江苏农业学报(Jiangsu J.of Agr.Sci.),2013,29(1):76~80
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杨玉霞，言燕华，韦武青，等.建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒RdRp 基因hpRNAi 表达载体的构建[J].江苏农业学报,2013,29(1):76⁃80. doi:10.3969/j.issn.1000⁃4440.2013.01.013
金属表面耐磨涂层
建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒RdRp 基因hpRNAi 表达载体的构建杨玉霞1, 言燕华2, 韦武青2, 马志虎2, 李倩中3, 李淑顺3, 张昌伟1
(1.南京农业大学园艺学院，江苏南京210095;2.镇江市蔬菜科学研究所，江苏镇江212021;3.江苏省农业科学院观光农
业研究中心，江苏南京210014)
收稿日期:2012⁃07⁃18
基金项目：国家自然基金项目(31101574)；南京农业大学青年科技
创新基金项目(KJ2011008)；镇江农业科技支撑计划项目
(NY2011015)
作者简介：杨玉霞(1987⁃)，女，河北石家庄人，硕士研究生，主要从事
观赏植物分子生物学研究㊂(Tel)025⁃84396943;(E⁃mail)
151****4311@163 通讯作者：张昌伟,(Tel)025⁃84396943;(E⁃mail)changweizh@njau.
edu
摘要: 为了构建建兰花叶病毒(CymMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)复制酶RdRp 基因hpRNAi 的表达载体，根据GenBank 中CymMV 和ORSV RdRp 基因的保守序列设计引物，以蝴蝶兰温室生产中两种病毒的分离物为模板,
成功扩增了两种病毒的RdRp 基因片段㊂扩增的这两种病毒的RdRp 基因与数据库中病毒序列同源性均在98%以上㊂利用融合PCR 将两种病毒片段串联在一起，然后通过Gateway 技术的BP 反应和LR 反应将融合产物插入到基
因沉默表达载体pHellsgate12中，成功构建了可同时抗建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的发夹结构RNA 干扰载体，为兰花多抗基因工程育种奠定了基础㊂
关键词: 建兰花叶病毒；齿兰环斑病毒；抗病毒病;RNA 干扰
中图分类号: S682.31 文献标识码:
A 文章编号: 1000⁃4440(2013)01⁃0076⁃05
Construction of hpRNAi expression vector of Cymbidium mosaic virus and Odontoglossum ringspot virus RdRp gene
YANG Yu⁃xia 1, YAN Yan⁃hua 2, WU Wei⁃qing 2, MA Zhi⁃hu 2, LI Qian⁃zhong 3, LI Shu⁃shun 3,ZHANG Chang⁃wei 1
(1.College of Horticulture ,Nanjing Agricultural University ,Nanjing 210095,China ;2.Zhenjiang Institute of Vegetable Science ,Zhenjiang 210042,Chi⁃na ;3.Research Center of Sightseeing Agriculture ,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences ,Nanjing 210014,China )
Abstract :
In order to construct the hpRNAi expression vector of RNA⁃dependent RNA polymerase genes (RdRp )of
Cymbidium mosaic virus and Odontoglossum ringspot virus,the primers of conserved sequences in the RdRp genes of the two viruses were designed and synthesized.With the two viruses separated from Phalaenopsis in greenhouse as templates,the RdRp genes of the two viruses were amplified successfully and had the homology to other RdRp genes in public database of a⁃bove 98%.The RdRp genes of the two viruses were jointed by fusion PCR.The fusion products were inserted into gene silen⁃cing expression vector pHellsgate12by a BP recombination reaction and an LR recombination reaction in Gateway technology.
The hairpin structure RNA interference carrier resistant to both Cymbidium mosaic virus and Odontoglossum ringspot virus was constructed successfully,which provides a foun⁃dation for genetic engineering breeding in orchids.Key words : Cymbidium mosaic virus;Odontoglos⁃
sum ringspot virus;viral disease resistance;RNA inter⁃
ference
目前，世界上已报道的兰花病毒有：建兰花叶病
6
7. All Rights Reserved.
毒㊁齿兰环斑病毒㊁建兰轻性花叶病毒㊁建兰环斑病
毒㊁番茄环斑病毒㊁万代兰花叶病毒㊁石斛兰花叶病
毒㊁洋兰斑点病毒和黄瓜花叶病毒等10多种病毒，其
中以建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)
和齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)
发生最为普遍㊂CymMV是迄今为止从兰花上分离到
的约25种病毒中分布最广㊁危害最严重的病毒之一,
传播途径主要有汁液㊁桃蚜和接触㊂CymMV和ORSV
是侵染蝴蝶兰的两种主要病毒㊂这2种病毒能侵染
兰科及其他科共20多种植物[1]，能使兰花叶片形成不规则的褪绿条纹㊁圆斑㊁环斑甚至坏死，在花瓣上表
现放射状褪条纹，并且时常复合感染，危害加剧，使
兰花观赏价值和经济价值大为下降[2⁃5]㊂
目前生产上还不能通过化学药剂防治兰花病毒
病，过去主要通过茎尖培养脱除病毒，但存在脱毒率
载体构建低㊁费时费力㊁生产中管理不善㊁病毒易重新感染等
缺点㊂随着植物基因工程的发展，在兰科植物中利
用病毒外壳蛋白质CP介导的抗病毒研究也有报
道㊂2004年，台湾Liao等[6]和Chan等[7]将CymMV 病毒的CP基因转入蝴蝶兰中，得到了具有抗病性的蝴蝶兰植株，但由于不同地区兰花病毒株存在差异，转基因植株大范围推广时抗病能力会减弱甚至抗性丧失，同时病毒基因会在植株中表达，引起了公众对转基因安全的忧虑，限制了其在生产上的应
用㊂RNA干扰(RNA interference,RNAi)是最近几年发展起来的一门新兴的转录水平上的基因阻断技术㊂将病毒的某一序列设计成双链结构导进植物体使之表达，可诱发RNA沉默，强化植物体内自然的RNA沉默抗病毒能力，这使得高抗病毒性的转基因植物的获得成为可能㊂研究证明，利用hpRNA沉默策略不仅可以获得具有较高抗性的转基因植株，而且由于不表达病毒蛋白质，能减少人们对携带病毒基因的转基因作物安全性的顾虑，使种质创新目的性更强也更加安全有效；在高保守区段设计靶序列，并且只需20bp的同源序列就能引起病毒沉默，能避免病毒因非保守区的高突变率而产生的耐抗性突变株；同时还可将多个基因序列串联起来而获得对多个病毒的广谱抗性[8]㊂
本试验根据GenBank中CymMV和ORSV复制
酶基因RdRp的保守序列设计引物，利用融合PCR
技术和Gateway技术快速构建可同时抗CymMV和ORSV的RNA干扰载体，为通过基因工程技术培育有多种病毒抗性的兰花新品种奠定基础㊂
非接触式扭矩传感器
1 材料和方法
1.1 材料和试剂
1.1.1 植物材料 材料取自镇江市蔬菜研究所蝴蝶兰生产温室，由带病毒蝴蝶兰样品获得建兰花叶病
毒和齿兰环斑病毒分离物，经RT⁃PCR检测，保存于本氏烟(Nicotiana benthamiana)中㊂
1.1.2 载体和试剂 入门载体pDONR TM221㊁BP clonase TMⅡ和LR clonase TMⅡ购自美国Invitrogen 公司，表达载体pHellsgate12(GenBankCS591107)由澳大利亚联邦科学与工业研究组织植物工业部(CSIRO Plant Industry)提供，质粒提取试剂盒㊁凝胶回收试剂盒和PCR反应试剂购于Takara生物工程有限公司(大连)，大肠杆菌DH5α菌株由本实验室保存㊂
1.2 方法
1.2.1 引物设计、扩增及融合PCR 分别根据NC⁃BI数据库中CymMV和ORSV病毒复制酶RdRp基因设计引物(表1)，扩增长度分别为287bp和387 bp㊂CymMV的上游引物CYRPGWF和ORSV的下游引物ORRPGWR侧翼含有Gateway attb位点, CymMV的下游引物CYRP⁃R和ORSV的上游引物ORRP⁃F含有21bp的重叠区域，以便利用Gateway 系统插入载体和融合PCR连接两个病毒片段㊂利用上述两对引物，分别以含有CymMV和ORSV的cDNA为模板，进行PCR扩增反应㊂扩增采用50.0μl体系：模板2.5μl，引物各2.5μl(10μmol/L),dNTP Mixture4.0μl(各2.5mmol/L), 10×PCR buffer(Mg2+plus)5.0μl,Taq E0.5μl, 33.0μl灭菌超纯水补齐㊂扩增程序为:94℃预变性5min;94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min35个循环;72℃延伸10min㊂PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶进行电泳检测，用回收纯化试剂盒进行纯化去除引物及引物二聚体，回收目标条带㊂利用融合PCR技术连接两个RdRp序列，利用引物CYRP
GWF和ORRPGWR，以回收后的产物为模板，进行PCR融合㊂融合采用50.0μl体系：模板各2.5μl，引物各2.5μl(10μmol/L),dNTP mixture 4.0μl(各2.5mmol/L),10×PCR buffber(Mg2+ plus)5.0μl,Taq E0.5μl,30.5μl灭菌超纯水补齐㊂融合条件同以上PCR扩增程序㊂
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杨玉霞等：建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒RdRp基因hpRNAi表达载体的构建. All Rights Reserved.
表1 PCR 扩增所用引物
Table 1 Primers for PCR amplification
引物
序列
CYRPGWF 5′⁃GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGCAGCTACTGTGGTATGCCC⁃3′CYRP⁃R 5′⁃CCACAACCAGGAACGCCATCT TTGCCTTGGCGTTCGGAAT⁃3′ORRP⁃F
5′⁃ATTCCGAACGCCAAGGCAAAGA TGGCGTTCCTGGTTGTGG ⁃3′
ORRPGWR 5′⁃GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCACCATCGCCTCACGACAATG⁃3′
下划线部分为Gateway attb 位点，方框中为21bp 的重叠区域㊂
1.2.2 attB ⁃PCR 产物的纯化 将以上attB ⁃PCR 产物用1.2%琼脂糖凝胶进行电泳检测，用回收纯化试剂盒进行纯化，去除引物及引物二聚体，回收目标条带㊂1.2.3 利用BP 重组反应创建入门克隆 根据试剂使用说明，用attB⁃PCR 回收产物与入门载体pDONR TM 221进行重组反应㊂首先用克隆酶BPclo⁃nase TM Ⅱ进行催化，反应物在25℃下反应18h；然后，加入1μl 蛋白酶K (2μg /μl)溶液，在37℃中温育10min㊂将5μl 反应产物用热激法[9]转化到DH5α感受态细胞㊂在含有50mg /L 卡那霉素(Ka⁃namycin)的LB 培养基上筛选入门克隆，利用引物CYRPGWF 和ORRPGWR 进行PCR 检测和测序㊂1.2.4 利用LR 重组反应创建表达克隆
利用LR
克隆酶LR Clonase TM
间的重组反应㊂将入门克隆㊁表达载体pHellsgate12
和LR Clonase TM Ⅱ酶混合物按试剂盒使用说明进行操作㊂将重组后的质粒用热激法转化到大肠杆菌DH5α高效感受态细胞，经壮观霉素(Spectinomy⁃cin)抗性筛选，阳性克隆利用引物CYRPGWF 和ORRPGWR 进行PCR 检测，得到基因沉默载体pH12⁃RdRp(图1)㊂
1.2.5 转化农杆菌 参照文献[10]的电击转化法，将pH12⁃RdRp 电击法转化农杆菌GV3101㊂转化液均匀涂布在含100mg /L 壮观霉素和60mg /L 庆大霉素的固体LB 培养基上,28℃培养2d㊂挑取单克隆于相同浓度壮观霉素和庆大霉素的液体LB 培养基内28℃震荡培养2d㊂以特异引物PCR 检测，获得含有质粒的农杆菌㊂
Polk intron：黄顶菊Pdk 基因内含子;CYMV⁃ORSV：建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒RdRp 基因正向序列;ORSV⁃CYMV：建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒RdRp 基因反向序列;attB1:Gateway attB1重组位点;attB2:Gateway attB2重组位点㊂
图1 表达载体启动子和终止子间结构图
中子嬗变
Fig.1 Sketch map of expression vector from promoter to terminator
2 结果
2.1 建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒RdRp 基因的克隆和PCR 融合
以含有建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的cDNA 为模板，利用建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒RdRp 基因的特异引物分别进行PCR 扩增反应，经琼脂糖凝胶电泳检测分别获得287bp 和387bp 的目的条带(图2A)㊂测序结果表明两种病毒RdRp 基因与GenBank 中序列的同源性均在98%以上，表明扩增片段特异性和保守性较高㊂上述建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒RdRp 基因片段经纯化后，等比例混合
作为融合PCR 模板，加入引物CYRPGWF 和CYR⁃PGWR 进行融合PCR 扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测
获得约674bp 的目的条带(图2B)㊂2.2 入门克隆的检测
融合产物通过BP 重组反应，连接到入门载体
pDONR TM 221中，经含卡那霉素的LB 培养基进行重组菌斑筛选，得到入门克隆阳性菌落㊂以入门克隆的质粒DNA 为模板，利用CYRPGWF 和ORRPGWR 引物经PCR 检测后，得到674bp 的单一电泳条带，证明融合后的病毒复制酶基因片段已经重组到pDONR
TM
221载体(图3A)，测序结果表明序列插
入正确㊂
8
7江苏农业学报 2013年第29卷第1期
. All Rights Reserved.
M:DNA marker;1~3：建兰花叶病毒RdRp基因PCR扩增;4~6：齿兰环斑病毒RdRp基因PCR扩增;7~8：建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒RdRp基因融合片段㊂
图2 建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒RdRp基因PCR扩增(A)和融合PCR(B)
Fig.2 PCR amplification of CyMV and ORSV RdRp gene(A)and fusion PCR(B)
2.3 表达载体的构建
将入门克隆的质粒与表达载体pHellsgate12进行LR重组反应后，在附加卡那霉素和壮观霉素的
LB培养基上筛选获得阳性克隆㊂以表达载体的质粒DNA为模板，以CYRPGWF和ORRPGWR为引物进行PCR扩增同样检测到674bp的单一电泳条带(图3B)，表明建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒RdRp 融合基因片段已重组到目标载体pHallsgate12中，代替了ccdB的位置，形成反向重复结构㊂说明成功构建了同时含有建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒RdRp片段的基因沉默载体pH12⁃RdRp㊂
2.4 农杆菌检测
将构建好的基因沉默载体pH12⁃RdRp通过电击法导入农杆菌GV3101中，用庆大霉素和壮观霉素进行筛选，获得抗性菌株㊂以农杆菌抗性菌株菌液为模板，以CYRPGWF和ORRPGWR为引物进行PCR扩
增，结果与上述大肠杆菌中提取的质粒PCR 扩增结果一致，都检测到674bp的RdRp基因片段(图3C)，表明目标干扰载体己成功转入农杆菌GV3101中，可直接用于后续的转基因工作㊂
M:DNA marker;1：插入RdRp基因后的pDONR TM221载体;2:pDONR TM221空载体;3:pHallsgate12空载体;4：插入RdRp基因后的pHalls⁃gate12载体;5~8：插入pH12⁃RdRp质粒的农杆菌GV3101;9：农杆菌GV3101对照㊂
图3 BP反应(A)㊁LR反应(B)和农杆菌检测(C)
Fig.3 BP recombination reaction(A),LR recombination reaction(B)and agrobacterium⁃mediated detection(C)
3 讨论
建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒病是两种重要的兰花病毒，并且一般复合侵染可通过汁液传播㊂目前国内外尚无有效防治植物病毒病的药剂，而随着世界范围内兰花贸易的不断扩大，势必会增加其蔓
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杨玉霞等：建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒RdRp基因hpRNAi表达载体的构建. All Rights Reserved.
延程度，对兰花市场和兰花种植带来更大的危害,
因此迫切需要利用抗病毒基因工程来培育抗病毒兰
花新品种㊂RNA干扰技术为植物抗病毒基因工程
研究提供了新途径㊂目前RNAi技术已经在抗大麦
黄矮病毒㊁烟草蚀刻病毒㊁首蓓花叶病毒㊁辣椒轻斑
车辆检测系统驳病毒㊁黄瓜花叶病毒等方面取得了成功[11⁃12]㊂本试验利用建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒复制酶基因
的保守序列构建RNAi载体，具有特异好㊁抗性高等
优点，并且病毒基因片段不会在植物体内表达蛋白
质，生物安全性较高；本试验中还运用了融合PCR
技术[13]，采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR产物，通过PCR产物重叠链的延伸，从而将两个病毒RdRp基因片段串联起来，此技术在不需要内切酶消化和连接酶处理的条件下实现DNA
片段的体外连接，为构建含多个病毒基因的嵌合基因干扰载体创造了条件㊂
传统的RNAi载体构建采用多次酶切连接的方法，操作繁琐，费时费力;Gateway TM技术是由In⁃vitrogen公司开发的基于λ噬菌体位点特异性重组原理来进行RNAi表达载体构建的一项新技术，该系统提供的目标载体在重组位点间加入了ccdB毒性基因，产生的蛋白质可阻碍大肠杆菌DNA促旋酶的重新聚合，因此未发生重组的载体则不能在大肠杆菌中繁殖，大大降低了假阳性比率[14]㊂而且，该系统采用位点特异性重组技术，不需要考虑酶切位点，大大提高了载体通用性，一旦获得入门克隆，就可以按正确的方向快速准确地将目的基因转化到目的载体中㊂
pHellsgate12是目前应用比较广泛的基于Gate⁃way系统的hpRNAi载体，在多种作物中具有较高的沉默效率，为约17600bp的超螺旋结构，质粒较大，重组效率比较低，并且含有2个方向相反的内含子，当外源基因片段发生重组反应形成反向重复结构时，不受内含子与启动子方向的影响，易于得到有效的hpRNAi[15]㊂本试验利用融合PCR获得的Cym⁃MV和ORSV的RdRp基因的串联片段，通过BP重组和LR重组反应，正反向插入到pHellsgate12载体，获得了含CymMV和ORSV的RdRp基因的发夹结构的基因沉默载体，为获得安全性好㊁广谱及高抗病毒病的兰花转基因新种质奠定了基础㊂参考文献:
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(责任编辑：张震林)
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