coat)。用pha刺 激外周血单核细胞并且培养3天，并且随后用基于mscv的反转录病毒载体(pmsgv1) 转导。在转导之后，使细胞在淋巴细胞培养基(生物靶向(bio target)培养基，胎牛血 清(10％)、l谷氨酰胺青霉素/链霉素(100个单位/毫升)、il-2 300iu)中再另外生长 5天。
[0680]
为了评估pbl上的pvrig表达，用5μg/ml pvrig特异性抗体(小鼠多克隆)在 4度下给细胞染30分钟。在洗涤之后，用facs缓冲液中的fitc结合的山羊抗小鼠 mab(1:250)
(英杰，目录号a10667)在暗处在4度下给细胞染30分钟。在facs 缓冲液中洗涤两次之后，在带有cytek hts的bd生物科学facs calibur上读取样品。
[0681]
为了评估pvrig-ig与黑素瘤细胞系的结合，将sk-mel-23、mel-624、mel-624.38 和mel-888细胞与经过f4转导或未经过转导(表示为w/o)的pbl共培养，并且随后 用20μg/ml的融合蛋白pvrig-ig hh批号125染。在facs缓冲液中洗涤两次之后， 用第二山羊抗人类pe(jackson，目录号109-116-098)给样品染。
[0682]
结果
[0683]
为了评估pvrig在原代人类白细胞上的内源性表达，用pha刺激pbl并且随后用 空载体转导，并用抗pvrig特异性抗体染。如图11中所示，在两个不同供体中，相 对于同种型匹配对照观察到抗pvrig的染。
[0684]
为了评估pvrig在黑素瘤细胞系上的内源性表达和判定内源性表达是否受与抗原 特异性t细胞共培养的影响，将4个不同的黑素瘤细胞系(sk-mel-23、mel-624、 mel-624.38和mel-888)与表达或不表达f4(gp100特异性tcr)的pbl共培养。随后 用融合蛋白给细胞染，融合蛋白由人类pvrig的胞外结构域融合人类igg1的fc部 分组成。如图12中所示，所测试的所有4个人类黑素瘤细胞系都展现与pvrig-ig的结 合。在与黑素瘤反应性工程改造t细胞共培养之后，结合强度不受t细胞依赖性活化的 影响。
[0685]
总结：本文中呈现的结果表明，pvrig在pha活化的人类原代外周血白细胞(pbl) 上表达。另外，在本研究中测试的4个黑素瘤细胞系与由人类pvrig的胞外结构域融 合人类igg1的fc部分组成的融合蛋白结合，表明这些细胞系表达pvrig的对应物。
[0686]
实例5：受体配体鉴别和验证
[0687]
使用细胞微阵列技术进行第一验证研究，细胞微阵列技术是用于筛选pvrig与3559 个分别在人类hek293细胞中表达的全长人类质膜蛋白的相互作用。
[0688]
使人类hek293细胞在用编码3559个全长人类膜蛋白的表达载体点样的载玻片上 生长。将表达载体(pires-hegfr-ires-zsgreen1)一式四份地点样在每一个载玻片上， 并且用于确保在每一个载玻片上实现或超过转染效率的最小阈值。人类hek293细胞用 于反向转染/表达。在细胞固定之后，将由pvrig的ecd融合人类igg1组成的融合蛋 白以20μg/ml添加到每个载玻片上。通过使用恰当的荧光第二抗体进行结合检测。筛选 两个重复的载玻片组。使用imagequant软件(ge)分析和定量(针对转染效率)荧光 图像。
[0689]
蛋白质
‘
命中(hit)’定义为相比于背景水平显示出增加的信号的一式两份的点。这 使用在imagequant软件上网格化的图像通过目视检查实现。取决于一式两份点的强度， 命中分为
‘
强、中等、弱或非常弱’。为了确认命中，将所有编码在初步筛选中鉴别的命 中的载体排列在新载片上。除了还用恰当的阴性对照探测相同载片之外，像初步筛选(每 样品n＝2个复制载片)一样进行确认/特异性筛选和分析。另外，对所有编码命中的载体 进行测序。编码每一个初步命中的载体经过测序确认其同一性。
[0690]
背景筛选显示在2、5和20μg/ml下与未转染的hek293细胞的结合可忽略(图13)。 基于背景数据，选择20μg/ml用于完全图谱分析。初步筛选产生多个一式两份命中(克 隆)，大部分的强度是弱的或非常弱。将所鉴别的所有初步命中和对照egfr-zsgreen1 载体一式两份地点样和重新表达，并且用20μg/ml pvrig探测以进行确认/特异性筛选。
[0691]
鉴别到强度很强的单一特异性命中pvrl2(图14)。另一个弱命中mag稍后显示 也
结合所测试的其它融合蛋白(数据未示出)，由此说明它不是特异性的。这些结果与 g.quinones最近在《新技术和新领域(new technologies&frontlers)》中公开的摘要 https://www.yumpu/en/document/view/7263720/sunday-december-4-late-abstracts-1
‑ꢀ
molecular-biology-of-the-/133一致。已知pvrl2是用作tigit和dnam1的配体，tigit 和dnam1是t细胞和nk细胞活化的调节因子。最近报导tigit在针对肿瘤细胞的免 疫反应的抑制中起关键作用(noa stanietsky,《免疫学杂志(journal of immunology)》, 第106卷第42期,17858-17863；robert j johnston,《癌细胞(cancer cell)》,第26卷, 第6期,第923-937页,2014年12月8日)。实例5中呈现的结果显示pvrig与和tigit 相同的对应物的相互作用，表明pvrig参与了调节癌症免疫监视的重要调节通路并且 因此确定了pvrig作为潜在的癌症靶标。
[0692]
额外验证研究2
[0693]
材料和方法
[0694]
材料
[0695]
fc融合蛋白、his标记的蛋白质和对照ig：使用fc融合蛋白pvrig-fc m:m进行 结合研究。使用小鼠igg2a作为同种型对照。研究中所用的其它商业小鼠蛋白质是 pvrl2-his(r&d，3869-n2)和pvrl2-his(北京义翘神州生物科技有限公司(sinobiological)，50318-m08h)。
[0696]
细胞：产生hek293过表达(ox)小鼠pvrig和pvrig-flag(分别是rc-287 和rc-286)，并且比较pvrl2与这些细胞和表达空载体(ev)的hek293细胞(rc-83) 的结合。产生hek293 ox小鼠pvrl2剪接变异体1和2(sv1和sv2)(分别是rc-334 和rc-335)，并且比较pvrig与这些细胞和表达ev的hek293细胞的结合。还使用了 b16-f10细胞(cl-161，内源性表达mpvrl2的小鼠皮肤黑素瘤细胞)来研究pvrig 与pvrl2之间的相互作用。
[0697]
抗体：使用抗小鼠pvrl2-pe ab(r&d，fab3869p，25μg/ml，1:100)检测pvrl2。 使用大鼠igg2a-pe(r&d，ic006p，25μg/ml，1:100)作为同种型对照。使用抗小鼠 pe(jackson immunoresearch，115-115-206，0.5mg/ml，1:200)和抗his ab(艾碧康 (abcam)，ab72467，0.1mg/ml，1:300)检测重组蛋白的结合。使用抗dykddddk tag (抗flag)ab(biolegend，637302，0.5mg/ml，1:300)检测hek293 ox小鼠pvrig-flag 上的pvrig表达。关于pvrig标记，根据制造商的方案使用alexa647抗体标 记试剂盒(分子探针公司(molecular probes)，a-20186)。关于pvrig的生物素化，根 据制造商的方案使用dsb-x
tm
生物素蛋白质标记试剂盒(分子探针公司，d-20655)。通 过抗生蛋白链菌素-pe(sa-pe)(jackson immunoresearch，016-110-084，0.5mg/ml，1:300) 检测生物素标记的pvrig。
[0698]
方法
[0699]
与过表达(ox)小鼠pvrl2的稳定hek293细胞或与b16-f10细胞结合的小鼠pvrig-fc的facs分析：将hek293细胞ox pvrl2(sv1或sv2)或b16-f10细胞按 106个细胞/毫升悬浮于pbs中。关于每1ml细胞，添加1μl的活力染储备溶液(bdhorizon可固定的活力染450，目录号562247，bd生物科学)。将细胞在室温下避光 孵育10分钟。然后将细胞用pbs洗涤两次，并且在室温下，在存在1:50人类trustainfcxtm(biolegend 422302)的情况下，在facs缓冲液(补充有2％fbs和0.5mm edta 的pbs)中按3
×
106个细胞/毫升悬浮15分钟以阻断fcγ-受体。然后不经过洗涤就在96 孔v形板(costar#3357)中涂铺1
×
105个细胞/孔。通
fc与小鼠his标记的pvrl2之间的相互作用，将两种蛋白质均固定到biacore 芯片。在固定之后，两种蛋白质以及pvrig-fc(数据未示出)作为分析物按以下三个 浓度操作：2500、500和100nm(pvrig批号480和pvrl2作为分析物操作两次)。 在两个方向上并且用两批pvrig检测两个蛋白质之间的相互作用(数据未示出)。因为 复杂的动力学，所以可能无法从biacore结果确定准确的kd。
[0706]
小鼠pvrig与hek293细胞ox pvrl2 sv2和b16-f10细胞的剂量反应结合：如 上文所示，小鼠pvrl2与小鼠pvrig ox细胞的结合相对较低。为了建立能够阻断小 鼠pvrig与小鼠pvrl2之间的相互作用的抗小鼠pvrig抗体的筛选方法，选择 pvrig-fc与pvrl2 ox细胞的结合。首先，产生小鼠igg2a和小鼠pvrig-fc与细胞 ox小鼠pvrl2的剂量反应结合曲线，并且与表达空载体(ev)的细胞进行比较。在 从50μg/ml到0.1μg/ml的两倍连续稀释液(1:2)中进行剂量反应。虽然未观察到小鼠 igg2a结合差异(数据未示出)，但是pvrig-fc显示在12.5μg/ml下结合饱和并且结合 减少与蛋白质浓度降低相关(数据未示出)。在pvrig-fc的情况下也获得了类似的结果 (数据未示出)。这些结果表明，可以考虑这个结合分析用于筛选阻断抗体。
[0707]
为了还考虑到用于筛选抗小鼠pvrig抗体的内源性系统，使用抗pvrl2抗体评定 pvrl2在b16-f10细胞上的表达。结果显示，pvrl2在b16-f10细胞上高度表达(数 据未示出)。因此，关于小鼠igg2a和小鼠pvrig-fc与b16-f10细胞的结合，也产生 了类似的剂量反应结合曲线。类似于用hek293细胞ox pvrl2获得的结果，小鼠pvrig-fc显示与b16-f10细胞的剂量反应结合，在12.5μg/ml下达到饱和，但是未检 测到小鼠igg2a的结合变化(数据未示出)。
[0708]
讨论和结论：在retrogenix使用细胞微阵列技术鉴别人类pvrig与人类pvrl2的 相互作用。为了验证小鼠中也有这种相互作用，采取若干途径。这些途径包括使用pvrig 或pvrl2 ox细胞，和使用spr-biacore进行生物物理学测量。所有途径都指示，小鼠 pvrig与小鼠pvrl2相互作用。然而，相比于pvrig与细胞ox pvrl2的结合，小 鼠pvrl2与细胞ox pvrig的结合相对较低。其原因可能是以下事实：商业pvrl2仅 可作为单体his标记的蛋白质而不是作为fc融合的蛋白质(如用于pvrig)获得。为 此目的，在金斯瑞产生定制的fc融合的小鼠pvrl2。然而，根据初始数据，用这种蛋 白质仅观察到微小的结合增加(约5倍，相比于pvrl2-his的2-3倍)。因此，一些其 它因素可能影响这相对较低的结合。
[0709]
因为pvrl2与细胞ox pvrig的结合低，所以决定使用与细胞ox pvrl2结合的 pvrig-fc建立抗pvrig抗体阻断分析。根据所观察到的剂量反应曲线，我们建议三种 工作浓度：0.1、0.2和0.4μg/ml。根据用pvrig与内源性表达b16-f10细胞的pvrl2 的结合获得的类似结果，我们建议还按以下浓度对这些细胞进行抗体阻断分析：0.2、0.4、 0.8μg/ml。
[0710]
pvrig是假定受体，因此，抗体阻断分析优选应该采用pvrl2作为可溶性蛋白质 并采用在细胞上表达的pvrig进行。因此，应该考虑检查在当前形式下也在这个体系 中展现阻断活性的抗小鼠pvrig抗体。
[0711]
额外验证研究3
[0712]
本研究的目标是证实配偶体pvrig的结合伴侣，一种新颖的免疫肿瘤学靶标。初 步研究指示，这些配体之一是pvrl2。在本研究中，已通过elisa研究了重组性pvrig 蛋白质与pvrig轴中若干潜在配体的结合。
[0713]
方案
[0714]
试剂列表：关于pvrig蛋白质的当前文献指出，存在三种潜在的配体：pvr (cd155)、pvrl2(cd112)和pvrl3(cd113)。为了研究其结合pvrig受体的能力， 如下从商业上获得这三种配体：pvr和pvrl3来自北京义翘神州生物科技有限公司， 并且pvrl2来自安迪生物科技公司和北京义翘神州生物科技有限公司。在compugen 按pvrig胞外结构域(ecd)融合人类igg1 fc结构域(pvrighh)产生人类pvrig 重组蛋白。
[0715]
用于测定受体-配体相互作用的elisa：将从商业上获得的his标记的配体pvr、pvrl2和pvrl3涂布在高结合eia/ria板(costar 9018)的孔中，在4℃下过夜。包 括不相关的his标记的蛋白质作为阴性对照。将涂布后的板孔用pbs冲洗两次并且与 300μl阻断缓冲液(5％脱脂奶粉，于pbs中，ph 7.4)一起在室温(rt)下孵育1小 时。去除阻断缓冲液并且再用pbs冲洗培养板两次。将板结合的配体与不同浓度的 pvrighh溶液(线性范围是0.1μg/ml到4μg/ml，体积是50μl/孔)一起在室温下孵 育1小时。将培养板用pbs-t(pbs 7.4，0.05％吐温20)洗涤三次，接着用pbs洗涤三 次，并且添加50μl/孔的hrp结合的第二抗体(人类igg fc结构域特异性，jacksonimmunoresearch)。将此在室温下孵育1小时并再次洗涤培养板。通过添加50μl的 sureblue tmb底物(kpl公司)并且孵育5-20分钟，在所有孔中产生elisa信号。通 过添加50μl 2n h2so4(vwr)停止hrp反应并且在spectramax(分子仪器公司 (molecular devices))或envision(珀金埃尔默(perkinelmer))分光光度计上读取450 nm下的吸光度信号。将数据导出到excel(微软(microsoft))中并在graphpad prism (graphpad软件公司)中绘成图。
[0716]
结果：pvrig优选结合到pvrl2：分析人类pvrig fc-融合蛋白与固定在eia/ria 板上的pvr、pvrl2和pvrl3的结合。将溶液相中不同浓度的受体pvrig与固定的 配体一起孵育。数据清楚地示出了pvrighh与pvrl2的剂量依赖性结合，但不与配 体pvr、pvrl3或阴性对照蛋白质结合(数据未示出)。使用一个位点结合方程，绘制 elisa a450信号随受体浓度而变的图，显示平衡结合常数(kd)是13
±
1nm。
[0717]
总结和结论：pvrig是生物学尚未充分了解的新颖的免疫肿瘤学靶标。在致力于弄 清此生物学的过程中，我们检查了其与若干潜在配体的结合。清楚地鉴别到pvrl2为 pvrig的结合伴侣。定量分析表明这种相互作用非常强，kd是13
±
1nm。我们的结果 还表明，人类pvrig不结合人类pvr和pvrl3，或所述结合太弱以致于elisa检测 不到。
[0718]
额外验证研究4：
[0719]
在本实例中，评估了在同种异体活化前后在pbmc细胞亚组上的pvrig表达。在 同种异体活化之后，pvrig在cd4+t细胞上以及在cd8+t细胞和双阴性γδt细胞上 的表达上调。在所测试的两个供体中的一个的pbmc中观察到了这种上调(参见图52)。
[0720]
实例6与pvrig、dnam和tigit结合的pvr、pvrl2和pvrl3的表面等离子共 振研究
[0721]
材料和方法
[0722]
所有实验全都使用proteon xpr 36仪器在22℃下进行。
[0723]
步骤1：使用proteon xpr 36生物传感器，在glc芯片的所有六个泳道上制备高 密度山羊抗人类fc多克隆抗体表面(英杰h10500)。抗人类fc表面的活化步骤发生在 水平流向，而高密度pab的固定步骤发生在竖直流向。阻断步骤发生在竖直位置和水平 位置，以使得水平“中间点”可以用作参考表面。平均约4400ru的山羊抗人类pab被固 定在每个泳道
上。
[0724]
步骤2：关于每个循环，在2μg/ml的浓度下，在不同的竖直泳道上各自捕获三个 不同批次的人类pvrig融合蛋白(人类fc，金斯瑞批次451、448、125)、人类dnam-1 融合蛋白(人类fc，安迪生物科技公司)、人类tigit融合蛋白(人类fc，安迪生物科 技公司)以及对照人类igg(西那吉斯)，持续两分钟。在不同的配体捕获循环下，将 pvr、两个批次的pvrl2以及pvrl3按六种不同浓度各自注射到水平流向中的所有六 个被捕获的配体上。注射两分钟，然后在50μl/min的流动速率下解离10分钟。pvr 浓度范围是1.4nm到332nm，呈3倍稀释系列，两个批次的pvrl2以1.3nm到322nm 的浓度范围按3倍稀释系列注射，并且pvrl3以1.4nm到334nm的浓度范围按3倍 稀释系列注射。所有蛋白质试剂都是在操作缓冲液中制备的，操作缓冲液是经过脱气的 pbs缓冲液，添加了0.05％吐温20和0.01％bsa。抗人类fc捕获表面在每个循环之后 用两个30秒脉冲的146mm磷酸再生。
[0725]
步骤3：利用孔间参考(interspot referencing)和与分析物注射液相同的预空白注射 液，使用3.1.0.6版proteon manager处理并双参考(double-reference)与每个被捕获配 体结合的分析物的传感图数据。
[0726]
结果
[0727]
a)pvr：与被捕获的dnam-1和tigit弱结合并且未显示与所有三个批次的pvrig 和对照igg的结合。还未得到足够的信息来评估pvr与dnam-1和tigit相互作用的 kd(数据未示出)。
[0728]
b)pvrl2：两个批次的pvrl2均显示与所有三个批次的pvrig和与dnam-1的 结合，但与tigit结合极少或没有并且不与对照igg结合。传感图显示了复杂的动力学， 因而无法估算结合常数(数据未示出)。
[0729]
c)pvrl3：显示了与tigit的极少结合并且不结合其它蛋白质(数据未示出)。
[0730]
实例7：pvrig ecd-ig对小鼠t细胞的体外免疫调节活性
[0731]
在这些实验中，研究了重组性融合的蛋白质pvrig-ecd-ig对小鼠t细胞活化的免 疫调节活性。使用许多体外t细胞活化读出来研究pvrig-ecd-ig对小鼠cd4 t细胞的 活化的影响：细胞活化标志物、细胞因子分泌和增殖。
[0732]
为了评估pvrig蛋白质活化t细胞的活性，产生重组蛋白，它包含小鼠pvrig的小鼠 胞外结构域(ecd)与小鼠igg2a的fc融合(命名为pvrig-ecd ig m:m)(seq id no:29)。 研究了与抗cd3共固定的fc融合蛋白对小鼠cd4 t细胞功能的影响，如由活化标志物和 细胞因子分泌所体现。
[0733]
材料和方法
[0734]
fc融合蛋白和对照ig：测试fc融合蛋白pvrig-ecd-ig(批次#198)。使用小鼠igg2a (克隆mopc-173；biolegend或c1.18.4；bioxcell)作为同种型对照。
[0735]
小鼠cd4 t细胞分离：使用t细胞分离试剂盒(美天旎目录号130-093-227)根据 制造商的说明书，从balb/c小鼠的脾脏池中分离未接触的cd4+cd25-t细胞。所获 得的纯度是》90％。
[0736]
小鼠cd4 t细胞的活化：将2μg/ml的抗小鼠cd3-εmab(克隆145-2c11；bd生 物科学)连同各种浓度(1、3或10 g/ml)的pvrig-ecd-ig蛋白质或对照ig一起在 37℃下在96孔平底组织培养板(西格玛，目录号z707910)上共固定3小时。为了使每 孔的总蛋白质浓度达
到12μg/ml，向每个孔中添加对照ig。将孔用pbs洗涤3次并且每 孔涂铺1
×
105个经过纯化的cd4+cd25-t细胞，并且留在5％co2，37℃下的加湿孵育 箱中。在一些实验中，添加可溶性抗cd28(克隆：37.51；ebioscience；1μg/ml)。在 刺激后的指定时间收集培养上清液并且通过elisa试剂盒(安迪生物科技公司)分析小 鼠ifnγ或il-2分泌。通过流式细胞仪分析pvrig-ecd-ig蛋白质(参见图103)对活 化标志物cd69在小鼠cd4+t细胞上的表达的影响。在刺激48小时后，在存在用于阻 断fcγ-受体的抗cd16/32(克隆2.4g2；bd生物科学)的情况下，用抗体鸡尾酒给细胞 染，抗体鸡尾酒包括percp抗cd4(克隆g41.5；biolegend)、fitc或pe抗cd69 (克隆h1.2f3；biolegend)。使用macsquant分析仪9(美天旎)评估细胞并且使用bdcellquest或通过macsquantify tm软件分析数据。使用excel或prism4软件分析数据。
[0737]
结果和总结
[0738]
pvrig-ecd ig m:m(参见图103)对小鼠cd4+t细胞功能的影响：图15显示了 pvrig-ecd-ig(参见图103)对分离后的小鼠脾脏t细胞(cd4+，纯度》95％)的体外 免疫调节活性，所述分离后的小鼠脾脏t细胞经过微量培养板刺激，仅与抗cd3(2 μg/ml)共固定或与对照ig(migg2a)或pvrig-ecd-ig(参见图103)(10μg/ml)在存 在可溶性抗cd28(1μg/ml)的情况下共固定。pvrig-ecd-ig(参见图103)按剂量依 赖性方式抑制小鼠cd4 t细胞活化，如由降低的cd69上调(图15a、d)和tcr诱导 的细胞因子(il-2和ifnγ)分泌减少(图15b-c、e)所体现。pvrig-ecd-ig((参见 图103))的抑制作用的量值在30％到100％的范围内。在低至3μg/ml的浓度下观察到 了pvrig-ecd-ig((参见图103))对ifnγ分泌的抑制作用(对比对照ig约60％抑制)。
[0739]
当fc融合蛋白与抗cd3共固定在培养板上时，pvrig-ecd-ig(参见图103)按浓 度依赖性方式抑制t细胞活化。在10μg/ml的pvrig-ecd-ig下观察到最大抑制作用(参 见图103)。
[0740]
结果证明了pvrig-ecd-ig对小鼠t细胞活化的抑制作用，由减少的细胞因子分泌 和活化标志物cd69上调被抑制所体现。t细胞活化的这种抑制支持根据本发明的免疫 抑制性pvrig蛋白质(pvrig多肽和融合蛋白)在以下方面的潜能：t细胞 驱动的自身免疫疾病，如类风湿性关节炎、多发性硬化症、牛皮癣和发炎性肠病；以及 用于其它免疫相关疾病和/或用于减少在基因疗法之后不合需要的免疫活化。另外，这些 结果还支持免疫刺激性pvrig蛋白质(pvrig多肽和融合蛋白)的以下潜能：降 低pvrig的抑制活性以可受益于增强的免疫反应，尤其是增强的ctl免疫和促炎 性细胞因子的病况，如癌症、传染病，尤其是慢性感染，以及脓毒症，其中t细胞介导 的病变细胞耗竭在上是有利的。
[0741]
实例8：pvrig对人类细胞毒性t细胞(ctl)的体外免疫调节活性
[0742]
本实例中所述的实验评估了人类pvrig在不同黑素瘤细胞系上的异位表达对其活 化ctl(细胞毒性t淋巴细胞)和充当被这些细胞杀死的靶标的能力的影响。
[0743]
材料和方法：
[0744]
使用在hla-a2情况下呈递mart-1抗原的三个人类黑素瘤细胞系(sk-mel-23、 mel-624和mel-624.38)作为ctl的靶标。不表达hla-a2的mel-888充当阴性对照。
[0745]
人类pvrig在细胞毒性t淋巴细胞(ctl)上的异位表达：为了表达外周血白细 胞(pbl)培养物中的人类pvrig，使用特异性引物扩增编码pvrig的cdna并将其 克隆到基于
mscv的反转录病毒载体(pmsgv1)或三联载体(tripartite vector)中： cd8依赖性f4 tcr-和-链与p2a序列相连并被克隆到pmsgv1载体中，然后是内 部核糖体进入位点(ires)和pvrig。作为阴性对照的编码ngfr1的反转录病毒载体 或三联载体：cd8依赖性f4 tcr-和-链与p2a序列相连并被克隆到pmsgv1载体 中，然后是内部核糖体进入位点(ires)和ngfr。首先使用限制酶消化并且然后通过 测序来进行克隆验证。在序列确认后，产生大量反转录病毒载体(maxi-prep)以供后续 使用。
[0746]
用编码pvrig的反转录病毒构建体或用编码ngfr1的反转录病毒载体或作为阴性 对照的空载体转导健康人类供体的外周血白细胞。使用基于retronectin的方案进行转导； 简单来说，在用反转录病毒载体和双嗜性包膜基因(vsv-g)转染之后，在293gp细胞 (反转录病毒包装细胞系)中产生反转录病毒上清液。在转导之前，将反转录病毒上清 液涂铺在涂有retronectin的培养板上以使得病毒粒子能够与板结合，并且向培养中添加 pbl，持续6小时。在那之后，在新的培养容器中补充细胞。通过用商业pvrig特异性 兔多克隆抗体或用商业抗ngfr(目录号345108；biolegend)给经过转导的pbl染 来测定蛋白质的转导效率和表达。使用兔igg(西格玛，目录号i5006)作为同种型对 照，并且至于第二抗体，我们使用apc结合的抗兔igg(jackson，目录号711-136-152)。
[0747]
f4 t细胞受体在细胞毒性t淋巴细胞(ctl)上的异位表达：为了获得表达特异性 识别mart-126-35-/hla-a2肽-mhc复合体的mart-1-特异性f4 tcr的效应淋巴细 胞，用pha刺激预先经过pvrig、ngfr或空载体转导以表达的新鲜分离的人类pbl， 并培养5到10天，并且随后用编码mart-1-特异性f4 tcr的α链和β链的体外转录 的mrna转导。在淋巴细胞培养基(生物靶向培养基，胎牛血清(10％)、l谷氨酰胺 青霉素/链霉素(100个单位/毫升)、il-2 300iu)中培养经过转导的淋巴细胞，每2-3 天补充培养基。通过facs染，使用识别所转导的特异性tcr的β链的胞外结构域的 特异性单克隆抗体验证f4 tcr表达水平。(tcr-vb12-pe，目录号im2291；贝克曼库 尔特公司(beckman coulter))。
[0748]
经过pvrig、ngfr或空载体和f4-tcr转导的淋巴细胞在与黑素瘤细胞共培养后的细胞因子分泌：将与f4-tcr一起表达pvrig或ngfr的pbl与未被操控的黑素瘤 细胞共培养。将105个经过转导的pbl与105个黑素瘤靶细胞共培养16小时。为了评定 效应cd8 t细胞对不同肿瘤细胞系的反应，通过elisa测量培养上清液(ifnγ(目录 号dy285e)、il-2(目录号dy202e)、tnf-α(目录号dy210e)，安迪生物科技公司) 中的细胞因子分泌(ifnγ、il-2和tnf-α)，所述培养上清液经过稀释以便在elisa分 析的线性范围内。
[0749]
细胞介导的细胞毒性分析：进行此分析是为了评定共培养后的靶细胞杀死。使用双 顺反子载体使pvrig和f4在pbl中表达并且与经过cfse标记的黑素瘤靶细胞(用2 mm cfse(ebioscience)标记6分钟)按3:1的e:t比在37℃下共培养18小时。18小 时后收集细胞并且并且添加1mm碘化丙啶(西格玛-阿尔德里奇(sigma-aldrich))以 分配细胞死亡比率。在cyan-adp流式细胞仪(贝克曼库尔特公司)上走样。
[0750]
结果：
[0751]
实验系统的一般设计：在本文所述的实验系统中，pvrig在人类pbl上过表达， 接着操控人类pbl表达mart1特异性和hla-a2限制的f4 tcr。然后将过表达细胞 与hla-a2阳性(名称)和hla-a2阴性(名称)黑素瘤细胞系(参考)共培养。最近 在临床试验中在病入膏肓的黑素瘤患者中使用f4 tcr，通过使用编码tcr的反转录病 毒，由来自外周血的自体淋
巴细胞赋予特异性肿瘤识别(morgan等人,2006《科学》, 314:126-129)。通过细胞因子分泌评定通过与同源黑素瘤细胞共培养，pvrig表达对cd8 t细胞的抗原特异性活化的影响。
[0752]
pvrig在人类pbl上的过表达-实验1：如材料和方法中所述，用编码pvrig的 反转录病毒载体或作为阴性对照的空载体转导人类pbl。在转导48小时后，通过流式 细胞仪评定pvrig的水平，并与用空载体转导的细胞进行比较。如图16中所示，转基 因表达细胞的百分比是62.4％。
[0753]
pvrig在人类pbl上的过表达-实验2：如材料和方法中所述，用编码pvrig或 ngfr的反转录病毒载体或作为阴性对照的空载体转导人类pbl。在转导48小时后， 通过流式细胞仪评定pvrig的水平，并与用空载体转导的细胞进行比较。pvrig表达 细胞的百分比在20％的范围内。如图17中所示，ngfr的表达是63％。另外几个在pbl 上过表达pvrig的尝试未成功。一种可能性是，难以在原代pbl中表达pvrig是出于 这些细胞中的基础内源性表达水平。
[0754]
f4 tcr在人类pbl上的过表达：为了对人类ctl进行功能分析，如材料和方法中 所述，我们使用经过工程改造以表达识别hla-a2+/mart1+黑素瘤细胞的f4 tcr的 pbl。图18a显示在实验1中所用的白细胞的tcr转导之后获得的f4 tcr表达水平， 图18b显示在实验2中所用的白细胞的tcr转导之后获得的f4 tcr表达水平。
[0755]
pvrig表达对ifnγ分泌的影响-实验1：将经过pvrig或空载体和f4转导的pbl 与黑素瘤细胞系共培养。在共培养16小时时测量ifnγ分泌水平。如图19中所示，ifnγ 分泌的抑制量值因为pvrig过表达而大于90％。与充当阴性对照的hla-a2阴性细胞 系mel-888共培养仅引起f4转导的淋巴细胞少量的活化依赖性ifnγ分泌。不表达f4 tcr的pbl(命名为w/o)充当额外阴性对照。
[0756]
pvrig表达对ifnγ分泌的影响-实验2：采用共转导(图20a)或使用双顺反子 载体(图20b)将pvrig、ngfr或空载体和f4转导到pbl中。将经过转导的pbl与 黑素瘤细胞系共培养。在共培养16小时时测量ifnγ分泌水平。如图20a中所示，细胞 因子分泌的抑制量值因为pvrig过表达而在30％的范围内。与充当阴性对照的hla-a2 阴性细胞系mel-888共培养仅引起f4转导的淋巴细胞少量的活化依赖性ifnγ分泌。不 表达f4 tcr的pbl(命名为w/o)充当额外阴性对照。如图20b中所示，当pvrig 与f4 tcr共转导时，未观察到ifnγ抑制。
[0757]
pvrig对ctl介导的杀死活性的影响-实验2：使用双顺反子载体用pvrig或 ngfr和f4转导pbl并且与cfse标记的黑素瘤细胞系共培养。如图21中所示，碘化 丙啶阳性事件的百分比(反映杀死活性的强度)因为pvrig的表达而相对于阴性对照 ngfr转导的细胞降低了约50％。pvrig表达细胞的杀死活性类似于在黑素瘤与不表达 f4 tcr的pbl(命名为w/o)之间共培养的杀死活性。
[0758]
总结：不希望受单一假设的限制，本文中呈现的结果指示，在原代淋巴细胞上的过 表达导致ctl的细胞因子分泌减少，表明pvrig对ctl具有抑制作用。
[0759]
实例9：人类抗pvrig抗体
[0760]
本研究的目标是为了分离以高亲和力和特异性结合pvrig免疫肿瘤学靶标并且阻 断pvrig与其结合伴侣pvrl2的相互作用的人类抗体。这通过以下来实现：淘选针对 包含人类pvrig胞外结构域(ecd)融合人类igg1 fc区的重组蛋白的人类fab片段噬 菌体展示库，并且针对所得抗体阻断pvrig与pvrl2的相互作用的能力对其进行筛选。
[0761]
方案
[0762]
试剂的功能性qc：通过微流控毛细管电泳，使用labchip系统(珀金埃尔默)测 定淘选试剂pvrig ecd融合人类igg1 fc结构域(pvrighh)的纯度。通过淘选试剂 结合其配体pvrl2的能力验证其活性。
[0763]
用于检测蛋白质-蛋白质相互作用的elisa：将his标记的pvrl2重组蛋白在磷酸 盐缓冲盐水(pbs)中稀释到2μg/ml并且在高结合eia/ria板(costar)的孔上涂布 50μl等分试样，在4℃下过夜。将涂布后的板孔用pbs冲洗两次并且与300μl阻断缓 冲液(5％脱脂奶粉，于pbs中，ph 7.4)一起在室温(rt)下孵育1小时。去除阻断 缓冲液并且再用pbs冲洗培养板两次。将板结合的pvrl2与不同浓度的pvrighh溶 液(线性范围是0.1μg/ml到4μg/ml，体积是50μl/孔)一起在室温下孵育1小时。 将培养板用pbs-t(pbs 7.4，0.05％吐温20)洗涤三次，然后用pbs洗涤三次，并且添 加50μl/孔的hrp结合的第二抗体(人类igg fc结构域特异性)。将此在室温下孵育1 小时并再次洗涤培养板。通过添加50μl的sureblue tmb底物(kpl公司)并且孵育 5-20分钟，在所有孔中产生elisa信号。通过添加50μl 2n h2so4(vwr)停止hrp 反应并且在spectramax(分子仪器公司)或envision(珀金埃尔默)分光光度计上读取 450nm下的吸光度信号。
[0764]
制备生物素标记的pvrig：为了推动用涂有抗生蛋白链菌素的磁珠在溶液中进行噬 菌体淘选，使用生物素试剂盒(innova biosciences)用生物素标记 pvrighh和不相关的人类igg1 fc同种型对照。根据制造商的方案进行生物素化反应 并且将生物素标记的试剂储存在4℃下用于进一步qc和生物淘选。如部分2.1中所述， 通过labchip和功能性elisa评定生物素标记的蛋白质的纯度和活性。另外，通过elisa 使用两种途径评定生物素化程度：1)将生物素标记的试剂吸附到高结合eia/ria板上 并使用hrp结合的抗生蛋白链菌素检测蛋白质，和2)在预涂有抗生蛋白链菌素的 eia/ria板上孵育生物素标记的蛋白质并使用hrp结合的人类igg fc结构域特异性第 二抗体检测结合。
[0765]
人类抗体库的噬菌体淘选：使用涂有抗生蛋白链菌素的磁珠捕获生物素标记的抗 原，在溶液中进行淘选反应。应注意，所有的洗涤和洗脱步骤都使用用于捕获珠粒的磁 力架(普洛麦格(promega))进行。所有孵育步骤都是在室温下在管旋转器(bioexpress) 上温和混合下进行。进行四个淘选亚周期(sub-campaign)，各自采用抗原浓度、洗涤和 fc结合剂耗竭步骤的不同组合(表1)。
[0766]
所有淘选亚周期都使用生物素标记的pvrighh抗原进行。关于每一轮淘选，在两 个连续步骤中针对100pmol的不相关的人类igg1 fc蛋白质耗竭噬菌体库。在耗竭之后， 亚周期a和b的每一轮涉及分别在低严格性和高严格性洗涤条件下针对50nm抗原的 淘选。除了在周期c中，在第2轮和第3轮淘选中用10倍过量的不相关的igg1 fc蛋 白质阻断库之外，亚周期c和d与亚周期b相同。亚周期d的不同之处在于，在第3 轮中使用5nm抗原。
[0767]
表1：针对pvrighh的噬菌体淘选所用的抗原和洗涤条件.
[0768][0769]
2.4.制备用于淘选的噬菌体库：所有的噬菌体淘选实验都使用xoma031人类fab 抗体噬菌体展示库(加利福尼亚州伯克利的xoma公司(xoma corporation,berkeley, ca))。通过与10％脱脂奶粉在pbs中1:1混合(最终脱脂奶浓度5％)阻断足够用于50 倍过表达库的噬菌体并孵育1小时。
[0770]
2.4.1.抗原与抗生蛋白链菌素珠粒的偶联：关于每个亚周期，通过悬浮在1ml阻 断缓冲液(5％脱脂奶粉，于pbs中)中来阻断涂有戴诺抗生蛋白链菌素的磁珠(生命 技术公司)的三个100μl等分试样并且孵育30分钟。将一个阻断后的珠粒等分试样与 100pmol的生物素标记的pvrighh混合。其它两个等分试样与100pmol的不相关的抗 原混合以使仅fc结合剂耗竭。使生物素标记的抗原与珠粒在室温下偶联30分钟。珠粒 悬浮液用pbs洗涤两次以去除游离抗原并再悬浮于100μl阻断缓冲液中。
[0771]
2.4.2.来自噬菌体库的人类igg1 fc和抗生蛋白链菌素珠粒结合剂的耗竭：必需在 可以开始噬菌体淘选之前去除对抗生蛋白链菌素珠粒和pvrighh的fc区来说不合需 要的结合剂。为了实现这个，将阻断后的噬菌体与解偶联的抗生蛋白链菌素珠粒的一个 100μl等分试样混合并且孵育45分钟。丢弃珠粒(以及可能不合需要的珠粒和人类igg1 fc结合剂)。将这个步骤重复一次并且保留耗竭的噬菌体库上清液用于淘选。
[0772]
2.5.噬菌体淘选第1轮：将经过阻断和耗竭的噬菌体库与生物素标记的与以上所 述的磁珠偶联的pvrighh混合。将此悬浮液在室温下在温和旋转下孵育1小时，以允 许pvrighh特异性噬菌体的结合。根据表1中的方案，通过洗涤去除非特异性结合剂。 在洗涤之后，通过与500μl的100mm三乙胺(tea)(emd)一起在室温下孵育15 分钟洗脱所结合的噬菌体。通过添加500μl的1m tris-hcl ph 8.0(teknova)中和洗 脱液。
[0773]
2.5.1.测定噬菌体滴度：将10μl的初始噬菌体库(输入滴度)或淘选洗脱液(输 出滴度)在pbs中连续稀释(10倍)。将每个噬菌体稀释液的90μl等分试样与500μl 生长到在
600nm下的光密度(od 600nm)约0.5的tg1大肠杆菌细胞混合。通过静置 孵育30分钟，然后振荡孵育(250rpm)30分钟以使噬菌体感染细胞，全在37℃下。将 每个被感染的细胞培养物的10μl等分试样点样在补充有2％葡萄糖和100μg/ml羧苄 青霉素(carbenicillin)(2ytcg，teknova)的2yt琼脂板上。将培养板在30℃下孵育 过夜。对从每个10μl点生长的体进行计数并用于计算输入和输出滴度。
[0774]
2.5.2.噬菌体营救(phage rescue)：将剩余的噬菌体洗脱液(约1ml)与10ml 生长到od 600nm为0.5的tg1大肠杆菌细胞混合。如部分2.5.1中所详述，将噬菌体 感染到细胞中。通过在2500
×
g下离心使被感染细胞球粒化，将其再悬浮于750μl 2yt 培养基(teknova)中并且展涂在2ytcg琼脂板上。将这些细胞在37℃下孵育过夜并且 刮下所得大肠杆菌菌苔，将其再悬浮于约20ml液体2ytcg(teknova)中。为了实现 0.05的od 600nm，将再悬浮细胞的小份等分试样接种到50ml 2ytcg中，并且然后在 37℃下在250rpm振荡下生长，直到od达到0.5为止。所得培养物用m13k07辅助噬 菌体(新英格兰生物实验室(new england biolabs))感染并且在25℃下在振荡下孵育 过夜以实现噬菌体包装。通过在2500
×
g下离心对含有所营救的噬菌体颗粒的培养物上 清液进行清洁，并且取1ml用于a)后一轮淘选或b)fab结合筛选。
[0775]
噬菌体淘选第2-3轮：除了使用前一轮所营救的噬菌体上清液代替噬菌体库之外， 根据以上步骤进行第二轮和第三轮淘选。所用的洗涤条件、耗竭和抗原浓度列于表1中。
[0776]
2.6.使用由周质提取物制备的fab进行结合筛选
[0777]
2.6.1.fab表达载体：xoma031库是基于也起fab表达载体作用的噬菌粒 (phagemid)构建体。这些载体含有fab重链和轻链表达盒、用于驱动抗体基因的表达的 lac启动子以及耐氨苄青霉素(ampicillin)基因。抗体链附接有n端信号肽以驱动其分 泌到周质空间中。重链的c端携带截短基因iii蛋白质序列以便并入到噬菌体颗粒中。 重链还携带六组氨酸、c-myc和v5亲和标签。这些载体到大肠杆菌中的转化和异丙基 β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(iptg)诱导引起可溶性fab分子的周质表达。
[0778]
2.6.2.fab ppe产生：从第3轮淘选洗脱下来的噬菌体池经过稀释并被感染到tg1 大肠杆菌细胞(lucigen)中，以使得当展涂在2ytcg琼脂板上时产生单一体。这使 得每个体携带单一fab克隆。使用qpix2仪器(分子仪器公司)将个别克隆接种到96 孔深孔阻断液(vwr)中的1ml 2ytcg起子培养物(starter culture)中。使这些起子 培养物在multitron 3mm孵育箱(伊孚森(infors))中在37℃与700rpm振荡下生长过 夜。关于fab表达，将1ml起子培养物中的20μl转移到第二组含有1ml 2yt与0.1％ 葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的深孔板中。使培养物生长，直到平均od 600nm为 0.5-1.0为止，并且通过添加iptg(teknova)到最终浓度1mm来诱导蛋白质表达。使 表达培养物在multitron仪器中在25℃与700rpm振荡下孵育过夜。
[0779]
提取分泌到大肠杆菌周质中的fab蛋白质进行分析。通过在2500
×
g下离心收集细 胞，丢弃上清液并且将球粒再悬浮于75μl冰冷的ppb缓冲液(teknova)中。将提取 物在4℃与1000rpm振荡下孵育10分钟，并且添加225μl冰冷的ddh2o并再孵育1 小时。所得周质提取物(ppe)通过在2500
×
g下离心进行清洁并且转移到另一个培养 板或管子中用于elisa和facs分析。所有提取缓冲液都含有不含edta的complete 蛋白酶抑制剂(罗氏(roche))。
[0780]
每板样品还包括一式两份的“空白ppe”孔来充当阴性对照。这些阴性对照通过以
下 产生：故意留下两个1ml培养物未接种，并且然后按与fab ppe相同的方式对其进行 处理，从而产生无细菌生长并且因此无fab表达的样品。
[0781]
2.6.3.通过elisa初步筛选：通过elisa测试每个亚周期两个96孔板的ppe提 取物与pvrighh的结合。应注意，elisa筛选中使用非生物素标记版本的蛋白质来避 免选择生物素或抗生蛋白链菌素结合剂。将pvrighh重组蛋白在磷酸盐缓冲盐水 (pbs)中稀释到2μg/ml并将50μl等分试样涂布在高结合eia/ria板(costar)的孔 上，在4℃下过夜。将涂布后的板孔用pbs冲洗两次并且与300μl阻断缓冲液(5％脱 脂奶粉，于pbs中，ph 7.4)一起在室温(rt)下孵育1小时。去除阻断缓冲液并且再 用pbs冲洗培养板两次。将板结合的pvrig与用3％脱脂奶预阻断的ppe一起在室温 下孵育1小时。将培养板用pbs-t(pbs 7.4，0.05％吐温20)洗涤三次，然后用pbs 洗涤三次，并且按在5％牛奶中在pbs中1:2000稀释添加50μl/孔的hrp结合的抗人 类fab第二抗体(jackson immunoresearch)。将此在室温下孵育1小时并再次洗涤培养 板。通过添加50μl的sureblue tmb底物(kpl公司)并且孵育5-20分钟，在所有孔 中产生elisa信号。通过添加50μl 2n h2so4(vwr)停止hrp反应并且在spectramax (分子仪器公司)或envision(珀金埃尔默)分光光度计上读取450nm下的吸光度信号。 显示信号:背景(空白ppe)比》3的孔被选为阳性命中。
[0782]
2.6.4.elisa阳性fab的序列分析：从elisa筛选中选出阳性命中并将其重新排列 到新的96孔板中。使克隆在37℃下生长过夜并且使用重链和轻链特异性引物给质粒 dna测序。使用xabtracker(xoma)软件组装并分析序列。如果重链cdr3中存在超 过一种非保守差异，那么认为克隆是序列单一的。重链相同或类似但是轻链显著不同的 克隆被称为初始克隆的同胞(sibling)。
[0783]
2.6.5.facs筛选fab作为ppe：选择序列单一elisa阳性fab克隆并且通过荧光激 活细胞分选(facs)分析其结合pvrig过表达细胞的能力。使用过表达人类pvrig抗 原的hek293细胞进行分析。在平行实验中，使用未转染的hek293细胞作为每个fab 样品的阴性对照。
[0784]
如上所述产生用于序列单一elisa阳性fab克隆的ppe。所有分析都使用facs缓 冲液(pbs中的1％bsa和0.1％叠氮化钠)进行。收集人类pvrig和未转染的hek293 细胞，洗涤两次，并以2
×
106个细胞/毫升的密度再悬浮。将25μl细胞等分试样与25μl 的每个ppe样品混合并且在4℃与温和振荡下孵育1小时。分析中还包括两个空白ppe 对照。将培养板在200μl的facs缓冲液中洗涤一次并且向每个孔中添加50μl的2 μg/ml小鼠抗c-myc抗体稀释液(罗氏)。在4℃下孵育30分钟后，再次洗涤细胞并且 向每个ppe和阴性对照孔中添加25μl的5μg/ml山羊抗小鼠fab-af647稀释液(jacksonimmunoresearch)。所有第二抗体都在4℃下孵育30分钟。洗涤两次之后，将细胞再悬 浮于最终体积50μl的固定缓冲液(facs缓冲液中的2％多聚甲醛)中。在intellicyt htfc 筛选系统上读取样品，在指定的活门中每孔记录约5000个事件。使用flowjo(美国加 利福尼亚州(ca,usa)的de novo软件公司)分析数据并将数据导出到excel中。使 用xabtracker软件(xoma)计算人类pvrig过表达hek细胞和未转染的293细胞的 平均荧光强度(mfi)的比率。每个板上的阳性命中被鉴定为是mfi比率比平均空白ppe 对照信号大5倍的那些。
[0785]
fab命中的重新格式化并且作为人类igg分子产生：将潜在的pvrig结合fab转换 为全长人类igg用于进一步表征。通过可变重链、λ和κ结构域基因的pcr扩增衍生出 蛋白质
表达构建体，所述基因分别被亚克隆到pfuse-chig-hg1(人类igg1重链)、 pfuse2-clig-hk(人类κ轻链)或pfuse2-clig-hl2(人类λ2轻链)载体中(所有表 达载体都来源于invivogen)。
[0786]
将expi293细胞(生命技术公司)以6
×
105个细胞/毫升接种在expi293培养基(生 命技术公司)中并且在37℃下在8％co2的加湿气氛中在125rpm振荡下孵育72小时。 此细胞储备液用于将表达培养物以2.0
×
106个细胞/毫升接种在expi293培养基中。将这 些培养物与上文一样在135rpm振荡下孵育24小时。
[0787]
关于转染，再次将细胞在expi293培养基中稀释到2.5
×
106个细胞/毫升。将用于抗 体重链和轻链的蛋白质表达构建体以1:2的比率混合。关于每30ml的表达培养物体积， 将30μg的dna和81μl的expifectamine(生命技术公司)各自用opti-mem(生命技 术公司)单独稀释到1.5ml并且孵育五分钟。然后将经过稀释的dna和expifectamine 混合并且在室温下孵育20分钟。然后将此添加到振荡器烧瓶中的表达培养物中并且如 上所述在125rpm振荡下孵育。
[0788]
在转染后约20小时，向每个烧瓶中添加150μl的expifectamine 293转染增强剂1 和1.5ml的expifectamine 293转染增强剂2。培养物再孵育五天(转染后共计六天) 并通过离心收集上清液。使用akta纯fplc(通用电气医疗集团生物科学(ge healthcarebio-sciences))和hitrap mabselect sure亲和柱(通用电气医疗集团生物科学)，根据制 造商的说明书从上清液中纯化igg。
[0789]
经过重新格式化的igg1抗体的facs筛选：除了对已纯化抗体进行剂量依赖性滴 定之外，类似于本文中所述的基于ppe的筛选对经过重新格式化的抗体进行facs筛选。 将人类pvrig过表达hek293细胞或未转染的hek293细胞与不同浓度(0-10μg/ml) 的抗pvrig抗体或同种型对照一起在facs缓冲液中在4℃下孵育60分钟。将细胞在 facs缓冲液中洗涤一次，再悬浮于经过1:200稀释的50μl的alexa fluor 647结合的抗 人类igg(fab片段特异性)中，并且在4℃下在暗处孵育30分钟。将细胞洗涤两次并 且再悬浮于经过1:1000稀释的最终体积80μl的facs缓冲液和碘化丙啶(biolegend目 录号421301)中。使用intellicyt htfc筛选系统(intellicyt)分析样品。使用flowjo (denovo)分析数据，将数据导出到excel(微软)中并在graphpad prism(graphpad 软件公司)中绘成图。
[0790]
结果
[0791]
pvrighh重组蛋白的功能性qc：通过微流控毛细管电泳，使用labchip系统评定 pvrighh蛋白质的纯度。在还原性条件下，重组蛋白迁移到80kda处，与其计算得到 的分子量80.4kda一致，并且显示99％的纯度(数据未示出)在非还原性条件下，观察 到一个额外的峰，它可能由因为fc-fc相互作用而存在二聚形式的蛋白质而产生。
[0792]
通过在elisa中评估重组蛋白与pvrl2(pvrig的已知配体)的结合来评定重组 蛋白的功能完整性。观察到pvrighh与pvrl2结合的剂量依赖性反应(数据未示出)。 相比之下，未观察到不相关的人类igg1 fc对照的结合。综合而言，这指示pvrighh 重组蛋白具有高纯度和功能活性，并且因此适合生物淘选。
[0793]
生物素标记的pvrighh重组蛋白的qc：通过微流控毛细管电泳，使用labchip 系统评定生物素标记的pvrighh蛋白质的纯度。在非生物素标记的重组蛋白和生物素 标记的重组蛋白之间未观察到显著差异(数据未示出)。应注意，在生物素标记的蛋白 质样品中观察
到了额外的44.3kda峰。这个峰可能由单体形式的pvrighh蛋白质产生 或可能是生物素化试剂盒的骤冷反应的伪影。
[0794]
通过在涂有抗生蛋白链菌素的eia板上孵育生物素标记的蛋白质并且使用hrp结 合的抗人类igg1 fc第二抗体检测结合的蛋白质来确认成功生物素化。生物素标记的 pvrighh与涂有抗生蛋白链菌素的eia板的结合与商业上获得的不相关的生物素标记 的蛋白质相当(数据未示出)。
[0795]
噬菌体淘选：使用生物素标记的pvrighh蛋白质进行针对xoma031人类fab抗 体噬菌体展示库(加利福尼亚州伯克利的xoma公司)的噬菌体淘选。在洗涤严格性、 抗原浓度和fc结合剂的耗竭的4种不同组合(亚周期a到d)下进行三轮生物淘选。 使用噬菌体输出滴度评估每一轮的成功。使用定性准则来定义淘选亚周期的成功，如在 第1轮之后噬菌体滴度显著减小；在第2轮和第3轮之后噬菌体滴度增加或维持不变； 以及在提高洗涤严格性或降低抗原浓度之后噬菌体滴度减小。所有4个亚周期都使得噬 菌体滴度在亚周期一贯的预期范围内(数据未示出)。
[0796]
筛选噬菌体输出作为fabppe：针对四个亚周期中的每一个，筛选两个96孔板的fab 克隆(作为ppe)来评估生物淘选的成功。结果概括在表3中并且在下文中进一步详细 讨论。总的来说，所有4个亚周期都产生数量显著的pvrighh特异性fab。鉴别到总 共49个靶特异性单一fab。亚周期b和d显示最高的elisa命中率和facs相关性并 且被选来用于延伸筛选。
[0797]
表3：fab ppe的中试筛选的总结。关于每个亚周期，列出了所筛选的克隆的总数、 elisa命中、facs命中以及序列单一性。开放阅读框(orf)表示成功测序为全长fab 的克隆。特异性是基于在elisa中缺乏与不相关蛋白质的非特异性结合。facs相关性 表示也是facs阳性(特异性结合到pvrig过表达hek293细胞)的elisa命中的百 分比。
[0798][0799]
*与不相关fc结合物或pvrl2无非特异性结合；**35个单一hc，14个同胞
[0800]
初级fab筛选(elisa)：关于每个亚周期，通过elisa，针对pvrighh重组蛋白 筛选两个96孔板(182个fab克隆)的ppe。应注意，虽然使用生物素标记的蛋白质进 行淘选，但使用非生物素标记的版本进行elisa筛选，这避免了生物素或抗生蛋白链菌 素特异性结合剂的检测。当
‘
阳性’信号的阈值设定在3倍的靶特异性结合:空白ppe对照 信号比时，4个亚周期得到的elisa命中率在24-37％的范围内。
[0801]
二级筛选(dna序列分析、elisa和facs)fab：给elisa阳性克隆测序来选择 非冗余fab。鉴别到七十三个序列单一fab克隆。19个克隆是亚周期a所特有的，13个 克隆是亚周期b所特有的，10个克隆是亚周期c所特有的，18个克隆是亚周期d所特 有的，而剩余23个克隆在各周期之间共用。序列单一elisa阳性fab克隆再表达为ppe 并且通过facs筛选用于特异性结合。73个单一克隆中总共49个被鉴定为是pvrig特 异性elisa和facs结合剂(根据2.6.5中建立的准则)。49个facs结合剂对应于35 个具有单一重链的抗体和14个具有单一轻链但与单一克隆中的一个共用重链的同胞。 facs结合数据的汇总呈现在表4中。
[0802]
还测试了序列单一fab的非特异性结合。所分析的所有fab ppe都以比空白ppe对 照大3倍的分析信号结合到pvrighh重组蛋白。在平行分析中，测试fab ppe与两个 具有相同igg1 fc区的不相关蛋白质以及pvrl2重组蛋白的结合。所述克隆皆不显示与 对照的显著非特异性结合，表明所选择的fab对pvrig具有特异性。
[0803]
表4：pvrig fab的facs结合总结。通过facs分析所有单一elisa阳性fab。测 量pvrig过表达hek293细胞以及未转染的hek293细胞的平均荧光强度(mfi)。计 算靶特异性结合对比脱靶结合的mfi比。选择mfi比》5的克隆作为命中并列于下文中。
[0804]
[0805][0806]
elisa和facs阳性fab重新格式化为higg1：将所有单一elisa和facs结合剂 重新格式化以在expi293细胞中表达为人类igg1分子。初始的49个抗体中的44个被 成功表达为全长抗体。测试这些经过重新格式化的抗体所保留的与pvrig过表达 hek293细胞以及不相关的人类igg1同种型对照的结合。还针对未转染的hek293细胞 测试了所有抗体。所得结合结果用于证明抗体的特异性并且也用于绘图以计算平衡结合 常数(kd)。剩余44个抗体中的九个显示弱结合或显著非特异性结合。剩余35个抗体 被选用于在基于细胞的功能分析中进一步分析。这些抗体的基于facs的kd列于表6 中。kd值在0.30nm到96nm的范围内，中位值是9.4nm，表明从淘选周期获得的大 多数抗体特异性都很大并以高亲和力结合pvrig。
[0807]
表5：经过重新格式化的抗体的表达和结合总结。将所有单一elisa和facs阳性 fab重新格式化到人类igg1骨架中。通过针对pvrig过表达hek293细胞的剂量滴定 测定facs kd值。通过针对未转染的hek293细胞的剂量滴定测定脱靶结合。
[0808]
[0809][0810]
总结和结论
[0811]
使用重组性fc标记的抗原版本进行噬菌体展示抗体发现周期以分离针对免疫肿瘤 学靶pvrig的结合剂。质量控制分析显示淘选抗原是纯的并具有功能活性。淘选工作 产生49个特异性结合到作为重组蛋白和在细胞表面上的pvrig靶的单一fab克隆。在 这些克隆中，35个成功产生了人类igg1抗体并且显示保留了与pvrig的特异性结合。 这个抗体池在facs分析中展现高亲和力，35个抗体中的18个以kd《10nm结合。
[0812]
实例10通过elisa证实抗人类pvrig fab阻断pvrig与pvrl2之间的相互作用的 能力.
[0813]
方法：将人类pvrl2-his(目录号2229-n2-050/cf，安迪生物科技公司)涂布在 elisa板上。将在5％脱脂奶中1:1稀释的fab周质提取物(ppe)与1μg/ml(最终浓 度)的人类pvrig-fc一起在室温下预孵育15分钟。使fab-受体混合物结合涂布在elisa 板上的pvrl2-his。使用与hrp结合的抗人类fc抗体(jackson immuno research，目 录号709-035-098)探测pvrig-fc/pvrl2-his相互作用。在不存在ppe的情况下(阴 性孔)，预测是强正信号。关于阻断性fab，信号将显著减小。可以选择信号比阴性孔低》5 倍(》80％阻断)的fab克隆作为阻断性fab。
[0814]
方案：
[0815]
给elisa板(costar 9018)涂布50μl的2μg/ml抗原并将其储存在4℃下过夜。涂 有抗原的培养板用1
×
pbs洗涤3次。用pbs中200μl的5％脱脂奶阻断培养板并在室 温(rt)下孵育1小时。接着用1
×
pb洗涤培养板。
[0816]
在添加50微升/孔的fab ppe(在5％脱脂奶中稀释过)之后，将培养板与添加到相 应孔中的1μg/ml的人类pvrig-fc一起预孵育。用2个孔进行“无fab”对照。
[0817]
将培养板在室温下孵育1小时。
[0818]
将培养板用1
×
pbst洗涤3次并用1
×
pbs洗涤3次。
[0819]
在添加了50微升/孔的在5％牛奶中在pbs中稀释过的hrp结合的第二抗体(jacksonimmuno research，709-035-098)之后，将培养板在室温下孵育1小时。
[0820]
将培养板用1
×
pbst洗涤3次并用1
×
pbs洗涤3次。
[0821]
在添加50微升/孔的tmb底物并且等到显之后，通过添加50微升/孔的2n h2so4停止反应。测量450nm下的吸光度。
[0822]
结果
[0823]
图52显示测试抗pvrig抗体阻断至少80％的pvrl2与pvrig结合的能力的结果。 如所显示的，大多数这类抗体都能够成功阻断至少80％的结合。具体来说，成功阻断的 抗体指出如下：
[0824]
cpa.7.001、cpa.7.003、cpa.7.004、cpa.7.006、cpa.7.008、cpa.7.009、cpa.7.010、 cpa.7.011、cpa.7.012、cpa.7.013、cpa.7.014、cpa.7.015、cpa.7.017、cpa.7.018、 cpa.7.019、cpa.7.021、cpa.7.022、cpa.7.023、cpa.7.024、cpa.7.033、cpa.7.034、 cpa.7.036、cpa.7.040、cpa.7.046、cpa.7.047、cpa.7.049、cpa.7.050。
[0825]
实例11：37个与人类pvrig融合蛋白结合的抗pvrig igg抗体的表位分库的表面等 离子共振研究
[0826]
材料和方法
[0827]
使用proteon xpr 36仪器在22℃下进行实验，所有样品在实验期间都保持在4℃下。
[0828]
步骤1：将以下抗pvrig mab各自在10mm乙酸钠ph 5.0中稀释到约10μg/ml 并且使用标准胺偶联共价固定于proteon glc生物传感器芯片上的独立点上。
[0829][0830][0831]
活化步骤发生在水平流向，持续五分钟；而固定步骤发生在竖直流向。在表面活化 之后注射mab，持续四分钟。阻断步骤发生在竖直位置和水平位置，各自五分钟，以使 得水平“中间点”可以用作参考表面。将mab固定在约450ru到5000ru的范围内。在 此研究中还对额外的mab cpa.7.041进行了分库，但是仅作为溶液中的分析物。参见下 文。
[0832]
步骤2：初步实验涉及若干个以下循环：在所有固定的mab上以25μl/min的流动 速率注射约20nm pvrig抗原(pvrighh-2-1-1#448，金斯瑞)，持续三分钟，接着取 决于glc芯片阵列中水平行的mab，用ph 2.0或ph 2.5的10mm甘氨酸盐酸盐的30 秒脉冲再生。在含有100μg/ml bsa的经过脱气的pbst(pbs与0.05％吐温20)操作 缓冲液中制备抗原样品。这些
mab进行分库。根据表位库的最严格的定义，总共存在四个离散库。35个mab中 的33个包含两个库，两者的不同之处仅在于其相应组分mab是阻断抗原与克隆 cpa.7.039还是与克隆cpa.7.039一起对抗原进行夹心。
[0838]
实例12在周质提取物中制备的50种抗pvrig人类fab的表面等离子共振动力学筛 选
[0839]
材料和方法
[0840]
所有实验全都使用biacore 3000仪器和proteon xpr 36仪器在22℃下进行。
[0841]
步骤1：使用biacore 3000仪器，在22℃下对周质提取物上清液中的所有52种fab 的摩尔浓度进行定量。将每个fab稀释20倍，并且然后以5μl/min注射到使用与cm5 biacore芯片(通用电气医疗集团)标准胺偶联制备的高密度抗人类fab(通用电气医疗 集团28-9583-25)表面上，持续2分钟。然后在状况与fab上清液相同的抗fab表面上 注射已知浓度的标准人类fab(bethyl p80-115)。在操作缓冲液中制备样品，所述操作缓 冲液是添加了0.01％bsa的经过脱气的hbsp(0.01m hepes、0.15m nacl、0.005％p20， ph 7.4)。使用clamp 3.40软件拟合每个fab上清液的每个spr传感图的结合斜率与已 知浓度的标准人类fab的spr结合斜率，从而估计上清液中每个fab的摩尔浓度。
[0842]
步骤2：使用标准胺偶联，在glc芯片的两个泳道上，使用proteon xpr 36生物 传感器制备高密度山羊抗人类fc多克隆抗体表面(英杰h10500)。使用标准胺偶联，在 相同glc芯片的两个不同泳道上制备高密度抗小鼠fc多克隆抗体表面(通用电气医疗 集团br-1008-38)。所有四个捕获表面的活化和阻断步骤都发生在竖直流向。然后按三 种浓度将上清液中的每个fab注射到fc融合人类pvrig(pvrig-hh-2-1-1#448，金斯 瑞)和fc融合小鼠pvrig(pvrig-mm-2-1-1#198，金斯瑞)上，它们分别以每循环平 均约200ru和约290ru被(分别)捕获到一个高密度抗人类fc表面和一个抗小鼠fc 表面。每个fab浓度系列都是注射两分钟，然后在50μl/min的流动速率下解离10分钟。 起始浓度范围(如在步骤1中所测定)是约20nm到约400nm，每个fab都有两个最高 浓度的三倍稀释液。在操作缓冲液中稀释fab，所述操作缓冲液是添加了0.05％吐温20 和0.01％bsa的经过脱气的pbs。在每个循环之后，用两个30秒脉冲的146mm磷酸 再生抗人类fc捕获表面；并且在每个循环之后，用两个30秒脉冲的10mm甘氨酸ph 1.7 再生抗小鼠fc表面。
[0843]
步骤3：使用3.1.0.6版proteon manager处理并双参考上清液中与被捕获的pvrig 结合的fab的传感图数据。使用不含被捕获的pvrig的相应抗物种捕获表面作为参考表 面并在被捕获的pvrig上在与fab的注射相同的条件下进行空白注射，对传感图进行双 参考。如果可能，就将每个fab的三个不同浓度的传感图与1:1动力学模型全局拟合(含 有关于质量传递的项)，从而估计结合和解离速率常数。不显示1:1单一结合的传感图不 与动力学模型拟合并且因此未被赋予ka和kd的估计值。
[0844]
结果
[0845]
本研究中所包括的fab中没有一个显示出与小鼠pvrig的结合活性(数据未示出)。 针对人类pvrig进行筛选的50个fab中的17个的传感图可能适合于可靠估计其速率常 数。二十八个克隆显示复杂动力学，其中五个fab不显示与被捕获的人类pvrig融合蛋 白的任何结合(cpa.7.025、cpa.7.026、cpa.7.027、cpa.7.029、cpa.7.035)，并且一个 克隆(cpa.7.035)在进行步骤1中的浓度测定时显示无滴度。速率常数和其相应传感图 下文显
霉素-链霉素(biological industries，03-031-1b)+300u/ml的rhil2(biolegend，509129)。
[0860]
肿瘤细胞系：在mhc-i单倍型hla-a2的情况下，人类黑素瘤细胞mel-624表达 mart-1和gp-100抗原。在完全dmem培养基(biological industries，01-055-1a)中 培养细胞，所述培养基补充有10％fbs(bi，04-127-1a)、25mm hepes缓冲液(bi， 03-025-1b)、1％glutamax(life technologies，35050-038)和1％青霉素-链霉素(biologicalindustries，03-031-1b)。
[0861]
til中的敲低：使用100pmol的dharmacon on-targetplus人类pvrigsirna-smart池(l-032703-02)或人类pd1 sirna-smart池(l-004435)或非靶向 sirna(d-001810-01-05)，进行til中的人类pvrig和人类pd1的敲低(kd)。将sirna 电穿孔到til中(amaxa，程序x-005)。对解冻24小时后在补充有il-2的完全imdm 中培养的静息til进行电穿孔。在电穿孔之后，将til接种到96孔tc板中，恢复24 小时。24小时后，收集细胞并用活力染料(bd horizon；目录号562247，bd生物科学) 染，用pbs洗涤并用抗人类pvrig-cpa.7.021(cpa.7.021igg2 a647，7.5μg/ml)或 用抗人类pd-1(biolegend，#329910af647，5μg/ml)在室温下染30分钟。所用的 同种型对照分别是西那吉斯(igg2 a647，7.5μg/ml)和小鼠igg1(biolegend#400130 a647，5μg/ml)。在macsquant分析仪(美天旎)上运行所有样品并且使用flowjo软 件(v10.0.8)分析数据。
[0862]
til与624黑素瘤细胞的共培养：收集经过sirna电穿孔的til并将其以5
×
104个 /孔接种在96tc板中。再次收集mel-624细胞并将其以1:1/1:3的e:t比接种在共培养 物中。将培养板在37℃，5％co2下孵育过夜(18小时)。
[0863]
为了评定抗pvrig抗体(cpa.7.021)、抗tigit(克隆10a7)和抗dnam1(克 隆dx11)对黑素瘤特异性til活性的影响，在以1:1的效靶比添加624黑素瘤靶细胞 之前，将til(1
×
105个细胞/孔)与测试抗体或相关同种型对照一起在单处理(10μg/ml) 中或在组合处理(各自最终10μg/ml)中预孵育。将培养板在37℃，5％co2下孵育过 夜(18小时)。
[0864]
til活化的评定：共培养16小时后，将细胞用活力染料(bd horizon；目录号562247，bd生物科学)染，用pbs洗涤并且暴露于fc阻断溶液(目录号309804，biolegend) 中，然后用抗cd8a(目录号301048，biolegend)和抗cd137(目录号309804，biolegend) 在4℃下表面染30分钟。在macsquant分析仪(美天旎)上运行所有样品并且使用 flowjo软件(v10.0.8)分析数据。收集培养上清液并且通过cba试剂盒(目录号560484， bd)分析细胞因子分泌。
[0865]
结果
[0866]
til中的pvrig敲低：将til mart-1和til f4与il-2培养24小时。将100pmol 的on-targetplus人类pvrig sirna-smart池(l-032703-02)或人类pd1 sirna-smart池(l-004435)或非靶向sirna(d-001810-01-05)电穿孔到til中 (amaxa，程序x-005)。电穿孔24小时后(并且在共培养之前)进行pvrig或pd-1 的检测。将细胞用活力染料染，然后与抗pvrig或抗pd-1一起室温孵育30分钟。 kd体的百分比指出在图82中。
[0867]
使用敲低的til进行功能分析：用编码人类pvrig或pd-1的sirna或作为对照 的乱序序列对与il2一起培养了24小时的人类til进行电穿孔。电穿孔24小时后测试 til的pvrig和pd-1表达。相比于经过乱序电穿孔的til，观察到约80％的pvrig敲 低和约50％的
pd-1敲低(图82)。
[0868]
将kd til与mel-624细胞以1:1或1:3的e:t一起培养18小时，并针对cd137的 表达进行染。在用pvrig sirna电穿孔的til mart-1中，类似于用pd-1sirna电 穿孔的til，相比于对照乱序sirna来说，显示出活化标志物cd137的水平升高(图 83a)。收集共培养上清液并测试所分泌的细胞因子的存在情况。相比于对照scr sirna， 用pvrig sirna电穿孔的til显示ifnγ和tnf水平显著增加。在经过pd-1sirna电 穿孔的til中显示出了类似的作用(图83b-c)。
[0869]
在til f4中观察到了相同的活化水平增加趋势。pvrig sirna电穿孔的til f4与 mel-624以1:3的e:t共培养导致cd137表面表达水平增加(图84a)以及共培养上清 液中ifnγ的分泌增加(图84b)。在经过pd-1sirna电穿孔的til中观察到类似趋势。
[0870]
使用阻断性ab进行功能分析：
[0871]
抗pvrig和抗tigit的体外单一疗法和组合疗法：将209个til与mel-624细胞 以1:1e:t培养18小时。收集共培养上清液并测试所分泌的细胞因子的存在情况。用抗 tigit处理不影响ifnγ或tnf分泌水平。然而，当以组合形式向共培养物中添加抗tigit 和抗pvrig时，观察到ifnγ和tnf水平增加(图85a-b)。
[0872]
抗pvrig和抗tigit的体外单一疗法和组合疗法：将209个til与mel-624细胞 以1:1e:t培养18小时。针对活化标志物cd137的表面表达对til进行染，并且在 用抗dnam-1处理后显示表达水平降低。收集共培养上清液并测试所分泌的细胞因子的 存在情况。抗dnam-1处理介导了增加所分泌的细胞因子ifnγ和tnf的趋势。用抗 dnam-1和抗pvrig组合处理部分地逆转了对cd137表达的影响(图86c)并增强了 对细胞因子ifnγ和tnf分泌的影响(图5a-b)。将mart-1til与mel-624细胞以1:1 e:t培养18小时。收集共培养上清液并测试所分泌的细胞因子的存在情况。用抗dnam-1 处理减少了til上的cd137表面表达以及所分泌的细胞因子ifnγ和tnf。用抗dnam-1 和抗pvrig组合处理部分地逆转了这些作用(图86d-f)。
[0873]
总结和结论
[0874]
pd1 kd改良了til活性，如通过f4和mart-1til中的ifnγ和分泌所测量。在 pvrig kd后，相比于对照sirna，在mart-1til中观察到ifnγ和tnf分泌增加(约 20％)。在与624黑素瘤细胞共培养后，在f4 til上关于cd137表达观察到相同趋势。
[0875]
抗tigit处理不影响与624mel共培养的til的ifnγ或tnf分泌水平，然而，当 以组合形式向共培养物中添加抗tigit和抗pvrig(cpa.7.021)时，观察到ifnγ和 tnf水平增加。
[0876]
抗dnam-1处理减少了til-mart-1活化，由减少的cd137和细胞因子分泌体现， 并且抗pvrig(cpa.7.21)与dnam-1ab组合处理可以部分地逆转这种作用。在til 209 中，在抗dnam-1的情况下，ifnγ和tnf分泌水平略微升高(约10％)；并且当以组 合形式向共培养物中添加抗dnam1和抗pvrig(cpa.7.021)时，观察到ifnγ和tnf 水平增加(分别是约40％和30％)。总的来说，我们的结果表明pvrig是pvrl2的新 的共抑制性受体。
[0877]
实例15抗pvrig抗体与抗tigit和抗pd1抗体组合对人类黑素瘤特异性til功能 的影响
[0878]
材料和方法
[0879]
til：使用来自三个黑素瘤患者的肿瘤浸润性淋巴细胞(til)：
[0880]
□
til-412-hla-a2-mart1特异性
[0881]
□
til-f4-hla-a2-gp100特异性
[0882]
□
til-209-hla-a2-gp100特异性
[0883]
在imdm(bi，01-058-1a)完全培养基中解冻til，所述培养基补充有10％人类血 清(西格玛，h3667)+1％glutamax(生命技术公司，35050-038)+1％丙酮酸钠(biologicalindustries，03-042-1b)+1％非必需氨基酸(biological industries，01-340-1b)+1％青 霉素-链霉素(biological industries，03-031-1b)+300u/ml的rhil2(biolegend，509129)。
[0884]
肿瘤细胞系：在mhc-i单倍型hla-a2的情况下，人类黑素瘤细胞mel-624表达 mart-1和gp-100抗原。在完全dmem培养基(biological industries，01-055-1a)中 培养细胞，所述培养基补充有10％fbs(bi，04-127-1a)、25mm hepes缓冲液(bi， 03-025-1b)、1％glutamax(生命技术公司，35050-038)和1％青霉素-链霉素(biologicalindustries，03-031-1b)。
[0885]
在抗pvrig、抗tigit和pd1阻断抗体存在下共培养til与624黑素瘤细胞：为 了评定抗pvrig抗体(cpa.7.021)、抗tigit(克隆10a7)和抗pd1(mab 1b8，默 克公司)对黑素瘤特异性til活性的影响，在以1:3的效靶比添加624黑素瘤靶细胞之 前，将til(3
×
104个细胞/孔)与测试抗体或相关同种型对照一起在单处理(10μg/ml) 中或在组合处理(各自最终10μg/ml)中预孵育。将培养板在37℃，5％co2下孵育过 夜(18小时)。
[0886]
til活化的评定：收集培养上清液并且通过cba试剂盒(目录号560484，bd)分 析细胞因子分泌。
[0887]
体外单一疗法抗pvrig和与抗tigit和pd1阻断抗体的组合疗法：将f4 til(gp100 特异性)与mel-624细胞以1:3e:t培养18小时。收集共培养上清液并测试所分泌的细 胞因子的存在情况。抗tigit或抗pd1处理不影响ifnγ或tnf分泌水平。然而，当以 组合形式向共培养物中添加抗tigit或抗pd1与抗pvrig的组合时，观察到ifnγ和 tnf水平增加(图87a-b)。
[0888]
抗pvrig、抗tigit和pd1单独处理不影响与624mel共培养的til的ifnγ或 tnf分泌水平，然而，当与抗pvrig(cpa.7.021)组合添加抗tigit或抗pd1抗体时， 观察到ifnγ和tnf水平增加。所呈现的数据表明，与抗tigit或抗pd1抗体的组合疗 法存在协同作用。
[0889]
实例16：使用报告基因分析，抗pvrig抗体对tcr信号传导的影响
[0890]
使用针对tcr信号传导的报告基因检测系统来测试抗pvrig抗体对tcr介导的信 号传导的影响，如jurkat-nfat-luc细胞系。这个jurkat细胞系衍生物在nfat反应元 件的控制下表达荧光素酶报告基因。用编码全长人类pvrig的载体转染这些细胞。作 为阴性对照，使用经过空载体转染的细胞。具有编码共刺激或共抑制参考分子的载体的 转染子充当阳性对照，如cd28和pd-1。通过在不存在或存在抗pvrig抗体的情况下 添加抗人类cd3(例如，okt3)来刺激转染子。同种型对照充当阴性对照。针对参考 分子的已知功能性抗体充当阳性对照。预计功能性激动性交联抗体会显示对荧光素酶活 性的抑制作用。
[0891]
实例17使用pvrl2-fc，抗pvrig抗体对t细胞活化的影响
[0892]
使用板结合分析测试抗pvrig抗体对t细胞活化、增殖和细胞因子分泌的影响。 使
用1μg/ml板结合的抗人类cd3(例如，okt3)和5μg/ml pvrl2-fc(由pvrl2的 ecd，即pvrig的对应物组成的重组性融合蛋白)或阴性对照刺激经过纯化的人类大 量t细胞。通过例如cd137的活化标志物的表达或通过如通过cfse染料(在刺激t 细胞之前，用cfse标记t细胞)的稀释所评估的细胞分裂来评估t细胞活化。还评定 了细胞因子产生(例如，ifng、il-2)作为t细胞活化的额外读出。使用t细胞亚型标 志物来区分对cd4或cd8 t细胞的特异性作用。共固定的pvrl2-fc可能对t细胞活 化具有基础的刺激作用，由t细胞上的pvrl2的已知共刺激对应物受体内源性dnam1 介导。在存在拮抗性抗pvrig ab的情况下，预计pvrl2-fc的这种刺激性基础作用被 进一步增强，因为其阻断了内源性pvrig对t细胞活化的抑制性影响。因此，预计激 动性抗pvrig ab显示t细胞活化的抑制。
[0893]
实例18：使用pvrl2异位表达细胞，抗pvrig抗体对t细胞活化的影响
[0894]
使用基于细胞的分析测试抗pvrig抗体对t细胞活化、增殖和细胞因子分泌的影 响。在与异位表达pvrl2或空载体的cho刺激细胞(表达膜结合的抗cd3的cho细 胞)共培养后，经过纯化的人类大量或cd4或cd8 t细胞被刺激。通过例如cd137的 活化标志物的表达或通过如通过cfse染料(在刺激t细胞之前，用cfse标记t细胞) 的稀释所评估的细胞分裂来评估t细胞活化。还评定了细胞因子产生(例如，ifnγ、il-2) 作为t细胞活化的额外读出。使用t细胞亚型标志物来区分对cd4或cd8 t细胞的特 异性作用。预计表达pvrl2的cho刺激子(stimulator)对t细胞活化具有基础性实例 19刺激作用，由t细胞上的pvrl2的已知共刺激对应物受体内源性dnam1介导。在 存在拮抗性抗pvrig ab的情况下，预计表面表达的pvrl2的这种刺激性基础作用被 进一步增强，因为其阻断了内源性pvrig对t细胞活化的抑制性影响。因此，预计激 动性抗pvrig ab显示t细胞活化的抑制。
[0895]
实例20使用seb分析，抗pvrig抗体对t细胞活化的影响
[0896]
使用来自健康的志愿者的血细胞和seb(葡萄球菌肠毒素b)超抗原结合并活化所 有表达vβ3和vβ8t细胞受体链的t细胞来测试抗pvrig抗体对t细胞活性的影响。 在96孔圆底板中培养人类pbmc并与测试抗体一起预孵育30-60分钟。然后添加10 ng/ml到10μg/ml范围内的各种浓度的seb。培养2到4天后收集上清液，并且通过 elisa或使用标准cba试剂盒对所产生的细胞因子(例如，il-2、ifnγ)的量进行定 量。seb通过全血细胞以剂量依赖性方式刺激细胞因子产生。测试若干ab剂量下抗 pvrig mab对细胞因子产生的影响。预计阻断抗pvrig mab可相对于对照igg增强 il-2产生。除了il-2之外，还可以在此分析中使用cba试剂盒测试ab对额外细胞因 子的水平的影响，如tnfα、il-17、il-7、il-6和ifnγ。
[0897]
实例21抗pvrig抗体在ag特异性分析中的作用
[0898]
用于概述抗人类pvrig抗体对健康的供体血液中预先存在的记忆t细胞的ag特异 性刺激的功能作用的分析是破伤风类毒素(tt)分析。为此目的，将新鲜制备的pbmc (2
×
105个细胞)涂铺在96孔圆底板中的完全rpmi 1640培养基(含有5％热灭活人类血 清)中，与不同浓度的测试抗体一起预孵育并用浓度为100ng/ml的tt(astartebiologics)刺激。在37℃下孵育细胞3到7天，之后收集上清液。通过elisa和/或cba 试剂盒测定细胞因子浓度(例如，il-2、ifn-γ)。相比于用单独的tt抗原所获得的， 预计阻断抗pvrig ab可增强t细胞增殖和细胞因子产生。
[0899]
类似于以上所述的使用tt来刺激人类记忆t细胞的方法，我们可以在对例如cmv、 ebv、流感hiv、腮腺炎和tb等额外抗原的回忆反应后，使用与上文所述类似的实验 装置测
试抗pvrig ab对t细胞活化的影响。使用如klh的新抗原，这还能够用于测 试抗pvrig抗体对初始细胞的刺激的影响。
[0900]
另外，测试抗pvrig ab对经过四聚体分选的ag特异性cd8 t细胞的抗原特异性 反应的影响，所述t细胞来自患有如hcv和hiv的病毒感染的患者的外周血。将经过 四聚体分选的cd8 t细胞与负载肽的自体pbmc共培养5天。评估cd8 ag特异性t 细胞的增殖和细胞因子(例如，ifnγ、il2、tnf-α)的分泌。相比于单独的抗原，我们 预计抗pvrig抗体可增强增殖和细胞因子产生。
[0901]
实例22融合瘤衍生的抗体针对pvrig的结合和功能分析
[0902]
本实例显示融合瘤衍生的抗体(cha抗体)与细胞系和原代白细胞中的人类和食蟹 猴pvrig蛋白质的结合的特征，以及融合瘤衍生的抗体阻断pvrig与pvrl2之间的 相互作用的能力的特征。
[0903]
方案
[0904]
hpvrig过表达细胞的facs分析：使用以下细胞系评定抗人类pvrig抗体的特异 性：hek亲本细胞和hek hpvrig过表达细胞。在dmem(gibco)+10％胎牛血清(gibco) +glutamax(gibco)中培养这些细胞。关于hek hpvrig过表达细胞，还向培养基中添 加0.5μg/ml嘌呤霉素(gibco)进行正选择。关于facs分析，收集所有对数生长期的 细胞系并且在96孔板中每孔接种50,000到100,000个细胞。以单点稀释液(5μg/ml) 或从10μg/ml开始的8点滴定系列在冰上添加抗人类pvrig抗体(migg1或migg2a) 和其相应对照，持续30分钟到1小时。滴定系列按1:3或1:3.3倍连续稀释进行。使用 facs canto ii(bd生物科学)或intellicyt(intellicyt公司)采集数据并使用flowjo (treestar)和prism(graphpad)软件分析。
[0905]
针对hpvrig对人类细胞系进行facs分析：使用以下细胞系评定抗人类pvrig抗 体的表达和特异性：jurkat和hepg2。在rpmi培养基+10％胎牛血清、glutamax、非必 需氨基酸(gibco)、丙酮酸钠(gibco)和青霉素/链霉素(gibco)中培养jurkat细胞。 在dmem+10％胎牛血清+glutamax中培养hepg2细胞。关于facs分析，收集所有对 数生长期的细胞系并且在96孔板中每孔接种50,000到100,000个细胞。以单点稀释液 (5μg/ml)或从10μg/ml开始的8点滴定系列在冰上添加抗人类pvrig抗体(migg1 或migg2a)和其相应对照，持续30分钟到1小时。滴定系列按1:3或1:3.3倍连续稀释 进行。使用facs canto ii或intellicyte采集数据并使用flowjo和prism软件分析。
[0906]
针对hpvrig对初始人类原代白细胞进行facs分析：通过外周血(斯坦福血库) 的ficoll(通用电气医疗集团)梯度分离获得原代白细胞。将白细胞作为经过分离的外 周血单核细胞(pbmc)于10％dmso(西格玛)、90％胎牛血清混合物中以介于1
×
107与5
×
107个细胞/毫升之间的密度冷冻在液氮中。为了评定pvrig在pbmc上的蛋白质 表达，设计针对主要免疫亚组的抗体鸡尾酒，包括人类抗pvrig抗体。以单点稀释液 (5μg/ml)或在一些情况下从10μg/ml开始的4点滴定系列在冰上添加抗人类pvrig抗 体(migg1或migg2a)和其相应对照，持续30分钟到1小时。
[0907]
简单来说，向复苏的pbmc中添加抗体鸡尾酒混合物，以5
×
105到1
×
106个细胞/ 孔接种，然后是fc受体阻断和活/死染(aqua live/dead，生命技术公司)。将抗体鸡 尾酒与pbmc一起在冰上孵育30分钟到1小时。接着洗涤pbmc并且使用facs cantoii通过facs采集
数据。使用flowjo和prism软件分析数据。所分析的免疫亚组包括 cd56暗淡nk细胞、cd56明亮nk细胞、cd4+t细胞、cd8+t细胞、非常规t细胞 (例如，nkt细胞和γδt细胞)、b细胞以及单核细胞。
[0908]
食蟹猴pvrig工程改造的过表达细胞的facs分析：使用以下细胞系评定抗人类 pvrig抗体与食蟹猴pvrig(cpvrig)的交叉反应性：expi亲本细胞和expi cpvrig 过表达细胞。在dmem+10％胎牛血清+glutamax中培养这些细胞。通过使用neon转染 系统将cpvrig dna电穿孔到亲本expi细胞中产生expi cpvrig瞬时过表达细胞。关 于facs分析，使用转染1到3天后的expi cpvrig细胞。收集对数生长期的亲本expi 细胞。在96孔板中每孔每种类型接种50,000到100,000个细胞。以单点稀释液(5μg/ml) 或从10μg/ml开始的8点滴定系列在冰上添加抗人类pvrig抗体(migg1或migg2a) 和其相应对照，持续30分钟到1小时。滴定系列按1:3或1:3.3倍连续稀释进行。使用 facs canto ii或intellicyte采集数据并使用flowjo和prism软件分析。
[0909]
初始原代食蟹猴白细胞的facs分析：从表达分析前不超过24小时抽取的新鲜血 液获得原代食蟹猴(cyno)白细胞。血液来源于生物再生。为了评定pvrig在cyno pbmc 上的蛋白质表达，设计针对主要免疫亚组的抗体鸡尾酒，包括人类抗pvrig抗体。以 单点稀释液(5μg/ml)或从10μg/ml开始的8点滴定系列在冰上添加抗人类pvrig抗 体(migg1或migg2a)和其相应对照，持续30分钟到1小时。
[0910]
简单来说，向pbmc中添加抗体鸡尾酒混合物，以5
×
105到1
×
106个细胞/孔接种， 然后进行fc受体阻断和活/死染。将抗体鸡尾酒与pbmc一起在冰上孵育30分钟到1 小时。接着洗涤pbmc并且使用facs canto ii通过facs采集数据。使用prism软件 分析数据。所分析的免疫亚组包括cd16+淋巴细胞、cd14+/cd56+单核细胞/骨髓细胞 和cd3+t细胞。
[0911]
基于细胞的竞争分析：在细胞竞争分析中评定pvrig抗体抑制pvrig与其配体 pvrl2的相互作用的能力。在此分析中，配体pvrl2在未被操控的hek细胞上内源性 表达并添加可溶性fc标记的pvrig(由金斯瑞根据需要制造)。在这种情况下，通过向 100,000个hek细胞中相伴地添加33nm可溶性pvrig蛋白质和pvrig抗体(0.066-66 nm)并在冰上孵育1小时来评定pvrig抗体阻断可溶性pvrig与hek细胞结合的能 力。通过在冰上添加抗人类fc alexa 647(杰克逊实验室(jackson laboratories))，持续 20-30分钟来检测pvrig fc结合程度。将细胞在pbs中洗涤两次，使用facs canto ii 进行采集。使用flowjo(treestar)、excel(微软)和prism(graphpad)分析数据。
[0912]
结果
[0913]
融合瘤pvrig抗体识别过表达细胞上的pvrig：为了筛选对pvrig具有特异性的 抗体，我们评定了由两个融合瘤周期产生的抗体结合经过工程改造以过表达人类pvrig 的hek细胞系的能力。大部分来自这些周期的抗体都结合到hek hpvrig细胞，尽管 亲和力不同。此外，这些抗体中的大部分还显示出与hek亲本细胞系的低背景结合， 指示针对pvrig的高特异性。图77显示了pvrig抗体的特异性的一个实例。在融合 瘤周期中产生的抗体与hek hpvrig细胞相对于对照的所有结合特征的汇总呈现在图 79中。
[0914]
pvrig抗体识别初始nk和t细胞上的pvrig蛋白质：在初始pbmc亚组上展示 最高水平的pvrig的体是nk和cd8 t细胞，并且这两个细胞亚组之间的绝对表达 水平是相似的(gmfi)。cd4 t细胞显示低水平的pvrig，而b细胞和单核细胞具有非 常低的可检测表达/无
可检测表达。如通过抗体检测的初始nk细胞和cd8 t细胞上的 表达的汇总显示在图91中。其它次要亚组也展现了pvrig表达并且包括非常规t细胞， 如nkt细胞和γδt细胞。在所获得的和分析的所有供体中，在pbmc亚组上的表达模 式非常相似。
[0915]
通过融合瘤衍生的pvrig抗体检测jurkat细胞系上的pvrig：除了对pbmc进行 pvrig蛋白质表达筛选之外，我们还想要了解它是否也在癌细胞系上表达。我们选择鉴 于pvrig rna的高表达来筛选jurkat细胞上的我们的抗体。我们还选择hepg2作为阴 性对照细胞系来进一步验证我们的抗体的特异性。大多数融合瘤衍生的抗体确实检测到 pvrig蛋白质在jurkat细胞上的表达(图79pvrig融合瘤抗体与原代人类pbmc、cyno 过表达细胞和cyno原代pbmc结合的特征)。expi cyno oe表示经过cpvrig瞬时转染 的expi细胞，expi par表示expi亲本细胞。gmfir指示pvrig抗体染的几何mfi相 对于其对照的倍数差异。浓度指示计算gmfir时的浓度。未测试指示因为缺少与人类 hek hpvrig、expi cpvrig细胞的结合或不符合pbmc亚组的结合要求而未进行测试 的抗体。突出显示的抗体是进行人源化的四个抗体(参见图90)。
[0916]
图92)，但不是hepg2细胞(数据未示出)。jurkat上的pvrig检测的实例显示在 图78中，代表性抗体为cpa.7.518。
[0917]
基于细胞的生化分析：在细胞生化分析中筛选出我们的29个融合瘤抗体之后，我 们发现存在20个明显阻断剂和9个pvrig-pvrl2相互作用的非阻断剂。所有阻断抗体 都能够使pvrig fc与hek细胞的相互作用抑制至少50％，其中这些抗体中的大多数完 全消除了pvrig fc结合。与确实显示出阻断能力的那些抗体相关的ic
50
值报告在图92 中。大部分ic
50
值介于20到60nm之间。
[0918]
总结和结论
[0919]
使用融合瘤平台，我们已经能够成功地产生针对人类pvrig抗原的单克隆抗体。 使用经过工程改造的过表达细胞以及一系列癌细胞系，我们证明了，我们的抗体对 pvrig抗原很有特异性，并且能够检测与rna表达相关的蛋白质表达。在人类pbmc 亚组的分析后，我们证明了，pvrig蛋白质在nk和t细胞上表达最高，并且在b细 胞和骨髓细胞上低/阴性表达。通过评定这些抗体与过表达细胞的结合，我们还证明了一 定比例的这些抗体可与食蟹猴(cyno)pvrig抗原交叉反应。此外，cyno pbmc上的表 达模式类似于人类pbmc。最后，我们通过基于facs的竞争分析能够证明，一定比例 的我们的融合瘤抗体能够抑制pvrig与其配体pvrl2的相互作用。就所有前述数据来 说，显示出最佳特征的抗体是cha-7-518、cha-7-524、cha-7-530和cha-7-538。
[0920]
实例23.cha抗pvrig抗体在mlr分析中的作用
[0921]
用于概述抗人类pvrig抗体对同种异体抗原反应的功能作用的分析是在混合淋巴 细胞反应(mlr)分析中人类cd8+t细胞的增殖。如本领域中已知，mlr是提供t 细胞功能的体外相关性的离体细胞免疫分析。
[0922]
预计抗pvrig抗体响应于来自mhc错配供体的细胞增强人类cd4和cd8 t细胞 的增殖。通过使用人类t细胞rosettesep rtm(stemcell technologies)，根据制造商的 说明书，从一个供体(例如，供体a)的全血富集人类t细胞。在分离之后，用cfse 染料(分子探针公司)对细胞进行荧光标记。为了充当同种异体抗原呈递细胞(apc)， 首先从来自mhc错配供体(例如，供体b)的全血中分离出单核细胞，然后是cd3+t 细胞耗竭。然后在铯辐射器中
用2500拉德辐射apc。
[0923]
一般来说，如下进行mlr分析。将人类t细胞和150,000个同种异体apc在含有 150,000个cd8+t细胞和apc的96孔平底板中与不同浓度的抗pvrig抗体共培养5 天。在第5天收集细胞，洗涤并且相继用抗cd8生物素、抗生蛋白链菌素-percp染。 通过facs运行样品以评定如由cfse稀释液所描绘的增殖程度。预计功能阻断性抗 pvrig抗体可响应于来自mhc错配供体的细胞增强t细胞增殖和细胞因子分泌。
[0924]
使用mlr分析表征本发明的cha抗体对静息的和活化的人类t细胞的生化影响， 并且表征融合瘤衍生的抗体在mlr环境中调节t细胞增殖的能力。
[0925]
方案
[0926]
混合淋巴细胞反应(mlr)：通过在同种异体环境中共培养源自不同供体的树突状 细胞(dc)和t细胞来建立混合淋巴细胞反应。通过将经过纯化的单核细胞与100ng/mlgm-csf(安迪生物科技公司)和100ng/ml il-4(安迪生物科技公司)培养7天产生 dc。7天后，将经过纯化的cfse标记的cd3 t细胞与dc以10:1的比率组合并且在x vivo-20无血清培养基(龙沙(lonza))中培养5天。在一些条件下，向培养板中添加 10μg/ml未结合的抗pvrig抗体或同种型对照抗体。设置三种mlr分析排列，其中将 来自一个供体的dc与来自另外3个同种异体供体的cd3 t细胞共培养。所有血液产品 全来源于斯坦福血库。
[0927]
表达和功能分析：在5天mlr培养之后，通过cfse稀释液和如cd25和pd-1的 活化标志物的表达评定t细胞活化和增殖的水平和程度。使用来自噬菌体周期和融合瘤 周期的内部(in-house)抗pvrig抗体评定pvrig的表达。还按动力学方式评定了pvrig 配体pvrl2在dc上的表达。使用流式细胞仪采集所有数据并使用flowjo(treestar) 和prism(graphpad)软件进行数据分析。
[0928]
基于facs的表位分析：因为我们在mlr中测试了抗体阵列，所以我们想要确定 这些抗体是否可以根据基于facs的结合进行表位
‘
分库’，并且这种
‘
分库’是否与所述分 析中t细胞活化和增殖的改变有关。为此，将从分析中收集到的t细胞与未结合的pvrig 抗体一起预孵育，并且然后用不同克隆的结合的pvrig抗体进行复染。结合的pvrig 抗体在t细胞上给出信号的程度指示这个抗体必须针对t细胞上的pvrig结合与未结 合的抗体竞争的程度。阴性或低信号将指示存在高竞争，指示两个抗体在同一个表位
‘
库
’ꢀ
中。高信号将指示低竞争或无竞争，并且因此将认为抗体在不同的
‘
库’中。
[0929]
结果
[0930]
pvrl2在单核细胞衍生的dc上的表达：为了确定就mlr分析来说pvrl2是否将 在dc上表达，由单核细胞产生dc，并且在添加gm-csf和il-4之后按每天一次的时 间间隔以动力学方式评定pvrl2表达。如图72中所指示，pvrl2表达从第0天起直到 第5天一直在增加，在第5天，表达达到峰值。在第6天，表达相比于第5天略微降低。 在第7天，表达类似于第6天，指示pvrl2表达在这些时间点稳定了。因此，在恰当 的时间点dc表达的pvrl2适用于mlr分析。
[0931]
在mlr培养之后pvrig在t细胞上的表达：许多在mlr中调节功能的t细胞受 体在增殖t细胞上表达。因此，我们想要确定pvrig是否也表达。我们分析了在mlr 共培养开始后第5天的增殖t细胞，并且通过其cfse稀释(即cfse低)进行表征。 如图73和图74中所示，相对于同种型对照(migg1)，pvrig在cfse低细胞上表达， 如通过多个pvrig抗体在所分析的三
个供体中在cd4和cd8 t细胞上所测定。在图73 中所示的facs图指示cfse低细胞上的pvrig，并且图74中的条形图指示pvrig相 对于migg1的表达水平。
[0932]
pvrig抗体增强t细胞增殖：在已经证明了pvrig表达在mlr中在增殖t细胞 上表达之后，我们想要确定用pvrig抗体处理是否会影响t细胞增殖的水平。如图4 中所示，向mlr分析中添加pvrig抗体能够相比于对照提高所测试的所有融合瘤抗体 中cfse低细胞的百分比。在所分析的所有供体中都观察到了这一点。
[0933]
pvrig抗体与pvrig上的多个表位结合：为了比较pvrig抗体结合pvrig上的 不同表位的能力，我们进行了竞争实验，其中将来自mlr的t细胞与衍生自我们的融 合瘤周期的未标记的抗pvrig抗体一起培养5天。然后在第5天收集t细胞并且用衍 生自我们的噬菌体周期的结合的抗pvrig抗体(cpa.7.021)复染。如图76中所示，当 相比于背景荧光水平时，观察到在含有cha.7.516-m1、cha.7.518-m1、cha.7.524-m1、cha.7.530-m1和cha.7.538-m1的条件下cpa.7.021结合完全减少或接近完全减少，表 明这些抗体在表位识别中可以重叠。在cha.7.537-m1、cha.7.528-m1和cha.7.548-m1 的情况下，观察到cpa.7.021结合部分减少，表明在表位识别中部分重叠。在与 cha.7.543-m1预培养的细胞中，观察到cpa.7.021结合无减少，表明缺乏表位识别。 总的来说，这份数据指示，当相对于cpa.7.021进行评定时，来自我们的周期的pvrig 抗体可以识别pvrig上至少3个不同的表位。
[0934]
结论：我们表征了我们的pvrig抗体与增殖的和静息的t细胞结合的能力，以及 其在mlr中的功能活性。在增殖t细胞上检测到多个pvrig抗体的结合并且所述结合 在增殖t细胞上比在静息t细胞上，尤其是cd8+亚组上高。这份数据证明pvrig表达 在t细胞活化后增加。此外，相比于migg1同种型，若干pvrig抗体提高了t细胞增 殖，指示其还能够调节t细胞功能。如上，这些抗体全都具有阻断pvrig与其配体pvrl2 的能力。基于这点，我们得出以下结论：通过阻断pvrig-pvrl2相互作用，这些抗体 引起t细胞活化和增殖增加，这是将用于癌症的免疫检查点抑制剂的所期望的作用 的标志性指示。最后，我们进行竞争实验，相对于噬菌体衍生的抗体比较了多个融合瘤 衍生的pvrig抗体与活化的t细胞的结合。根据这个系列的实验，我们为我们的噬菌 体和融合瘤衍生的抗体的表位多样性提供了证据。
[0935]
实例24.抗pvrig抗体在与免疫检查点阻断组合后对t细胞活化的影响
[0936]
预计pvrig阻断与已知免疫检查点(例如，pd1、pdl-1或tigit)的阻断性ab 的组合进一步增强了以上所描绘的分析中对t细胞活化的刺激作用。
[0937]
实例25.pvrig抗体的功能分析
[0938]
表征本发明的人类pvrig抗体抑制pvrig与其配体pvrl2的相互作用的能力和 其在基于原代细胞的分析中调节效应淋巴细胞功能的能力。
[0939]
方案
[0940]
基于细胞的生化分析
[0941]
在两种方向的细胞生化分析格式中评定pvrig抗体抑制pvrig与其配体pvrl2 的相互作用的能力。
[0942]
在第一方向，配体pvrl2在未被操控的hek细胞上内源性表达并且添加可溶性生 物素标记的fc标记的pvrig(由金斯瑞根据需要制造)。在这种情况下，通过两种排列 评定pvrig抗体阻断可溶性pvrig与hek细胞结合的能力。在第一排列中，将各种 浓度的pvrig抗
体(范围0.066-66nm)与33nm的可溶性pvrig一起在磷酸盐缓冲 盐水(pbs，gibco)中在冰上孵育30分钟。随后将这个复合物添加到100,000个hek 细胞中并在冰上再孵育1小时。1小时后，在pbs中洗涤hek细胞两次并且通过添加 与alexa 647(杰克逊实验室)结合的抗生蛋白链菌素在冰上持续30分钟来检测可溶性 pvrig与hek细胞的结合程度。将hek细胞在pbs中洗涤两次，并且再悬浮于100μl 的pbs中以便在facs canto ii(bd生物科学)上采集。使用flowjo(treestar)和prism (graphpad)软件分析数据。在第二排列中，向100,000个hek细胞中同时添加33nm 的可溶性pvrig蛋白质和pvrig抗体(0.066-66nm)并在冰上孵育1小时。用于分析 此排列的后续步骤等效于第一排列。
[0943]
在第二方向，将hek细胞工程改造成过表达pvrig并添加可溶性生物素标记的fc 标记的pvrl2(cd生物科学)。在这种情况下，向100,000个hek hpvrig或亲本hek 细胞中同时添加各种浓度的pvrig抗体(范围0-200nm)与160nm可溶性pvrl2， 并在pbs+1％bsa+0.1％叠氮化钠(facs缓冲液)中在冰上孵育1小时。通过在冰上 添加facs缓冲液中的抗生蛋白链菌素alexa 647持续30分钟来检测可溶性pvrl2结 合。将细胞在facs缓冲液中洗涤两次，并且再悬浮于50μl的pbs中以便在intellicythtfc(intellicyt)上采集。使用flowjo(treestar)、excel(微软)和prism(graphpad) 分析数据。
[0944]
原代nk细胞分析
[0945]
具有最强的pvrig表达谱的pbmc亚组在nk细胞上。因此，我们用表达pvrl2 的肿瘤细胞设计了基于nk细胞的共培养分析来判定我们的抗体是否可以调节nk细胞 介导的针对这些靶标的细胞毒性。我们选择的靶标是急性b细胞淋巴细胞性白血病细胞 系reh(atcc细胞库)和急性骨髓性白血病细胞系molm-13(dsmz细胞库)。使reh 和molm-13细胞在rpmi培养基(gibco)+20％胎牛血清(gibco)、glutamax(gibco)、 青霉素/链霉素(gibco)、非必需氨基酸(gibco)、丙酮酸钠(gibco)、hepes(gibco) 和β-巯基乙醇(gibco)中生长。
[0946]
在共培养分析两天前，使用人类nk细胞分离试剂盒(美天旎生物技术公司)分离 原代nk细胞并在rpmi培养基+20％胎牛血清、glutamax、青霉素/链霉素、非必需氨基 酸、丙酮酸钠、hepes、β-巯基乙醇和250u/ml il-2(安迪生物科技公司)中培养。在 分析当天，收集nk细胞，进行计数并与pvrig抗体一起在室温下预孵育15-30分钟。 在此孵育期间，从培养物中收集靶细胞，用钙黄绿素am(生命技术公司)在37℃下标 记30分钟，在培养基中洗涤，并且经过计数以用于所述分析。建立nk细胞介导的细 胞毒性分析，其中将恒定量的靶细胞(50,000个)与跟5μg/ml的pvrig抗体预孵育过 的递增浓度的nk细胞共培养(由此改变nk细胞与靶标的比率)。或者，在分析中使用 固定的nk细胞与靶标的比率，但是在剂量滴定中nk细胞与不同浓度的pvrig抗体(范 围3.9ng/ml-5μg/ml)一起预孵育。在添加了nk细胞和靶标之后，使培养板在1,400rpm 下脉冲旋转1分钟并且放置在37℃下5％co2气氛中，持续4小时。4小时后，使培养 板在1,400rpm下旋转4分钟，并且收集80μl的上清液以对从靶细胞释放的钙黄绿素 am进行定量。通过spectramax gemini xs荧光计(分子仪器公司)评定从靶标释放的 钙黄绿素am的数量。作为钙黄绿素am释放的对照，通过在分析的持续时间内将靶细 胞暴露于70％乙醇或仅培养基中来评定总释放和自发释放。使用下式计算nk细胞的杀 死水平(按百分比计)：
[0947]
(样品释放-自发释放)/(总释放-自发释放)*100
[0948]
除了pvrig抗体之外，在一些情况下，还添加了针对nk细胞受体的其它抗体作 为
比较，如tigit(基因泰克(genentech)，克隆10a7，专利号：wo2009126688 a2) 和dnam-1(biolegend，克隆11a8)。
[0949]
结果
[0950]
基于细胞的生化分析：在细胞生化分析中筛选出一组我们的pvrig抗体之后，我 们发现在所测试的抗体中，抑制水平不同，并且抑制水平取决于分析的排列和方向(图 98)。在图93中具体显示了四个抗体来说明这些要点。相对于对照给出最强的抑制作用 的分析方向和排列是在向hek细胞中添加与pvrig抗体一起预孵育过的可溶性pvrig 时(图93a)。在这种排列中，相比于另外三个抗体(cpa.7.002、cpa.7.005和cpa.7.050)， cpa.7.021显示出最佳的绝对阻断能力。尽管阻断水平有差异，但是这个排列中的所有 抗体都显示出类似的ic
50
值，这些值在低纳摩尔范围内，并且阻断能力在较高的浓度下 达到稳定。
[0951]
当在向hek细胞中同时添加可溶性pvrig和pvrig抗体时测量由四个pvrig抗 体所产生的绝对抑制水平时，在所述分析中观察到较多的阻断可变性(图93b)。 cpa.7.021依然是最佳阻断抗体。然而，cpa.7.002和cpa.7.005所显示的抑制可溶性 pvrig与hek细胞结合的能力明显小于对照抗体。相比于cpa.7.021、cpa.7.002和 cpa.7.005，cpa.7.050显示中等阻断水平。绝对抑制水平的这种差异还对应于每个抗体 的ic
50
值的差异。cpa.7.021和cpa.7.050再次显示低纳摩尔ic
50
值，但他们均高于分 析的第一排列中。相比之下，cpa.7.002和cpa.7.005的ic
50
值大幅增加，cpa.7.002增 加了约20倍，并且cpa.7.005增加了约30倍。这份数据指示抗体如何必须与pvrig与 其同源配体的结合相竞争，将指示抗体能够阻断这种相互作用的效能。
[0952]
当生化分析的方向逆转(即评定pvrl2fc与hek hpvrig细胞的结合)时，四个pvrig抗体阻断pvrl2 fc相互作用的能力是可变的(图93c)。与使用hek细胞作为 靶标的生化分析一致(图93a-b)，cpa.7.021和cpa.7.050抑制pvrl2 fc与hek hpvrig 细胞结合，并且其阻断结合的能力是相似的。然而出人意料的是，我们看到在存在 cpa.7.002和cpa.7.005抗体的情况下pvrl2 fc结合增强，在使用hek细胞作为靶标 时我们并没有观察到这一点。
[0953]
采用reh细胞进行nk细胞的细胞毒性分析：在nk细胞的细胞毒性分析中我们研 究的第一靶标是reh系。最初选择reh是因为它在流式细胞仪中显示稳固的pvrl2水 平，但是如nkg2d配体的其它活化配体的频率低，并且pvr的表达低(图94)。不使 用传统的nk细胞靶标，如k562，这是因为其对高频率nkg2d配体的表达和pvr的 表达高，这些会掩盖pvrig抗体的功能作用。重要的是，reh细胞不表达任何已知与 pvrl2和pvr相互作用的nk细胞受体，如tigit、dnam-1和pvrig。
[0954]
在此分析中筛选出一组我们的pvrig抗体之后，我们发现了四个能够调节nk细 胞介导的细胞毒性的抗体(图99)。这四个抗体是在生化分析结果部分中被讨论的那些： cpa.7.002、cpa.7.005、cpa.7.021和cpa.7.050。在所有情况下，这些抗体的添加都增 强了nk细胞介导的针对reh细胞的细胞毒性(图95a-c)。cpa.7.002和cpa.7.005的 添加最大地增强了细胞毒性(图95a-b)，其次是cpa.7.021和cpa.7.050，它们显示出 类似的增强水平(图95c)。图95d显示通过cpa.7.002和cpa.7.021获得的nk细胞介 导的细胞毒性的增强的浓度依赖性分析。向分析中与reh细胞一起添加针对已报导也结 合pvrl2的受体(如tigit和dnam-1)的阻断抗体作为比较。如图95e-f中所示， tigit和dnam-1抗体的添加在此分析
0037)和抗人类cd28 ab(克隆cd28.2；目录号16-0289)购自ebioscience。戴 诺磁珠m-450epoxy(目录号140.11)购自英杰。人类血液的血块黄层从lifesource获 得。ficoll-paque plus(目录号17-1440-02)购自通用电气医疗集团。
[0966]
使用ficoll分离从血块黄层分离pbmc：将全部的pbmc悬浮于离体20培养基中， 并且用3000拉德辐射。使用cd4+人类t细胞分离试剂盒ii(美天旎)，根据制造商的 说明书从三个健康人类供体血液的血块黄层中分离出初始cd4+t细胞，并与经过辐射 的自体pbmc以1:1的比率(1.5
×
105个t细胞，每孔1.5
×
105个经过辐射的pbmc)共 培养。用抗cd3(0.5μg/ml)和抗cd28(0.5μg/ml)抗体活化培养物。向培养物中添 加指定浓度的抗pvrig抗体或pvrig ecd蛋白质。培养24小时后，用h3-胸苷给细 胞施加脉冲。培养72小时后收集细胞。
[0967]
关于ecd实验，预计结果是引起t细胞增殖和/或活化的剂量依赖性抑制，支持基 于免疫抑制性pvrig的剂(例如，根据本发明的至少一些实施例的pvrig多肽或 pvrig融合蛋白)的以下潜能：用于t细胞驱动的自身免疫疾病，如类风湿性 关节炎、多发性硬化症、牛皮癣和发炎性肠病；以及用于其它免疫相关疾病和/或用 于减少在基因或细胞疗法之后不合需要的免疫活化。基本上，激动pvrig的免疫抑制 性pvrig蛋白质应该防止或减少t细胞的活化和这类病况的疾病病理学中所涉及的促 炎性细胞因子的产生。
[0968]
另外，预计这些结果还支持免疫刺激性抗pvrig抗体的以下潜能：降低pvrig 的抑制活性以将受益于增强的免疫反应的病况，如癌症、传染病、尤其是慢性感染 以及脓毒症的免疫疗法。基本上，免疫刺激性抗pvrig抗体将促进t细胞的活化并引 起促炎性细胞因子的产生，从而促进癌性或被感染细胞或感染物的耗竭。
[0969]
实例28：t细胞活化分析的抑制.
[0970]
在这些实验中，在珠粒分析中分析pvrig ecd或抗pvrig抗体对t细胞活化的影 响。
[0971]
材料和方法
[0972]
人类t细胞的分离：从斯坦福血库从健康人类供体获得血块黄层。使用rosettesep 试剂盒(stemcell technologies)根据制造商的说明书从血块黄层分离出cd3+t细胞。 通过流式细胞仪用抗cd45和抗cd3分析细胞以评估所获得的cd3+细胞的百分比。在 解冻之后在分析之前评估活力。
[0973]
珠粒涂布和qc：用抗cd3 mab和pvrig ecd蛋白质或抗pvrig抗体在两步方 案中以500
×
106/ml涂布甲苯磺酰基活化的珠粒(英杰，目录号14013)：50μg/ml人类抗cd3克隆utch1(安迪生物科技公司，目录号mab 100)于磷酸钠缓冲液中，在37℃ 下过夜，然后是0-320μg/ml的pvrig ecd蛋白质或抗pvrig抗体，再在37℃下孵育 过夜。
[0974]
分析结合到珠粒上的pvrig蛋白质(ecd或抗体)的量。
[0975]
珠粒分析设置：将100k人类cd3+t细胞与100k或200k涂有各种浓度的pvrig 蛋白质的珠粒在完全imdm(gibco，目录号12440-053)中培养5天，所述完全imdm 补充有2％ab人类血清(gibco，目录号34005-100)、glutmax(gibco，目录号35050-061)、 丙酮酸钠(gibco，目录号11360-070)、mem非必需氨基酸溶液(gibco，目录号11140-050) 以及2-巯基乙醇(gibco，目录号21985)。在5天培养结束时，用抗cd25、抗cd4、 抗cd8和可固定的活死染料给细胞染以测定每个细胞亚组上的cd25表达水平。收集 上清液并且通过elisa(人类infγduoset，安迪生物科技公司，dy285)分析ifnγ分 泌。
[0976]
在这些实验中，分析与涂有各种浓度的pvrig蛋白质的珠粒共培养过的人类cd3 t 细胞的cd25表达水平。预期cd4+和cd8+细胞均显示受到pvrig-ecd融合蛋白的剂 量依赖性抑制，或反之，预期cd4+和cd8+细胞均显示受到pvrig-抗体的剂量依赖性 活化。
[0977]
实例29：抗人类pvrig抗体的基于食蟹猴交叉反应性的表位作图(epitope mapping)
[0978]
原理和目标
[0979]
本研究的目标是为了鉴别pvrig蛋白质上决定抗人类pvrig抗体对食蟹猴(cyno) 直系同源物的交叉反应性的表位。许多针对人类pvrig靶标的主导抗体显示不同程度 的食蟹猴交叉反应性，尽管事实上这些抗体中的许多属于同一个表位库。为了弄清人类 /食蟹猴交叉反应性(或其缺乏)的分子基础，设计了若干食蟹猴到人类的pvrig重组 蛋白突变，使其表达并进行纯化，并且在elisa中测试其与一组抗人类pvrig抗体的 结合。
[0980]
方法
[0981]
食蟹猴到人类的pvrig变异体的设计：人类和pvrig胞外结构域(ecd)的序列 比对显示人类与食蟹猴直系同源物之间90％的序列同一性和93％的序列同源性(图 100)。基于突变的性质(保守的对比非保守的)和突变区的二级结构预测(卷曲对比延 伸)，设计食蟹猴pvrig的三种定点突变体来探测以食蟹猴交叉反应性为重点的表位作 图。这些突变体包括h61r、p67s和l95r/t97i cyno pvrig。还产生了野生型食蟹猴和 人类pvrig。
[0982]
食蟹猴、人类和混合pvrig变异体的表达和纯化：所有pvrig变异体全都在哺乳 动物细胞中表达为具有c端6
×
his标签的ecd融合体。通过亲和纯化、离子交换谱 和尺寸排阻谱纯化蛋白质。将经过纯化的蛋白质的缓冲液更换为pbs缓冲液(ph 7.4) 并储存在4℃下。
[0983]
用于测定pvrig-抗体相互作用的elisa：如下进行功能性elisa：将食蟹猴、人 类和食蟹猴/人类混合pvrig(his标记的)重组蛋白吸附到ia培养板上，在4℃下过 夜。将涂布后的板孔用pbs冲洗两次并且与300μl阻断缓冲液(5％脱脂奶粉，于pbs 中，ph 7.4)一起在室温(rt)下孵育1小时。去除阻断缓冲液并且再用pbs冲洗培养 板两次。将板结合的pvrig变异体与抗人类pvrig mab(人类igg1同种型)一起在 溶液(线性范围0.1μg/ml到8μg/ml，体积是50μl/孔)中在室温下孵育1小时。将 培养板用pbs-t(pbs 7.4，0.05％吐温20)洗涤三次，接着用pbs洗涤三次，并且添加 50μl/孔的hrp结合的第二抗体(人类igg fc结构域特异性，jackson immunoresearch)。 将此在室温下孵育1小时并再次洗涤培养板。通过添加50μl的sureblue tmb底物(kpl 公司)并且孵育5-20分钟，在所有孔中产生elisa信号。通过添加50μl 2n h2so
4 (vwr)停止hrp反应并且在spectramax(分子仪器公司)或envision(珀金埃尔默) 分光光度计上读取450nm下的吸光度信号。将数据导出到excel(微软)中并在graphpadprism(graphpad软件公司)中绘成图。
[0984]
结果
[0985]
s67、r95和i97残基作为食蟹猴交叉反应性的决定子：图101中所示的结合数据清 楚显示，s67、r95和i97残基影响各种抗体的食蟹猴交叉反应性。虽然p67s食蟹猴到 人类的突变不利地影响cpa.7.002和cpa.7.041的结合，但是l95r/t97i食蟹猴到人类 的突变显著改良了cpa.7.002、cpa.7.021、cpa.7.028和cpa.7.041的结合。另一方面， h61r食蟹猴到人类的突变不影响任何所测试抗体的结合。
[0986]
与食蟹猴到人类变异体的相对结合表明了三个表位组：抗体与食蟹猴、人类和混合 pvrig变异体的相对结合表明了3个不同的表位组：第1组结合到r95/i97残基 (cpa.7.021和cpa.7.028)。第2组结合到s67和r95/i97残基(cpa.7.002和cpa.7.041)。 第3组不结合s67或r95/i97残基(cpa.7.024和cpa.7.050)。表位组显示与这些抗体 的食蟹猴交叉反应程度的强相关性(图102)。绘制elisa信号随抗体浓度而变的图。
[0987]
总结和结论
[0988]
在pvrig ecd中基于食蟹猴到人类的变异的限定表位作图鉴定了s67、r95和i97 残基为抗人类pvrig抗体的食蟹猴交叉反应性的决定子。cpa.7.021和cpa.7.028抗体 与l95r/t97i cyno pvrig的结合完全恢复并且cpa.7.002与此突变体的结合改良有利地 表明，r95和i97残基是这些抗体的关键人类pvrig表位。这些发现还表明了一种可能 基于非人类灵长类pvrig直系同源物的一级氨基酸序列来预测与所述直系同源物的交 叉反应性的方式。
[0989]
因此，本发明提供以下实施方案：
[0990]
1.一种活化患者的细胞毒性t细胞(ctl)的方法，包含向所述患者投予抗pvrig 抗体，其中所述患者的所述ctl的亚组被活化。
[0991]
2.一种活化患者的nk细胞的方法，包含向所述患者投予抗pvrig抗体，其中所 述患者的所述nk细胞的亚组被活化。
[0992]
3.一种活化患者的γδt细胞的方法，包含向所述患者投予抗pvrig抗体，其中所 述患者的所述γδt细胞的亚组被活化。
[0993]
4.一种活化患者的th1细胞的方法，包含向所述患者投予抗pvrig抗体，其中所 述患者的所述th1细胞的亚组被活化。
[0994]
5.一种减少或消除患者体内的调节性t细胞(treg)中的至少一种的细胞数量和/ 或活性的方法，包含向所述患者投予抗pvrig抗体。
[0995]
6.一种增加患者体内的干扰素-γ产生和/或促炎性细胞因子分泌的方法，包含向所 述患者投予抗pvrig抗体。
[0996]
7.一种患者的癌症的方法，包含向所述患者投予抗pvrig抗体，其中所述癌 症被。
[0997]
8.一种抑制患者体内的pvrig和pvlr2的相互作用的方法，包含向所述患者投予 抗pvrig抗体。
[0998]
9.根据实施方案1到8中任一项所述的方法，其中所述患者具有癌症。
[0999]
10.根据实施方案9所述的方法，其中所述癌症选自以下组成的组：前列腺癌、肝癌 (hcc)、结肠直肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、子宫颈癌、头颈 癌、甲状腺癌、睾丸癌、泌尿道上皮癌、肺癌、黑素瘤、非黑素瘤皮肤癌(鳞状细胞癌 和基底细胞癌)、神经胶质瘤、肾癌(rcc)、淋巴瘤(nhl或hl)、急性骨髓性白血病 (aml)、t细胞急性成淋巴细胞性白血病(t-all)、弥漫性大b细胞淋巴瘤、睾丸生 殖细胞肿瘤、间皮瘤以及食道癌。
[1000]
11.根据实施方案189到10中任一项所述的方法，其中抗pvrig抗体包含选自以下 组成的组的抗体的vhcdr1、vhcdr2、vhcdr3、vlcdr1、vlcdr2以及vlcdr3序列： cpa.7.021、cpa.7.001、cpa.7.003、cpa.7.004、cpa.7.006、cpa.7.008、cpa.7.009、cpa.7.010、cpa.7.011、cpa.7.012、cpa.7.013、cpa.7.014、cpa.7.015、cpa.7.017、 cpa.7.018、
cpa.7.019、cpa.7.022、cpa.7.023、cpa.7.024、cpa.7.033、cpa.7.034、 cpa.7.036、cpa.7.040、cpa.7.046、cpa.7.047、cpa.7.049以及cpa.7.050。
[1001]
12.根据实施方案189到10中任一项所述的方法，其中所述抗pvrig抗体包含选自 以下组成的组的抗体的vhcdr1、vhcdr2、vhcdr3、vlcdr1、vlcdr2以及vlcdr3 序列：cha.7.502、cha.7.503、cha.7.506、cha.7.508、cha.7.510、cha.7.512、 cha.7.514、cha.7.516、cha.7.518、cha.7.520.1、cha.7.520.2、cha.7.522、cha.7.524、 cha.7.526、cha.7.527、cha.7.528、cha.7.530、cha.7.534、cha.7.535、cha.7.537、 cha.7.538.1、cha.7.538.2、cha.7.543、cha.7.544、cha.7.545、cha.7.546、cha.7.547、 cha.7.548、cha.7.549以及cha.7.550。
[1002]
13.根据实施方案189到10中任一项所述的方法，其中所述抗pvrig抗体选自以下 组成的组：cpa.7.001、cpa.7.003、cpa.7.004、cpa.7.006、cpa.7.008、cpa.7.009、 cpa.7.010、cpa.7.011、cpa.7.012、cpa.7.013、cpa.7.014、cpa.7.015、cpa.7.017、 cpa.7.018、cpa.7.019、cpa.7.021、cpa.7.022、cpa.7.023、cpa.7.024、cpa.7.033、 cpa.7.034、cpa.7.036、cpa.7.040、cpa.7.046、cpa.7.047、cpa.7.049以及cpa.7.050。
[1003]
14.一种诊断癌症的方法，包含：
[1004]
a)使来自患者的组织与抗pvrig抗体接触；并且
[1005]
b)判定所述组织中pvrig的过表达的存在作为癌症存在的指示。
[1006]
15.根据实施方案14所述的方法，其中所述组织是血液样品。
[1007]
16.根据实施方案14所述的方法，其中所述组织是实体肿瘤的活检。
[1008]
17.根据实施方案14到16所述的方法，其中所述抗pvrig抗体经过标记。
[1009]
18.根据实施方案17所述的方法，其中使结合到所述抗pvrig抗体的第二标记抗体 与所述样品接触。
[1010]
19.一种抗pvrig抗原结合结构域，包含：
[1011]
a)重链可变结构域，包含来自抗pvrig抗体的vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3； 和
[1012]
b)轻链可变结构域，包含来自所述抗pvrig抗体的vlcdr1vlcdr2和vlcdr3；
[1013]
其中所述抗pvrig抗体选自以下组成的组：cpa.7.021、cpa.7.001、cpa.7.003、 cpa.7.004、cpa.7.006、cpa.7.008、cpa.7.009、cpa.7.010、cpa.7.011、cpa.7.012、 cpa.7.013、cpa.7.014、cpa.7.015、cpa.7.017、cpa.7.018、cpa.7.019、cpa.7.022、 cpa.7.023、cpa.7.024、cpa.7.033、cpa.7.034、cpa.7.036、cpa.7.040、cpa.7.046、cpa.7.047、cpa.7.049、cpa.7.050、cha.7.502、cha.7.503、cha.7.506、cha.7.508、 cha.7.510、cha.7.512、cha.7.514、cha.7.516、cha.7.518、cha.7.520.1、 cha.7.520.2、cha.7.522、cha.7.524、cha.7.526、cha.7.527、cha.7.528、 cha.7.530、cha.7.534、cha.7.535、cha.7.537、cha.7.538.1、cha.7.538.2、 cha.7.543、cha.7.544、cha.7.545、cha.7.546、cha.7.547、cha.7.548、cha.7.549 以及cha.7.550。
[1014]
20.根据实施方案19所述的抗pvrig抗原结合结构域，其中所述抗体是单链fv (scfv)，其中所述重链可变结构域和所述轻链可变结构域通过scfv连接子共价连接。
[1015]
21.一种抗pvrig抗体，包含：
[1016]
a)重链可变结构域，包含来自抗pvrig抗体的vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3； 和
[1017]
b)轻链可变结构域，包含来自所述抗pvrig抗体的vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3；
[1018]
其中所述抗pvrig抗体选自以下组成的组：cpa.7.021、cpa.7.001、cpa.7.003、 cpa.7.004、cpa.7.006、cpa.7.008、cpa.7.009、cpa.7.010、cpa.7.011、cpa.7.012、 cpa.7.013、cpa.7.014、cpa.7.015、cpa.7.017、cpa.7.018、cpa.7.019、cpa.7.022、 cpa.7.023、cpa.7.024、cpa.7.033、cpa.7.034、cpa.7.036、cpa.7.040、cpa.7.046、 cpa.7.047、cpa.7.049、cpa.7.050、cpa.7.021、cpa.7.001、cpa.7.003、cpa.7.004、 cpa.7.006、cpa.7.008、cpa.7.009、cpa.7.010、cpa.7.011、cpa.7.012、cpa.7.013、 cpa.7.014、cpa.7.015、cpa.7.017、cpa.7.018、cpa.7.019、cpa.7.022、cpa.7.023、 cpa.7.024、cpa.7.033、cpa.7.034、cpa.7.036、cpa.7.040、cpa.7.046、cpa.7.047、 cpa.7.049、cpa.7.050、cha.7.502、cha.7.503、cha.7.506、cha.7.508、cha.7.510、 cha.7.512、cha.7.514、cha.7.516、cha.7.518、cha.7.520.1、cha.7.520.2、 cha.7.522、cha.7.524、cha.7.526、cha.7.527、cha.7.528、cha.7.530、cha.7.534、 cha.7.535、cha.7.537、cha.7.538.1、cha.7.538.2、cha.7.543、cha.7.544、 cha.7.545、cha.7.546、cha.7.547、cha.7.548、cha.7.549以及cha.7.550。
[1019]
22.一种抗pvrig抗体，它与包含以下的抗体竞争结合：
[1020]
a)重链可变结构域，包含来自抗pvrig抗体的vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3； 和
[1021]
b)轻链可变结构域，包含来自所述抗pvrig抗体的vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3；
[1022]
其中所述抗pvrig抗体选自以下组成的组：cpa.7.021、cpa.7.001、cpa.7.003、 cpa.7.004、cpa.7.006、cpa.7.008、cpa.7.009、cpa.7.010、cpa.7.011、cpa.7.012、cpa.7.013、cpa.7.014、cpa.7.015、cpa.7.017、cpa.7.018、cpa.7.019、cpa.7.022、 cpa.7.023、cpa.7.024、cpa.7.033、cpa.7.034、cpa.7.036、cpa.7.040、cpa.7.046、 cpa.7.047、cpa.7.049、cpa.7.050、cpa.7.021、cpa.7.001、cpa.7.003、cpa.7.004、 cpa.7.006、cpa.7.008、cpa.7.009、cpa.7.010、cpa.7.011、cpa.7.012、cpa.7.013、 cpa.7.014、cpa.7.015、cpa.7.017、cpa.7.018、cpa.7.019、cpa.7.022、cpa.7.023、 cpa.7.024、cpa.7.033、cpa.7.034、cpa.7.036、cpa.7.040、cpa.7.046、cpa.7.047、 cpa.7.049、cpa.7.050、cha.7.502、cha.7.503、cha.7.506、cha.7.508、cha.7.510、 cha.7.512、cha.7.514、cha.7.516、cha.7.518、cha.7.520.1、cha.7.520.2、 cha.7.522、cha.7.524、cha.7.526、cha.7.527、cha.7.528、cha.7.530、cha.7.534、 cha.7.535、cha.7.537、cha.7.538.1、cha.7.538.2、cha.7.543、cha.7.544、 cha.7.545、cha.7.546、cha.7.547、cha.7.548、cha.7.549以及cha.7.550。
[1023]
23.一种组合物，包含选自以下组成的组的抗pvrig抗体：cpa.7.001、cpa.7.003、 cpa.7.004、cpa.7.006、cpa.7.008、cpa.7.009、cpa.7.010、cpa.7.011、cpa.7.012、 cpa.7.013、cpa.7.014、cpa.7.015、cpa.7.017、cpa.7.018、cpa.7.019、cpa.7.021、 cpa.7.022、cpa.7.023、cpa.7.024、cpa.7.033、cpa.7.034、cpa.7.036、cpa.7.040、 cpa.7.046、cpa.7.047、cpa.7.049以及cpa.7.050。
[1024]
24.一种组合物，包含选自以下组成的组的抗pvrig抗体：h518-1、h518-2、h518-3、 h518-4、h518-5、h524-1、h524-2、h524-3、h524-4、h530-1、h530-2、h530-3、h530-4、 h530-5、h538.1-1、h538.1-2、h538.1-3、h538.1-4、h538.2-1、h538.2-2以及h538.2-3。
[1025]
25.一种核酸组合物，包含：
[1026]
a)第一核酸，编码包含来自抗pvrig抗体的vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3的 重链可变
结构域；和
[1027]
b)第二核酸，编码包含来自所述抗pvrig抗体的vlcdr1vlcdr2和vlcdr3、 vhcdr3的轻链可变结构域；
[1028]
其中所述抗pvrig抗体选自以下组成的组：cpa.7.021、cpa.7.001、cpa.7.003、 cpa.7.004、cpa.7.006、cpa.7.008、cpa.7.009、cpa.7.010、cpa.7.011、cpa.7.012、 cpa.7.013、cpa.7.014、cpa.7.015、cpa.7.017、cpa.7.018、cpa.7.019、cpa.7.022、 cpa.7.023、cpa.7.024、cpa.7.033、cpa.7.034、cpa.7.036、cpa.7.040、cpa.7.046、 cpa.7.047、cpa.7.049、cpa.7.050、cha.7.518、cha.7.524、cha.7.530以及 cha.7.538。
[1029]
26.一种表达载体组合物，包含：
[1030]
a)第一表达载体，包含根据实施方案25所述的所述第一核酸；和
[1031]
b)第二表达载体，包含根据实施方案25所述的所述第二核酸。
[1032]
27.一种表达载体组合物，包含：包含根据实施方案25所述的所述第一核酸和根据 实施方案25所述的所述第二核酸的表达载体。
[1033]
28.一种宿主细胞，包含所述表达载体组合物，包含根据实施方案26或27所述的表 达载体组合物。
[1034]
29.一种制造抗pvrig抗体的方法，包含：
[1035]
a)在表达所述抗体的条件下培养根据实施方案28所述的宿主细胞；并且
[1036]
b)回收所述抗体。
[1037]
30.一种活化患者的细胞毒性t细胞(ctl)的方法，包含向所述患者投予根据实施 方案19到24所述的抗体，其中所述患者的所述ctl的亚组被活化。
[1038]
31.一种活化患者的nk细胞的方法，包含向所述患者投予根据实施方案19到24 所述的抗体，其中所述患者的所述nk细胞的亚组被活化。
[1039]
32.一种活化患者的γδt细胞的方法，包含向所述患者投予根据实施方案19到24 所述的抗体，其中所述患者的所述γδt细胞的亚组被活化。
[1040]
33.一种活化患者的th1细胞的方法，包含向所述患者投予根据实施方案19到24 所述的抗体，其中所述患者的所述th1细胞的亚组被活化。
[1041]
34.一种减少或消除患者体内的调节性t细胞(treg)中的至少一种的细胞数量和/ 或活性的方法，包含向所述患者投予根据实施方案19到24所述的抗体。
[1042]
35.一种增加患者体内的干扰素-γ产生和/或促炎性细胞因子分泌的方法，包含向所 述患者投予根据实施方案19到24所述的抗体。
[1043]
36.一种抑制患者体内的pvrig和pvlr2的相互作用的方法，包含向所述患者投予 根据实施方案19到24所述的抗体。
[1044]
37.一种患者的癌症的方法，包含向所述患者投予根据实施方案19到24中任一 项所述的抗体。

技术特征：

1.一种活化患者的细胞毒性t细胞(ctl)的方法，包含向所述患者投予抗pvrig抗体，其中所述患者的所述ctl的亚组被活化。2.一种活化患者的nk细胞的方法，包含向所述患者投予抗pvrig抗体，其中所述患者的所述nk细胞的亚组被活化。3.一种活化患者的γδt细胞的方法，包含向所述患者投予抗pvrig抗体，其中所述患者的所述γδt细胞的亚组被活化。4.一种活化患者的th1细胞的方法，包含向所述患者投予抗pvrig抗体，其中所述患者的所述th1细胞的亚组被活化。5.一种减少或消除患者体内的调节性t细胞(treg)中的至少一种的细胞数量和/或活性的方法，包含向所述患者投予抗pvrig抗体。6.一种增加患者体内的干扰素-γ产生和/或促炎性细胞因子分泌的方法，包含向所述患者投予抗pvrig抗体。7.一种患者的癌症的方法，包含向所述患者投予抗pvrig抗体，其中所述癌症被。8.一种抑制患者体内的pvrig和pvlr2的相互作用的方法，包含向所述患者投予抗pvrig抗体。9.根据权利要求1到8中任一项所述的方法，其中所述患者具有癌症。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述癌症选自以下组成的组：前列腺癌、肝癌(hcc)、结肠直肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、子宫颈癌、头颈癌、甲状腺癌、睾丸癌、泌尿道上皮癌、肺癌、黑素瘤、非黑素瘤皮肤癌(鳞状细胞癌和基底细胞癌)、神经胶质瘤、肾癌(rcc)、淋巴瘤(nhl或hl)、急性骨髓性白血病(aml)、t细胞急性成淋巴细胞性白血病(t-all)、弥漫性大b细胞淋巴瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、间皮瘤以及食道癌。

技术总结

本发明属于生物科学和医药领域。本发明针对抗PVRIG抗体和其使用方法，其中所述抗PVRIG抗体包含：分别如SEQ ID NO：885-887所示的vhCDR1-3和分别如SEQ ID NO：889-891所示的vlCDR1-3；或分别如SEQ ID NO：981-983所示的vhCDR1-3和分别如SEQ ID NO：985-987所示的vlCDR1-3。本发明还涉及包含所述抗体的药物组合物、编码所述抗体的核酸、用于制备所述抗体的载体和宿主细胞以及所述抗体在疾病中的用途。的用途。的用途。

技术研发人员：

M

受保护的技术使用者：

康姆普根有限公司

技术研发日：

2016.02.19

技术公布日：

2022/11/18