以AdMax载体系统构建携带HCV NS5B基因的重组腺病毒表达载体 孙士敏;徐斌;范红梅
【摘 要】目的 构建表达丙型肝炎病毒(HCV)非结构基因NS5B的重组腺病毒表达载体,并对其相关指标进行鉴定,为进一步研究防止丙型肝炎感染的基因免疫和基因奠定实验基础.方法 应用基因工程技术将HCV NS5B基因定向克隆至穿梭质粒pDC316上,利用脂质体介导的方法将AdMax腺病毒包装系统的骨架质粒pBHGloxΔE1、3Cre和穿梭质粒pDC316-NS5B共转染293细胞,进行同源重组,产生重组腺病毒pAd-NS5B并进行鉴定、反复感染293细胞进行扩增,扩增后测定重组病毒滴度.结果 重组病毒颗粒pAd-NS5B经双引物PCR、凝胶电泳证明插入片段与HCV非结构基因NS5B片段大小相符;经测序证明其插入序列与设计HCV NS5B基因序列完全一致,扩增后重组病毒滴度达到2.3×1013 IU/L.结论 成功构建了表达HCV NS5B基因的重组腺病毒载体. 【期刊名称】《医学综述》
【年(卷),期】2010(016)015
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【总页数】4页(P2379-2382)
【关键词】服务器管理腺病毒载体;NS5B基因;丙型肝炎病毒
【作 者】孙士敏;徐斌;范红梅
【作者单位】广州医学院附属深圳沙井医院内一科,广东,深圳,518104;首都医科大学附属北京佑安医院感染内科,北京,100069;广州医学院附属深圳沙井医院内一科,广东,深圳,518104
【正文语种】中 文
【中图分类】R512.6
丙型肝炎病毒(hepatitisC virus,HCV)感染呈世界流行趋势[1],是导致慢性肝炎的主要致病因子,有75%～85%的急性丙型肝炎转为慢性。其中20%的患者在10～20年后进而发展为肝硬化和肝细胞性肝癌等严重疾病,严重威胁人类健康[2]。由于HCV基因组包膜蛋白的高度变异性以及准种的存在,目前除干扰素外尚无有效预防和手段,研制能激发广谱、强大的细胞应答的疫苗来控制HCV感染,将成为研究的热点[3]。将编码目的抗原的外源基因导入的各类
新型疫苗备受重视,以重组复制缺陷型腺病毒为载体的疫苗,能有效地将外源基因导入体内并使之高效表达,诱导机体产生针对目的抗原的免疫应答。本研究旨在采用AdM ax载体系统,通过体内同源重组构建表达HCV NS5B基因的重组腺病毒载体pAd-NS5B,探索以NS5B抗原为基础研制丙肝重组腺病毒疫苗的可能性,为进一步研究丙型肝炎基因免疫和基因奠定基础。
1.1 材料
1.1.1 质粒和菌株 含HCV NS5B基因的质粒pMD 19/NS5B、人胚肾HEK293细胞(由北京佑安医院感染科徐斌博士惠赠);穿梭质粒pDC316、pBHGlox(delta)E1、3C re质粒购自加拿大M icrobix B iosystem Inc公司;感受态细菌JM 109购自TaKaRa公司。
1.1.2 酶类及主要生化试剂 质粒提取试剂盒、DNA片段纯化试剂盒、细胞病毒DNA提取试剂盒购于Q IAGEN公司;L ipofectam ineTM 2000购自Invitro-gen公司;500 bp DNA M arker及EcoR I、SalI及EXTaq酶、T4 DNA连接酶均购自TaKaRa公司;聚合酶链式反应(po lym erase chain reaction,PCR)引物由上海英俊生物科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 质粒提取、酶切、连接及转化 参照文献[4]的方法进行。
1.2.2 PCR引物设计 参考已在GenBank中发表的HCV 1b型基因序列(序列号:M 84754),应用p rim er6.0程序设计特异性HCV 1b型NS5B基因上游引物P1和下游引物P2(表1)。序列测定,序列测定由上海英俊生物科技有限公司完成。
1.2.6 重组腺病毒pA d-Core的扩增、纯化及病毒颗粒数、滴度测定 重组腺病毒pAd-NS5B病毒液以MO I=10的量感染HEK293细胞进行扩增,收集病毒上清液,按文献[5]对复制缺陷型病毒进行纯化和浓缩。紫外分光光度计测定A260值,按VP/m L=A260×样品稀释度×1.1×1012计算病毒颗粒数。并检测半数细胞培养物感染量TC ID50,按照AdM ax操作手册中的公式:T(IU/mL)=101+d(s-0.5)计算病毒的滴度(d为稀释度的对数值,s为病变比例的和)。
2.1 重组质粒pDC316-NS5B鉴定 由于NS5B基因上游区域和下游区域分别引入了EcoR I和SalⅠ位点,重组穿梭质粒pDC316/HCV-NS5B经EcoRⅠ、SalⅠ双酶切,可见2个大小分别为1872 bp的目的基因条带和4167 bp的穿梭质粒pDC316条带,而pDC316质粒经双酶切仅见4167 bp的pDC316条带(图1),与预期结果一致。
1.2.3 重组穿梭质粒pDC316-NS5B的构建及鉴定设计HCV NS5B基因上、下游引物。以pMD 19/ NS5B质粒为模板扩增编码NS5B基因,扩增条件为: 94℃预变性2 m in,随后35个循环为94℃1 m in、55℃1m in、72℃2m in,最后72℃延伸7m in,PCR产物进行琼脂糖电泳分析,琼脂糖凝胶回收1791 bp片段。以EcoR I和SalⅠ双酶切目的基因片段并插入至经同样双酶切的穿梭质粒pDC316中,经酶切鉴定重组克隆后,将其命名为重组穿梭质粒pDC316-NS5B。
1.2.4 重组腺病毒pAd-NS5B的包装 转染前1 d将2×105的293细胞接种至24孔板中,在37℃、5% CO2培养箱中孵育过夜。在500μL Op ti-M EM培养基中加入L ipofectam ine 2000 20μL,pBHGloxΔE1, 3Cre质粒6.5μg,pDC316-NS5B质粒1.5μg。上述混合液室温放置15m in,以100μL/孔的量加上述混合液至24孔板中,放回培养箱继续培养5 h后,换新鲜培养基继续培养直至观察到细胞病变效应的出现。同时以培养的正常293细胞作为对照。
1.2.5 重组腺病毒的双引物PCR鉴定
1.2.5.1 双引物PCR检测 以病毒的DNA为模板,用HCV NS5B特有引物(引物P1+P2,表1)及根据GenBank中腺病毒E2B区序列设计引物(P3+ P4,见表1)进行双重引物PCR扩增,扩增条件
同前,扩增产物进行琼脂糖电泳分析,NS5B cDNA引物理论扩增长度为1791 bp,腺病毒E2B理论扩增长度为880 bp。
1.2.5.2 测序 对腺病毒载体中的插入片段进行
氧化锡
2.2 重组腺病毒的包装 pBHGloxΔE1,3C re与pDC316/HCV-NS5B共转染HEK293细胞后第9天,出现特征性细胞病变,即细胞变大变圆,折光性增强,随后出现串珠样改变直至葡萄簇样改变,并开始出现明显噬斑甚至细胞脱落,而正常细胞未出现此现象(图2)。
2.3 重组腺病毒的鉴定
2.3.1 PCR检测 pAd-NS5B感染的293细胞基因组DNA以NS5B基因特异性引物和腺病毒E2B区特异性引物扩增可得到1791 bp的NS5B基因的特异条带和880 bp腺病毒骨架E2区片段,与预期大小相符;而在对照293细胞基因组DNA中扩增不到任何条带(图3)。
2.3.2 序列测定 经测序证明NS5B基因序列全长1779 bp(图谱略),采用DNASIS分析软件与M 84754进行序列比对,与预期结果相符。载体构建
镜面果胶2.4 重组腺病毒的扩增、纯化及病毒颗粒数、滴度测定 经反复感染、扩增及纯化,获得高滴度的复制缺陷性重组腺病毒pA d-NS5B。经紫外分光光度计测定A260值,病毒颗粒数为2.07×1011vp/mL;经半数细胞培养物感染量TC ID50测定病毒滴度,pAd-NS5B的滴度为2.3×1010IU/mL。
活载体疫苗是近年来的研究热点之一。由于外源基因已经作为载体病毒自身结构的一部分,其所产生的免疫应答水平通常不低于完整病毒相应成分所引起的免疫强度。而腺病毒载体在哺乳动物多种细胞上均能高效地进行基因转移和蛋白表达,宿主范围较广,不仅能感染分裂期的细胞,也能感染静止期的细胞;且外源基因不整合到宿主染体中,不会引起基因突变及容易制备高滴度的腺病毒等优点使其在基因疫苗及基因的研究中广受青睐[6-8]。近期一些研究[9,10]也表明,腺病毒表达载体是一种很好的HCV抗原表达载体,用其免疫小鼠后可以产生有效的针对HCV的细胞免疫和体液免疫[8,9]。因此,在构建表达HCV NS5B基因表达载体时选用了腺病毒作为载体。研究使用的A d-M ax kitD包装系统通过在穿梭质粒和病毒骨架DNA的质粒中各引入一个loxP位点,将它们共转染至表达Cre酶的293细胞,在Cre的催化作用下进行重组,可以使重组腺病毒产生的效率比原来的同源重组方法提高30～100倍,而且只要插入的外源基因≤8 kb,那么几乎100%的重组腺病毒都表达有目的基因[11]。
HCV属黄病毒科的正链单股有包膜的RNA病毒,基因组全长约为9600个核苷酸,内含一个开放读码框架,编码约3000个氨基酸的单一多聚蛋白前体,经宿主信号肽酶和病毒蛋白酶裂解为结构蛋白(C、E1、E2和P7)和非结构蛋白(NS2、NS3、NS4和NS5)[12]。NS5区可被NS3丝氨酸蛋白酶进一步裂解为NS5A和NS5B两个区,其中NS5B蛋白是RNA依赖的RNA聚合酶,随着NS5B蛋白性质和晶体结构的阐明,NS5B已成为抗HCV感染研究的理想靶位[13]。由于NS5B属于非结构区,在HCV基因组中较为保守,且存在多个T细胞及B细胞的识别位点[14],因而成为研制基因免疫及基因疫苗的候选区段之一。
实验利用腺病毒AdM ax包装系统,通过细胞内同源重组成功构建了表达HCV NS5B基因的重组腺病毒表达载体pA d-NS5B。经293细胞包装、扩增得到滴度2.3×1010IU/mL的重组腺病毒,完全满足体外基因转染的需要,为进一步探索HCV基因免疫和基因奠定了基础。
[1] Chen SL,M organ TR.The natu ral history of hepatitis C virus (HCV)infection[J].Int JM ed Sci,2006,3(2):47-52.
[2] Levine CD,Ghalib RH.A ssessm entof the patientw ho failed treatm ent for chronic hepatitis C[J].Gastroentero l Nurs,2005,28(3 Supp l):S24-S30.
[3] HoughtonM,AbrignaniS.Prospects fora vaccine against the hepatitisC virus[J].Nature,2005,436(7053):961-966.
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