广藿香PTS基因的克隆及CPEC法构建其过表达载体pRI101-PTS 黄伟展;胡贞贞;卢昌华;张宏意;何梦玲;严寒静
【摘 要】目的克隆广藿香中广藿香醇合酶(PTS)基因的cDNA序列,并构建其pRI101-PTS植物表达载体。方法利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)获得PTS基因的cDNA序列,利用生物信息学软件对T-A克隆后的序列进行分析,预测其编码蛋白的理化性质、结构和功能。以环形聚合酶延伸克隆(CPEC)构建pRI101-PTS过表达载体。结果PTS基因的开放阅读框全长1659bp,编码552个氨基酸。该蛋白分子量为64.1ku,等电点为5.39,含有DDxxD保守序列,具有2个倍半萜合酶结构域,C末端结构域268个氨基酸残基可能涉及线性萜烯的环化,成功构建了pRI101-PTS过表达载体。结论PTS的克隆、植物过表达载体的构建及生物信息学分析为其他倍半萜类合成酶基因的发现和研究提供了参考,也为进一步研究其生物合成调控机制甚至代谢工程奠定基础。 【期刊名称】《广东药科大学学报》
【年(卷),期】2019(035)002
磁化杯
【总页数】7页(P186-192)
【关键词】广藿香;广藿香醇合酶;倍半萜合酶;环形聚合酶延伸克隆;生物信息学
【作 者】黄伟展;胡贞贞;卢昌华;张宏意;何梦玲;严寒静
【作者单位】[1]广东药科大学中药学院,广东广州510006;[1]广东药科大学中药学院,广东广州510006;[1]广东药科大学中药学院,广东广州510006;[1]广东药科大学中药学院,广东广州510006;[2]国家中医药管理局岭南药材生产与开发重点研究室,广东广州510006;[3]中药材国家现代农业产业技术体系广州综合试验站(CARS-21-16),广东广州510006;[1]广东药科大学中药学院,广东广州510006;[2]国家中医药管理局岭南药材生产与开发重点研究室,广东广州510006;[3]中药材国家现代农业产业技术体系广州综合试验站(CARS-21-16),广东广州510006;[1]广东药科大学中药学院,广东广州510006;[2]国家中医药管理局岭南药材生产与开发重点研究室,广东广州510006;[3]中药材国家现代农业产业技术体系广州综合试验站(CARS-21-16),广东广州510006
【正文语种】三极管自锁电路中 文
悬浮机器人【中图分类】R284.1
广藿香来源于唇形科刺蕊草属植物Pogostemon cablin (Blanco) Benth.的干燥地上部分，为“十大广药”之一，具芳香化浊、和中止呕、发表解暑之功效。作为传统的芳香化湿药，广藿香挥发油具有抗氧化、镇痛、抗感染、抗血栓、抗抑郁等生物活性[1-2]，被作为医药领域的重要原料。此外，还被广泛应用于食品、化妆品领域[3]。广藿香油的组分多为倍半萜类化合物，数量超过24 种，其中以广藿香醇为主要成分[4]。因此，研究广藿香中倍半萜类化合物生物合成的分子机理，提高药材中广藿香油，尤其是广藿香醇的产量，对广藿香药用资源的开发和应用具有重要意义。
载体构建
广藿香醇合酶(patchoulol synthase，PTS)是广藿香中合成广藿香醇的关键酶，能催化倍半萜的前体法呢基焦磷酸(farnesyl diphosphate，FDP)生成广藿香醇等倍半萜类化合物[5]。2006年，Deguerry等[4]从印度广藿香中成功克隆了PTS基因的cDNA序列。同年， Wu Shuiqin[6]将PTS基因与禽类的法呢基焦磷酸合酶(FPPS，催化合成FDP的酶)基因分别都加入叶绿体转运肽序列，在烟草中实现FPPS和PTS蛋白重定向，并检测到转化植株中广藿香醇质量分数达到0.5 μg/g(鲜重)。2014年，Hartwig等[7]从印度广藿香栽培品中克隆了PTS
基因的cDNA 序列，发现与Deguerry克隆的序列存在3.4%的差异。Hartwig将PTS基因cDNA序列进行密码子优化后构建到3种pET系列载体上，在3种大肠杆菌中进行异源表达，结果发现该PTS基因变体的表达产物催化FDP生成的主产物并非广藿香醇而是大根香叶烯A。这与他们团队的前期研究结果并不相符，通过对PTS蛋白的结构分析，Hartwig发现该现象很大程度上是由于454和458号氨基酸的替换造成的。总体而言，广藿香中倍半萜的生物合成的分子机理研究相对较少，尚未见到该基因在广藿香中成功过表达的报道，随着对倍半萜类化合物的代谢途径及调控机理的深入研究，对植物体进行基因改造，将有望成为提高药用植物中倍半萜类有效成分合成水平的有效方法[8]。
环形聚合酶延伸克隆(Circular Polymerase Extension Cloning，CPEC)是一种简单、有效和经济的环状DNA组装和克隆方法。CPEC利用具有互补末端的引物，使线性双链DNA片段和载体末端产生重叠序列，然后通过具有末端重叠序列的线性双链DNA片段和载体经过变性和退火得到具有重叠末端的单链产物。最后彼此互为模板和引物，在DNA聚合酶的作用下进行延伸得到在两条链不同位置分别有两个缺口的环状载体，重组载体直接转化大肠杆菌，利用大肠杆菌体内的修复机制得到完整双链环状质粒的克隆方法[9-10]。由于该方法对引物Tm值差值要求苛刻，所以引物设计过程较繁琐，目前采用这个方法构建过表达载体
的报道相对较少。
dm134本研究对海南儋州广藿香的PTS基因进行克隆，采用CPEC法构建pRI101-PTS过表达载体，并进行生物信息学分析，以期为转染广藿香并进一步研究广藿香的倍半萜生物合成途径及其调控表达机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
广藿香Pogostemon cablin (Blanco) Benth.植株采集自海南儋州，并移栽至广东药科大学大学城校区中药学院。克隆菌株DH5α、植物表达载体pRI101-AN均购自TAKARA公司。
1.2 仪器和试剂
TRIpure Reagent(北京艾德莱生物科技有限公司)、FastKing一步法RT-PCR试剂盒、超薄琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、快速质粒小提试剂盒(均购自天根生化有限公司)、琼脂糖(Biowest公司)、ExRed核酸电泳染料、6×Loading Buffer(庄盟生物)、Recombinant DNase I、PrimeSTAR®Max DNA Polymerase(TAKARA公司)。
1.3 引物设计
根据GenBank中PTS基因的CDS 序列(登录号AY508730.1、KF983531.1和KP694233.1)，用CloneManager8软件针对OFR进行引物设计。
ORF扩增引物PTS-F：5′-ATGGAGTTGTATGCC CAAAGTG-3′，PTS-R:5′-TTAATATGGAACAGGGTG AAGGTAC-3′。环形聚合酶延伸克隆(CPEC)引物PTS-CPEC-F:5′-CTGTTGATAGCCACCATGGAGTTG TATGCC-3′,PTS-CPEC-R:5′-GATTCAGAATTCGGA TCCTTAATATGGAACAGGGTGAAGG- 3′以及pRI101-F:5′-CATACAACTCCATGGTGGCTATCAACAGTGAAG AAC-3′,pRI101-R:5′-CACCCTGTTCCATATTAAGGA TCCGAATTCTGAATCAAC-3′(引物由华大基因合成)。
2 方法
2.1 广藿香总RNA的提取与PTS基因的克隆
2.1.1 广藿香总RNA的提取及cDNA的合成 取广藿香新鲜叶片100 mg，用毛刷除去表面泥沙，加适量的液氮于预冷的研钵中充分研磨成粉末，迅速转移至EP管中，提取步骤参照TR
Ipure Reagent说明书进行。提取完成后，用Recombinant DNase I进行消化。1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA 完整性，并用超微量紫外分光光度计测定其浓度和纯度。
在冰浴条件下配制RT-PCR反应液：2×FastKing One Step RT-PCR Master Mix 25 μL，25×RT-PCR Enzyme Mix 2 μL，total RNA 3 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1.25 μL，RNase-Free ddH2O补足50 μL。
PCR 程序为：42 ℃逆转录3 min，95 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，共35个循环，72 ℃终延伸5 min。将得到的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收目的条带，并测定cDNA的浓度和纯度。-20 ℃保存。
2.1.2 PTS基因的T-A克隆 连接转化及菌液PCR加样过程均在超净工作台完成。在灭菌离心管中配置反应液：(2×)RapiLigation Mix 5 μL，pGM-T Fast Vector(50 ng/μL)1 μL，目的PCR片段3 μL，ddH2O补足10 μL。将连接产物转化克隆感受态T1，复苏菌体后取50 μL涂LB平板(Amp 50 mg/L)，于37 ℃培养箱中培养过夜。挑取单菌落接种于1 mL LB液体培养基(含Amp 50 mg/L)中(以下均简称为BL-Amp液体培养基)，37 ℃、200 r/min培养4 h，用引物PTS-F/ R进行菌液PCR鉴定。取阳性克隆菌液按100∶1体积比接种至6 mL BL-Amp液
体培养基，过夜培养。取1 mL菌液加60%甘油0.5 mL，-80 ℃保存菌种。剩下的5 mL菌液提取重组质粒，检查浓度纯度，取适量送华大基因测序，剩余质粒于-20 ℃保存。测序结果用DNAman进行序列拼接，并用Blastn进行序列比对。tt277
2.2 环形聚合酶延伸克隆(CPEC)构建pRI101-PTS过表达载体
2.2.1 PTS基因同源臂的引入 PCR反应体系：pGM-T-PTS重组质粒(160 ng/μL)1 μL，PTS-CPEC-F(10 μmol/L)1.5 μL，PTS-CPEC-R(10 μmol/L)1.5 μL，PrimeSTAR® Max DNA Polymerase 25 μL，ddH2O补足50 μL。
PCR反应条件：95 ℃预变性3 min，98 ℃变性10 s，70 ℃退火5 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环，72 ℃终延伸5 min。产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，回收目的片段，并检测浓度及纯度，备用。
2.2.2 pRI101-AN载体线性化及同源臂的引入 PCR反应体系：pRI101-AN载体(200 ng/μL) 1 μL，pRI101-F(10 μmol/L) 1 μL，pRI101-R(10 μmol/L) 1 μL，PrimeSTAR® Max DNA Polymerase 25 μL，ddH2O补足50 μL。
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