污染调查与风险分析
陈荣桥，陈汉金，胡均鹏，冼燕萍，杨静，王斌，朱文信，刘冬虹，侯向昶，刘春生，吴玉銮，周颖璇 （广州质量监督检测研究院，广州市食品安全风险动态监测与预警研究中心，广州市食品安全检测技术重点实验
室，广东广州 511447）
摘要：通过调查我国南方部分省份食品工业中常用的米和食用淀粉中唐菖蒲伯克霍尔德菌污染情况，首次在进口碎米中分离鉴
定出椰毒假单胞菌酵米面亚种，预警潜在风险。本研究在曾发生过米酵菌酸中毒事件的南方省份采集了129份样品，其中大米47份、碎米18份和食用淀粉64份，分别按照GB/T 4789.29-2003和GB 5009.189-2016检测唐菖蒲伯克霍尔德菌和米酵菌酸。研究结果表明，在4份进口碎米和1份国产碎米中分离鉴定出6株唐菖蒲伯克霍尔德菌，在碎米样品中的检出率为27.78%（5/18）；经过产毒培养和毒性测试，其中4株菌株产毒素米酵菌酸，小白鼠经口灌胃毒素粗提取液后在24 h内全部死亡，确证为椰毒假单胞菌酵米面亚种，均源自4份进口碎米，占进口碎米样品的23.53%（4/17），这4份进口碎米中有2份检出米酵菌酸。说明进口碎米存在安全风险，相关企业和监管部门应加强风险防控。 关键词：椰毒假单胞菌酵米面亚种；米酵菌酸；米和食用淀粉；调查分析
文章篇号：1673-9078(2021)01-260-267 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2021.1.0685 Investigation and Risk Analysis of Pseudomonas cocovenenans subsp.
farinofermentans from Rice and Edible Starch
CHEN Rong-qiao, CHEN Han-Jin, HU Jun-peng, XIAN Y an-ping, YANG Jing, W ANG Bin, ZHU Wen-xin, LIU Dong-hong, HOU Xiang-chang, LIU Chun-sheng, WU Yu-luan, ZHOU Ying-xuan (Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute, Guangzhou City Research Center of Risk Dynamic Detection and Early Warning for Food Safety, Guangzhou City Key Laboratory of Detection Technology for Food Safety , Guangzhou
511447, China)
Abstract: By investigating the contamination of Burkholderia gladioli in rice and edible starch which commonly used in the food industry
in some provinces of southern China, it is the first time that Pseudomonas cocovenenans subsp. farinofermentans was isolated and identified
from imported broken rice, which provided early warning of potential risk. In this study, 129 samples including 47 rice, 18 broken rice, 64 edible
starch were collected from southern provinces where “bongkrekic acid poisoning incident” had occurred. Burkholderia gladioli and bongkrekic
acid were detected according to GB/T 4789.29-2003 and GB 5009.189-2016, respectively. The results showed that 6 strains of Burkholderia
gladioli were isolated and identified from 4 imported broken rice and 1 domestic broken rice, and the detection rate in broken rice samples was
27.78% (5/18); through toxin-producing cultivation and toxicity test, 4 strains produced bongkrekic acid. The mice all died within 24 hours after
oral gavage of crude toxin extract. It was confirmed that the toxin was Pseudomonas cocovenenans subsp. farinofermentans, and all derived
from 4 imported broken rice samples (two of them were detected with bongkrekic acid), accounting for 23.53% (4/17) of imported broken rice
引文格式：
陈荣桥，陈汉金，胡均鹏，等.米和食用淀粉中椰毒假单胞菌酵米面亚种污染调查与风险分析[J].现代食品科技,2021,37(1): 260-267
CHEN Rong-qiao, CHEN Han-Jin, HU Jun-peng, et al. Investigation and risk analysis of Pseudomonas cocovenenans subsp.隧道施工风机
farinofermentans from rice and edible starch [J]. Modern Food Science and Technology, 2021, 37(1): 260-267
收稿日期：2020-7-21
基金项目：广东省科技计划项目（2019B020208008）
作者简介：陈荣桥（1992-），男，硕士，研究方向：食品安全分析
通讯作者：冼燕萍（1975-），女，硕士，教授级高级工程师，研究方向：食品安全分析
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samples. It shows that there are safety risks in imported broken rice, and the relevant enterprises and regulatory authorities should strengthen the risk prevention and control.
Key words:Pseudomonas cocovenenans subsp. farinofermentans; bongkrekic acid; rice and starch; investigation and analysis
椰毒假单胞菌酵米面亚种（Pseudomonas cocovenenans subsp. farinofermentans，又称椰毒伯克霍尔德菌[1]）是唐菖蒲伯克霍尔德菌（Burkholderia gladioli）的一种病原型，容易污染谷类发酵制品（酵米面、玉米淀粉、醋凉粉等）、银耳、木耳及薯类制品（马铃薯粉条、甘薯淀粉、山芋淀粉等）[2]。椰毒假单胞菌酵米面亚种广泛存在于环境土壤中，生长繁殖温度为30~36 ℃，最佳产毒温度为26~28 ℃。米酵菌酸是椰毒假单胞菌酵米面亚种产生的主要外毒素，对人和动物有强烈的毒性作用，美国《食品毒理学》研究表明人体血液中米酵菌酸含量达到200~300 μg/L 即可达到致死剂量，人中毒事件反映经口摄入含31 mg米酵菌酸的食物可致死亡，米酵菌酸中毒死亡率高达40%~100%，且米酵菌酸耐热，一般烹调方法不能破坏其毒性[3,4]。
米酵菌酸中毒机理是抑制线粒体腺嘌呤核苷酸转位酶（ANT）而产生毒性作用[5,6]。发病潜伏期一般为30 min~12 h，少数长达1~2 d，中毒早期多为胃肠道刺激，表现为恶心、呕吐、腹泻等，病情进展迅速，严重发展为脑、肝、肾多器官功能衰竭[7,8]。由椰毒假单胞菌酵米面亚种污染食物而引发米酵
菌酸中毒事件在我国时有报道，据不完全统计，自20世纪中期以来，报道的此类事件影响人数累计超过2000人，死亡人数超过900人，中毒食物有发酵变质的玉米制品、变质银耳和长时间泡发的木耳等，涉及省份包括东北三省、四川、云南、浙江、广西和广东等[2,9-12]。其中，2018年广东省河源市和东莞市也接连发生了因食用过期湿粉条而引起家庭米酵菌酸中毒事件[4,7]。由此可见，椰毒假单胞菌酵米面亚种污染及其毒素中毒事件已经危及人们身体健康和生命安全，应当提高重视程度。
本研究率先在我国南方部分省份的一些粮食加工制品生产企业进行调研并采集了米（大米和碎米）、食用淀粉（玉米淀粉、小麦淀粉和木薯淀粉）样品，同时也在市场上随机购买了一些大米样品，开展椰毒假单胞菌酵米面亚种及其毒素米酵菌酸污染摸查和风险分析研究。首次在4份进口碎米和1份国产碎米中分离鉴定出6株唐菖蒲伯克霍尔德菌，其中4株为产毒素的椰毒假单胞菌酵米面亚种（均源自进口碎米），有1份进口碎米同时分离出1株产毒菌株和1株不产毒菌株，在2份进口碎米中同时检出米酵菌酸；国产碎米中分离出1株不产毒株。研究表明进口碎米存在椰毒假单胞菌酵米面亚种污染的安全风险。
1 材料与方法
1.1 原料
2020年4~6月，从我国南方部分省份采集米和食用淀粉样品共129份，其中47份大米、18份碎米和64
份淀粉样品（具体见表1，其中产地信息均为产品包装标识），样品采自粮食加工制品生产企业和广州本地超市或市场。采样时，为了避免二次污染，对于小包装规格的产品则整包购买，对于大包装规格的产品则从新开封的产品中取出适量样品后即装入无菌均质袋并密闭包装，每件样品至少500 g。
1.2 仪器和试剂
VITEK 2 Compact自动微生物快速检测系统，法国梅里埃公司；生物安全柜，Thermo scientific；高压灭菌锅（Hirayama HVE 50）；恒温培养箱，Binder；天平（PL6001E）；移液，transfepette；ACQUITYTM 超高效液相谱仪和Waters XevoTM TQ MS三重四极杆串联质谱仪，Waters公司。
GVC增菌液、马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基、马铃薯葡萄糖半固体琼脂培养基、卵黄琼脂培养基和SS琼脂培养基，均购自广东环凯微生物科技有限公司；VITEK 2 Compact GN鉴定卡，法国梅里埃公司；玻璃纸和旋蒸仪，郑州长城科工贸有限公司；米酵菌酸标准品（1 mg/mL），Sigma Aldrich；甲醇和乙腈（HPLC级），德国Merck公司；甲酸（HPLC级），德国CNW公司；氨水（分析纯），广州化学试剂厂；MAX固相萃取小柱（6 mg/3 mL），Waters公司；超纯水（18.2 MΩ·cm），实验室Milli-Q自制。
1.3 实验方法
按照GB/T 4789.29-2003《食品卫生微生物学检验椰毒假单胞菌酵米面亚种检验》对所有样品进行处理和分离菌株[13]，生化鉴定采用VITEK 2 Compact自动微生物快速检测系统，对经VITEK 2 Compact确认的唐菖蒲伯克霍尔德菌，进一步开展毒性试验，对产毒培养获得的毒素粗提液采用小白鼠灌胃进行毒力测定，同时测定米酵菌酸。
参考GB 5009.189-2016《食品安全国家标准食品
261
262
中米酵菌酸的测定》的前处理方法[14]，建立了检测米酵菌酸的超高效液相谱-质谱/质谱（UPLC-MS/MS ）法，仪器检出限为0.3 μg/L 。UPLC-MS/MS 检测谱条件：BEH C18谱柱（50 mm×2.1 mm ，1.7 μm ）；流动相为乙腈（A ）和0.1%甲酸水溶液（B ），梯度洗脱程序为：0.0~3.0 min ，50%~70% A ，3.0~3.6 min ，70%~95% A ，3.6~5.5 min ，95% A ，5.5~5.6 min ，95%~50% A ，5.6~7.0 min ，50% A ；流速0.3 mL/min ；柱温40 ℃；进样量5 μL 。质谱条件：电离方式为电喷雾负离子（ESI-）模式；毛细管电压2 kV ，锥孔电压10 V ；去溶剂温度500 ℃；去溶剂气为氮气，800 L/Hr ；锥孔气为氮气，50 L/Hr ；监测方式：多反应监测（MRM ），米酵菌酸和异米酵菌酸的特征离子对（m /z ）均为485.3/397.3和485.3/441.3（定量），碰撞能分别为20 eV 和10 eV 。
1.4 数据处理
近视回归镜本文数据使用Origin 9软件作图，每项数据实验三次取平均值处理。
2 结果与讨论
2.1 米和食用淀粉的污染情况
本次实验共采集129份，发现大米和碎米存在唐菖蒲伯克霍尔德菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和荧光假单胞菌污染（见表1）。其中，在4份进口碎米样品中检出5株唐菖蒲伯克霍尔德菌（4株为产毒菌株和1株不产毒菌株），即在1份进口碎米样品中同时检出1株产毒菌株和1株不产毒菌株；1份国产碎米中检出1株不产毒菌株。
表1 米和食用淀粉样品中细菌污染情况 Table 1 Contamination of various samples of Bacteria
样品类别 产品标识 产地 样品数量
细菌种类
唐菖蒲伯克霍尔德菌
薯类淀粉机类鼻疽伯克霍尔德菌
荧光假单胞菌 未鉴定出细菌类别
大米 国产 47 0
1
1 3
碎米 国产 1 1a 0 0
0 进口 17 5b 1 0 0 小麦淀粉 国产 34 0 0 0
1 玉米淀粉 国产 20 0 0 0 1 木薯淀粉
国产
10 0
0 0
注：a ，不产毒株；b ，4株为产米酵菌酸的椰毒假单胞菌酵米面亚种，1株为不产毒株。
表2 疑似菌落在PDA 平板和卵黄琼脂平板上形态特征[13] Table 2 Characteristics of suspected colonies on PDA plate and egg yolk agar plate
菌落类型 PDA 平板上菌落特征
卵黄琼脂平板上菌落特征
1 偏淡绿菌落，整体光滑湿润，边缘整齐，
中间颜较深，单菌落生长时中心凸起呈草帽状 中间一点凸起较湿润，从中心往外扩散逐渐干燥，
斜射光下周围有明显的光泽
2
小型电加热蒸汽锅炉
乳白菌落，整体光滑湿润，边缘整齐， 颜分布均一，部分单菌落中心凸起呈轻微草帽状 菌落表面凸起，湿润光滑，菌落外圈有 少量的透明圈，斜射光下有光泽
3
乳白菌落，菌落较多区域呈现轻微黄绿，光滑 湿润，边缘整齐，单菌落中心凸起呈草帽状， 中心和周围颜较深，中间环状区域颜较浅 菌落表面凸起，湿润光滑，菌落周围分布有 乳白浑浊环，斜射光下浑浊环表面呈虹彩现象
4
乳白中带淡黄菌落，整体光滑湿润，边缘整齐， 菌落集中区域呈现黄绿荧光，单菌落中心凸起呈草 帽状，中心和周围颜较深，中间环状区域颜较浅
菌落表面凸起，湿润光滑，菌落周围分布有
乳白浑浊环，浑浊环分布较大， 斜射光下浑浊环表面呈虹彩现象
5
stewart平台
乳白菌落，光滑湿润，边缘整齐， 中心凸起，菌落集中区域泛黄绿荧光
菌落表面凸起，光滑湿润，周围有浑浊环，颜 与菌落相似，斜射光下可见环表面呈虹彩现象
2.2 样品在不同分离平板上疑似菌落的形态特征及生化特性
2.2.1 在PDA 平板和卵黄琼脂平板上的菌落特征
样品加入GVC 增菌培养液培养48 h 后划线分离培养[13]，在13个样品中发现疑似唐菖蒲伯克霍尔德
263
菌株14株，其中在1个样品中发现了2株。14株疑似菌落在PDA 平板和卵黄平板上呈现出5种形态特征，如表2、图1和图2所示。5种菌落形态特征与GB/T 4789.29-2003的菌落特征描述较相似[13]。
图1 PDA 平板上菌落特征
Fig.1 Characteristics of colony on PDA plate 注：序号对应表2中菌落类型，图2同。
图2 卵黄琼脂平板上菌落特征
Fig.2 Characteristics of colony on egg yolk agar plate
2.2.2 疑似菌落的生化特性
将上述5种类型菌落在卵黄琼脂培养基上培养48 h 后，挑取典型单一菌落接种PDA 平板培养24 h ，然后用VITEK 2 Compact 生化鉴定分析，具体的鉴定结果见表3。
表3 类型1~5的生化反应结果
Table 3 Biochemical reaction results of type 1~5
生化指标
生化反应
1 2 3 4 5 丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶(APPA)
- - - - - 侧金盏花醇(ADO) - (+) + + - 吡咯烷基芳胺酶(PyrA) - - - - - L-阿拉伯醇(lARL) - - - - - D-纤维二糖(dCEL) + - - - + β-半乳糖(BGAL) - - - - - 硫化氢(H 2S)
- - - - - β-N-乙酰葡萄糖苷酶(BNAG) - - - - - 谷氨酰芳胺酶(AGLTp) - - - - - D-葡萄糖(dGLU) + + + + + Y-
谷氨酰转移酶(GGT) - - - - - 葡萄糖发酵(OFF) - - - - - β-葡萄糖苷酶(BGLU) - - - - - D-麦芽糖(dMAL) + - - - + D-甘露醇(dMAN) + - + + + D-甘露糖(dMNE) + + + + + β-木糖苷酶(BXYL) - - - - - β-丙氨酸芳胺酶(BAlap)
- - - - -
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L-脯氨酸芳胺酶(ProA)
- + - - + 脂酶(LIP) - - - - - 古老糖(PLE) - - - - - 酪氨酸芳氨酶(TyrA)
- + - + - 尿素酶(URE) - - - - + D-山梨醇(dSOR) + - + + + 蔗糖(SAC) + - - - + D-塔格糖(dTAG) - - - - - D-
海藻糖(dTRE) - + + + - 柠檬酸盐(钠)(CIT) + + + + + 丙二酸盐(MNT) - - - - (-) 5-酮-葡萄糖苷(5KG) - - - - - 乳酸盐产碱(lLATk) + + + + + α-葡萄糖(AGLU) - - - - - 琥珀酸盐产碱(SUCT) + + + + + N-乙酰-β-半乳糖氨酶NAGA - - - - - α-半乳糖苷酶(AGAL) - - - - - 磷酸酶(PHOS) - - - - - 氨基乙酸芳胺酶(GlyA) - - - - - 鸟氨酸脱羧酶(ODC) - - - - - 赖氨酸脱羧酶(LDC) - - - - - 组氨酸同化(lHISa) - - - - - COURMARATE(CMT) + + - - +
β-葡萄糖苷酸酶(BGUR) - - - - - O/129耐受(O129R)
+ - - - + 谷氨酸-甘氨酸-精氨酸芳胺酶(GGAA)
- - - - - L-苹果盐酸同化(lMLTa)
+ - - - - ELLM
- - - - - L-乳酸盐同化(lLATa) - - - - - VITEK 鉴定结果
化妆品软管类鼻疽伯克霍尔德菌
荧光假 单胞菌
唐菖蒲伯克霍尔德菌
唐菖蒲伯克 霍尔德菌
未能鉴定 的菌株
注：当生化反应结果稍低于阈值时显示为弱阴性（-），当生化反应结果稍高于阈值时显示为弱阳性（+）。
鉴定结果表明，3号和4号菌株为唐菖蒲伯克霍
尔德菌，1号菌株为类鼻疽伯克霍尔德菌，2号菌株为荧光假单胞菌，5号菌株未能鉴定出细菌种类。从生化反应特性上看，类鼻疽伯克霍尔德菌和唐菖蒲伯克霍尔德同属于伯克霍尔德菌属，故两者的生化差异不大，主要区别在于唐菖蒲伯克霍尔德菌可利用侧金盏花醇(ADO)，类鼻疽伯克霍尔德菌可利用D-纤维二糖(dCEL)、D-麦芽糖(dMAL)、蔗糖(SAC)以及D-海藻糖(dTRE)；荧光假单胞菌在生化反应上大部分和唐菖蒲伯克霍尔德菌类似，主要区别在于D-甘露醇(dMAN)、L-脯氨酸芳胺酶(ProA)和D-山梨醇(dSOR)；未能鉴定的菌株生化反应与唐菖蒲伯克霍尔德菌的也大部分相
似，也有可能是伯克霍尔德菌属中的一种。
2.3 唐菖蒲伯克霍尔德菌的毒性试验 2.
3.1 毒力测试
将鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德菌的6株菌株，分别编号为S1、S2、S3、S4、S5和S6，其中S2和S3为同1份碎米样品分离出的2株菌株（见表4）。按照GB/T 4789.29-2003进行产毒培养，提取粗毒素，分别对体重18~20 g 的小白鼠经口灌胃[13,15,16]。菌株S3和S6的粗毒素灌胃的小白鼠均没有死亡，菌株S1、S2、S4和S5的粗毒素灌胃的小白鼠均在24 h 内死亡，表明菌株S3和S6为不产毒株，菌株S1、S2、S4和S5
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