第25卷第6期2004年12月西安交通大学学报（医学版）Journal of Xi'an Jiaotong University （Medical Sciences ）7ol8259o86
:ec82004
吕勇刚1，窦科峰1，吴昱彤2，赵爱志1，刘 杰4，陈 刚5，陶开山1，药立波3
（1.第四军医大学西京医院肝胆外科，陕西西安 710033；2.唐都医院信息科，陕西西安 710038；
3.基础部生物化学教研室；
4.基础部药理学教研室，陕西西安 710032；
5.西安交通大学第一医院血液科，陕西西安 710061）
摘要：目的 扩增人乳腺癌抗体全套可变区基因，将其克隆到T 载体来构建T 载体文库。方法 收集乳腺癌患者外周转移淋巴结30例，
TRIzol 法提取总RNA 、纯化mRNA ，行RT-PCR 扩增，制备T 载体，用于PCR 产物的克隆。结果 总R
NA 纯度高，完整性好，mRNA 获得率为1%。经RT-PCR ，V H 、V λ、V k 的每一条5ˊ端引物均与其相应的3ˊ端引物成功地扩增出了可变区基因片段，轻、重链T 载体库分别为1.7×108和3.5×108。结论 所采用的引物能够100%扩增目的片段，T 载体过渡能显著提高克隆效率，为噬菌体抗体库的构建和筛选奠定了基础。关键词：聚合酶链式反应；乳腺癌；抗体基因；T 载体 中图分类号：R737.9 文献标识码：A 文章编号：1671-8259（2004）06-0558-04
Amplification of all human V genes of breast carcinoma
from peripheral lymphadens
LüYonggang ，Dou Kefeng ，Wu Yutong ，Zhao Aizhi ，Liu Jie ，Chen Gang ，Tao Kaishan ，Yao Libo
（Department of Hepatobiliary Surgery ，Xijing Hospital ，Fourth Military Medical University ，Xi’an 710033，China ）
ABSTRACT ：Objective ;o a<=lify all >u<an 7genes of ?reast carcino<a ?y @;ABC@8;>e =roducts of BC@Dere
cloned into ;Avector to construct clone li?rary8Methods Beri=>eral ly<=>adens of 30=atients Dit>?reast carcino<a Dere collected ，fro<D>ic>total @9E Das eFtracted ?y ;@GHol @eagent ，and <@9E Das =urified Dit>IligoteF <@9E Jit8;>en c:9E Das derived t>roug>reverse transcri=tion8BC@=roducts Dere a<=lified and cloned into ;Avector to construct clone li?raries8ResuIts ;otal @9E Das eFtracted =urely and intactly ，so Das <@9E D>ic>accounts for 1K of t>e for<er8Ly @;ABC@，every =air of =ri<ers a<=lified t>e 7gene efficiently8@e=ertoires of 7M and 7N Dere 385×108and 187×108res=ectively8ConcIusion ;>e set of =ri<ers ado=ted are a?le to recogniHe 100K of functional 7genes Dit>>ig>efficiency8;Avector Dill facilitate t>e digestion ，D>ic>lays a foundation for construction and selection of =>age li?rary8
KEY WORDS ：=oly<erase c>ain reaction ；?reast carcino<a ；anti?ody gene ；;Avector 收稿日期：2004-04-14 修回日期：2004-05-11基金项目：国家自然科学基金资助（No.30371399）通讯作者：药立波，Tel ：83374547-11；E-mail ：bioyao@fmmu.edu 作者简介：吕勇刚（1974-），男（汉族），医师，在读博士.
噬菌体抗体库技术是90年代抗体工程领域的重大进展，能够绕开免疫途径，直接制备全人源化的抗体片段。它将选择能力和扩增能力偶联起来，较好地模拟了体内B 细胞产生特异性抗体的过程。传统的单克隆杂交瘤技术与之相比，已经显得“迟缓和笨
拙”，有被逐渐取代的趋势［1］
。PCR 技术的发展，使得人们可以用一组引物扩增全套抗体的可变区基因，
是抗体库技术出现的先决条件之一［2］
。我们采用一组高效引物，以乳腺癌患者的外周淋巴结为原料，扩增抗体的全套可变区基因，并将其首先克隆入T 载
体，构建各自的T 载体文库，有助于提高PCR 产物的酶切和高效克隆，为抗体库的构建打下基础，并在方法学上进行了探讨。1 材料与方法
1.1 酶和化学试剂 TRIzol 提取液购自Invitrogen 公司；DEPC 为Sigma 产品；r Taq DNA 聚合酶、dNTP 购自大连宝生物制品公司；mRNA 纯化试剂盒为QIAGEN 产品；反转录试剂盒为Promega 产品；DNA 凝胶纯化试剂盒、大提质粒试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。
1.2 组织总RNA 的提取 术中剥离乳腺癌患者外周淋巴结30例（标本均经病理证实），迅速冻于液
6期吕勇刚，窦科峰，吴昱彤，等.人乳腺癌全套抗体可变区基因的扩增与克隆
氮，置研磨器研成粉末，移入匀浆器加入TRIzol研至透亮，按照说明书（Invitrogen）操作得到总RNA，紫外分光光度仪定量并检测其完整性，质量较差者弃用，重新提取，最后30例所得总RNA各取等量混合，-80℃冻存备用。
单兵作战系统1.3 mRNA纯化按照试剂盒（Qiagen）进行，部分改良。按说明加入OEB（第8步）后，仔细吹打完毕，70℃保温5min，迅速于26℃、16000×g离心2min，取小份定量，测定A260nm/A280nm值。
1.4 反转录按照试剂盒说明书进行（Promega），部分改良。取mRNA约0.5µg，70℃保温20min打开二级结构，迅速置冰上。按说明书依次加入各成分，置室温20min，42℃3min后再加入抑制剂和AMV反转录酶，总体系20µL。42℃90min，95℃5min。
1.5 引物设计与合成引物设计参见文献［3］，适当改动和取舍，由赛百盛公司合成，PAGE纯化。我们在所有引物的5ˊ端延长一段保护序列：①VH Back prim-ers：TTA TCA TCG AGC CCG CTC GAG—；②VH For-ward primers：GAT TGG TTT GCC CTA GCT AGC—；
③Vλand V k Back primers：AGC AAG CGG CGC TTG GCG CGC—；④Vλand V k Forward primers：GTT ATG GTC GAA CGC GTC GAC—。下划线依次引入XhoⅠ、NheⅠ、Bss HⅡ、SalⅠ酶切位点，第二轮PCR的引物同保护序列。
1.6 PCR反应共进行两轮。第一轮以0.5～1µL 反转录产物cDNA作为模板，3'端引物等摩尔混合，分别与5'端各引物反应。反应条件为：94℃5min热启动，94℃1min变性，55℃1min退火，72℃1min 延伸，共30循环。最后进一步延伸7min，反应体系为25µL，将得到的PCR产物按比例混合（VH混合，VL和VK以1:2混合），胶回收纯化后100倍稀释，作为第二轮PCR的模板。反应体系同上。最后每管加入0.3µL dATP继续延伸30min，目的是下一步连入T载体。经胶回收纯化后得到可变区抗体基因。1.7 T载体的制备T载体的前身是pSP73，我们实验组赵爱志博士去除相应的酶切位点后命名为pSP73-T，转入大肠杆菌TG1，用于制备T载体。挑取TG1菌落转接于500mL培养液，摇过夜后大提质粒，平端酶Eco R V使pSP73-T线性化，酚/氯仿、氯仿抽提纯化后在r-Taq酶，dTTP作用下于72℃加温2h，琼脂糖电泳纯化后定量备用。
1.8 轻、重链T载体库的构建VH、VL经胶回收定量后各取1.5µg和2µgT载体连接，体系20µL。16 h后70℃30min灭活T4DNA连接酶。取1µL连接产物与50～100µL感受态细胞进行规模电转化（TG1感受态的制备见文献［4］，电转参数：0.1mm～1.8kV；0.2mm～
2.5kV；电阻、电容均分别为200Ω；25µV），每次电转后用1mL37℃预热的SOC洗出并快摇1h复苏，取小份倍比稀释，铺抗生素琼脂板计算菌量，随机挑克隆双酶切验证阳性率。其余铺氨苄琼脂板，过夜后收获细菌提质粒，即为VH、VL 的T载体库。
2 结果
2.1 总RNA及mRNA的提取和纯化总RNA经1 g・L-1甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，90V4h，0.1 mol・L-1NH
4
AC浸泡凝胶20min后，在含有0.4
mg・L-1EB的0.1mol・L-1NH
4
AC中染30min，紫外透射读胶仪上观察RNA电泳条带并照像。28S带的亮度为18S带的两倍，说明总RNA完整性好，未被降解（图1）。总RNA的量为1mg，mRNA的量为10µg，获得率为：10µg/1000µg=1%，A260nm/A280nm =2.0。表明mRNA纯度高，
没有污染。
醚链图1 淋巴结总RNA甲醛变性琼脂糖凝胶电泳
Fig.1Total RNA from human lymphadens analyzed by formalde-hyde denaturing agarose electrophoresis
2.2 cDNA的同位素示踪反转录后取少量行碱性琼脂糖凝胶电泳，经放射自显影，结果表明，cDNA合成为连续拖影，片段大小相似，分布范围较宽，从0.3kb到9.4kb，主要集中在2kb左右，结果证实了模板mRNA的完整性（图2）。
2.3 抗体可变区基因的扩增反转录共进行了120管，完毕后所有产物混合，各取一半分别扩增VH和VL。两轮PCR共进行约500管。中间随机抽样电泳，监测产物扩增情况。经过RT-PCR，每一对引物都扩增出了相应的可变区片段（图3），VH、VL分别为375bp和360bp，与文献报道一致［3］。
2.4 T载体库的构建复苏后取小份倍比稀释，铺琼脂糖氨苄板计数，VH、VL菌量分别为5×108和2. 8×108，随机挑克隆双酶切，VH、VL阳性率分别为70%和60%，故VH、VL T载体库库容分别为
3.5×108和1.7×108。
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西安交通大学学报（医学版）第
25卷
图2 cDNA 碱性琼脂糖电泳后放射自显影
Fig.2Autoradiogram of first strand cDNA after electrophoresis
3 讨 论
3.1 是否要纯化mRNA 有些人认为直接以总RNA 为模板进行RT-PCR 即可，可以省略mRNA 的纯化这一步骤，而且tRNA 和rRNA 的存在对mRNA 有保护作用。我们的体会是如果总RNA 量比较少，可以直接反转录，但是在原材料来源充足，欲构建大容量抗体库的情况下，最好纯化mRNA 。因为，以mRNA 为模板将更加灵敏和高效，至于会失去保护的问题，可用即时纯化、即时反转录的办法来解决。另外即便有tRNA 和rRNA 的保护，
也需要彻底灭活RNAse ，如：金属器械180℃干烤8h 以上，塑料用品保证初次开封使用或DEPC 浸泡24h 以上，操作中戴好干净的帽子、口罩，并及时更换手套等等。这对于
保证RNA
（mRNA ）的纯度和完整性都是非常重要的，也是后续
PCR 操作成败的关键。
图3 V 区基因的PCR 扩增
Fig.3PCR amplification of V gene Lane 1～7：VH ；Lane 9～17：VL ；Lane 19～22：VK ；Lane 8：DL2000Marker
3.2 反转录引物的采用 AMV 反转录酶具有RNAse 活性，在反转录时它一方面以RNA 为模板合成cDNA ，另一方面它会切掉DNA /RNA 杂交体中的RNA 。所以，当目的片段接近于基因的5'端时，用Ol-igo-dT 做引物会出现转录不到目的片段或还没有转录完就被切断RNA 模板的问题。鉴于此，我们选择了随机六聚体引物来合成位于抗体基因5'端的可变区片段。
3.3 关于引物 引物的设计是决定抗体库多样性的关键，影响着抗体库是否能够真实地反映原始抗体基因的分布情况，尤其是在天然抗体库中。1995年
Tomlinson 等［5］归纳整理出V BASE 库，1998年Brad-bury 等［3］依此为据设计引物，其设计标准是引物的
3'端至少和V 区基因有16bp 的同源性，总的简并度不超过8，最少的引物二聚体形成。结果可以100%地扩增抗体可变区基因，这一点也为我们的实验所证
实（图3）。其他如Marks ［6］、Welshof ［7］、Watkins ［8］
、De Boer 等［9］设计的引物均在V BASE 公布之前，对
V 基因的扩增效率分别为59.5%、62.8%、62.8%、37%。所以，我们采用Bradbury 设计的高效引物，这是抗体库多样性的保证之一。
引物的5'端设计长达21bp 的保护序列，目前还未见文献报道。其作用至少有3点：
一是便于进行第二轮PCR 扩增，二是引入酶切位点，三是便于下一步PCR 产物的酶切。因为，酶切位点太靠近末端，将使
酶切效率极为低下［10］。我们在实验中发现，这么长散热模组
的保护序列是不会影响引物与模板的特异性结合的。
引入酶切位点的依据，一是各酶之间的“合作性”，如：是否能用通用缓冲液，是否能用相同的酶切温度等。此外，还应该避免酶切位点出现在可变区基
因之内。Persic L 等
［11］和王琰等［12］
对V 基因段各限制性酶切位点可能出现的频率进行了总结。对比可
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知，我们采用的引物，其引入的四种限制性内切酶在相应的轻、重链V区出现的可能性均为0。避免了抗体库酶切过程中出现“异常重组子”［12］。这从另一个侧面证明我们所采用的引物是经得起检验的。
3.4 PCR产物的克隆如上所述，尽管我们在引物的5ˊ端设计长长的保护序列，但我们发现这只能在一定程度上提高酶切效率，而且要用加大酶量和延长酶切时间为代价。酶切时间过长又会出现星号活力等问题，会使PCR产物受损或降解，造成后续连接的效率低下。另外，即使酶切充分，也只是在PCR产物两边末端减少了几个碱基，很难用常规的电泳检测出来，往往连接效率低还不到原因，构建一个大约109的库，要成千上万次的重复，这对于一般的实验室是难以忍受的。T/A克隆是PCR产物克隆的常用策略，从未有人将其应用到抗体库的构建，其原理是普通r Taq酶扩增得到的PCR产物3'末端带有A，可以和T载体3'端的T连接。
抗体库的多样性取决于如下条件：首先是标本的用量。从国内外发表的大量文献看，最少有1～2［13
］例标本已经能建库并成功筛选到特异性抗体。收集的标本当然越多越好，考虑到取材的时间和难度，我们共收集淋巴结30例，这是抗体基因多样性的最初来源。外周转移的淋巴结体积较大，便于操作失败时重新提取。另外，要取用富含B细胞的皮质部分。体内抗体重链的多样性约107，所以单克隆B细胞的多样性也应该达到这个数量级，才能保证抗体基因的多样性。从我们总RNA的量推算，B细胞的数量应该在108以上；其次是高效引物的采用；再次是PCR 产物的高效克隆。它们将为大容量抗体库的构建和筛选打下基础。
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（编辑韩维栋）
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