刘艳玲;刘晓志;赵伟;王志明
【摘 要】细胞表达的性单克隆抗体多数是糖蛋白.附着在蛋白质上的多糖直接影响蛋白质药物的稳定性、生物活性及免疫原性.因此,应对糖蛋白产品上的多糖进行充分分析,以控制产品质量.然而,糖蛋白上多糖的复杂性对检测带了艰巨挑战.介绍了糖蛋白上多糖分析的最新进展,以及利用凝集素芯片技术的高通量多糖分析法,重点介绍了用于检测糖基化位点、糖链结构和含量的测定分析方法,以期为糖蛋白药物的研发提供参考. 【期刊名称】《生物技术进展》
【年(卷),期】2016(006)004
【总页数】5页(P244-248)
【关键词】系统中断控制器性糖蛋白药物;多糖分析;凝集素芯片技术
【作 者】刘艳玲;刘晓志;赵伟;王志明
【作者单位】华北制药集团新药研究开发有限责任公司,抗体药物研制国家重点实验室,石家庄050015;华北制药集团新药研究开发有限责任公司,抗体药物研制国家重点实验室,石家庄050015;华北制药集团新药研究开发有限责任公司,抗体药物研制国家重点实验室,石家庄050015;华北制药集团新药研究开发有限责任公司,抗体药物研制国家重点实验室,石家庄050015
【正文语种】中 文
纱窗角码
细胞表达的生物技术药物多数是糖蛋白，包括单克隆抗体、重组蛋白、融合蛋白、生长因子、细胞因子、酶和激素。这些药物被用于癌症、自身免疫性疾病及其他危及生命的疾病的。适度糖基化对药物的溶解性、稳定性、生物活性、安全性、药代动力学和药效动力学等特征具有重要影响。药物糖基化不但可以增加药物体外稳定性，还可以保护蛋白药物免受体内蛋白酶的降解。非糖基化促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)较糖基化EPO，更易受到化学物质、pH变化或是加热引起的变性或降解。
多肽修饰蛋白质糖基化可以影响蛋白药物PK/PD特征，研究显示，末端半乳糖部分糖基化蛋白，较末端唾液酸完成糖基化蛋白具有更短的循环寿命。由于肝细胞表达的唾液酸糖蛋白受体同
半乳糖结合，促进了肝脏对部分糖基化蛋白的清除。特异性结合末端甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和岩藻糖凝集素样受体，也可以清除含有上述糖基的糖蛋白药物。
此外，Fc片段糖基化对于Fc和 Fcγ受体相互作用至关重要。人Fcγ受体分为激活型受体(FcγRIa、FcγRIIa和FcγRIIIa)及抑制型受体(FcγRIIb)。Fc片段糖基化影响抗体FcγRs或补体C1q的亲和常数，进而影响其免疫功能，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬(antibody-dependent cell-mediated phagocytosis,ADCP)和补体依赖的细胞毒作用(complement dependent cytotoxicity,CDC)。优化Fc片段的糖基化，可以提高性单克隆抗体的药物活性。
蛋白质糖基化是复杂的翻译后修饰过程，在蛋白特定位点上进行糖基化修饰，通常修饰位点是天冬酰胺残基(N-链接)或是丝氨酸/苏氨酸残基(O-链接)，N-链接糖基化修饰通常发生在Asn-X-Ser/Thr(X是非脯氨酸氨基酸)，O-链接糖基化修饰通常发生在丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)残基上，通过N-乙酰半乳糖胺(Gal- NAc)和Ser/Thr的羟基形成O-糖苷键。蛋白质糖基化过程从内质网开始，将Glc3Man9GlcNAc2糖链添加到Asn-X-Ser/Thr序列的Asn上。通过各种糖苷酶修剪，糖蛋白被运输到高尔基体进行下一步修饰。通过多次催化修饰，形成
多种N-糖链结构，如高甘露糖，复杂、混合糖等结构。O-链接糖的生物合成，是在高尔基体内将UDP-GalNAc转化为Gal-NAc，再连接到Ser/Thr残基上。O-GalNAc前体的起源不同，因此产生了8种O-GalNAc聚糖核心结构，哺乳动物中常见是其中的4种聚糖核心结构。恶劣捕捉
蛋白质药物的糖基化通常受到宿主细胞类型和发酵条件(如培养基、pH、温度、搅拌)的影响。性蛋白药物通常使用哺乳动物细胞、酵母或转基因动物进行生产，每种宿主系统都具有独特的糖基化机制，生产的蛋白药物也具有不同的糖基化模式[1,2]。哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞)被广泛用于性糖蛋白的生产。哺乳动物细胞表达的蛋白可能含有少量非人源多糖，如高含量甘露糖修饰的N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)和末端α1-3-半乳醣 (α-Gal)。其他表达系统(转基因植物和转基因动物)可能会产生更多的非人源多糖，如木糖蛋白多糖、Neu5Gc或末端α-Gal，这些多糖的存在可以引起药物的免疫原性反应。由于复杂的糖基化过程，在糖基化模式上会存在宏观和微观的异质性。宏观异质性是指糖基化位点和数量的变化，而微观异质性是指在特定位点上的糖链结构的变化。宏观和微观的异质性有助于产生多样性糖基，虽然其蛋白质氨基酸系列相同，但糖基化位点、糖含量或结构都有可能不同[3]。性糖蛋白药物糖链异质性的多水平(糖蛋白药物、多糖、单糖水平)分析面临着诸多挑战。性糖蛋白药物，特别是生物仿制药的研发过程中，通常要联合
使用多种方法对其糖基化的性质进行分析，如糖基化位点、糖链结构和数量等。高效液相谱法(HPLC)、毛细管电泳(CE)、质谱(MS)、等电聚焦(IEF)和凝集素芯片法等方法常被用于完整糖蛋白、糖肽多糖、多糖和单糖分析[4]。
可以直接对完整糖蛋白多糖的一般模式和异质性进行分析。可以使用电喷雾电离-飞行时间质谱(ESI-TOF)和反相(RP)的高效液相谱或排阻谱(SEC)完成上述检测。RPLC-MS检测可以为蛋白质检测提供更好的谱分离，并在检测完整的单克隆抗体时表现出很高的分辨率[大约(150 000±1.5)Da]，但检测过程需要较高柱温(60～80℃)。虽然，SEC-MS可以使用非变性或变性流动相在室温条件下工作，得到高质量的质谱结果，但是其分辨率比RP低。LC-ESI-MS可以用于更复杂的性蛋白检测，如促红细胞生成素，这个产品中包括了1个O-糖基化位点和3个N-糖基化位点[5]。而传统ESI-TOF-MS可以用于分析结构更复杂的异构糖蛋白，如darbepoetin-α(已知含有5个N-糖基化位点)[6]，但在变性条件下检测仍难以完成，最近开发的Orbitrap ExactiveTM 和高分辨质谱仪联用，可以在自然条件下得到高度复杂的高分辨的糖链信息[7]，这项技术的优势在于，使用水性醋酸铵缓冲液对检测蛋白离子化处理，使得蛋白处于无电荷的天然折叠状态。此外，ESI-MS和MALDI-MS的联合使用可以用于小型完整糖蛋白的多糖分析，但是质谱的分辨率低[5]。
为了提高分析的灵敏度，可以将单克隆抗体药物还原为重链和轻链再进行分析。常使用二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、半胱胺等还原剂。另外可以选择木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、IdeZ和IdeS将单克隆抗体降解为更小的片段。木瓜蛋白酶作用于IgG铰链区上方，将IgG裂解为3个片段，2个Fab和1个Fc片段，胃蛋白酶作用于IgG铰链区下方，将IgG裂解为F(ab’)2和降解的Fc片段。IdeZ和IdeS将IgG裂解为F(ab’)2和一个完成的Fc片段[8]。
也可以CE-MS进行糖基异质性分析。使用IEF、CE、cIEF或是IEX谱法，在完整糖蛋白水平上进行蛋白质唾液酸化的异质性分析。这些方法通常用于质量控制检测；IEF和IEX是传统方法，但与MS不兼容。CE 和 cIEF是新兴技术具有高速、高分辨率和MS兼容等优势，但毛细血管可能会吸附蛋白质[9]。
利用ESI-MS或MALDI-MS对蛋白质的糖基化位点和占有率进行分析。可以使用这种方法分析很难从肽链上解离的O-链接糖基。通过多肽分析，可以检测其他翻译后的多糖修饰。用对蛋白质系列高度特异的蛋白酶，如胰蛋白酶、Lys-C或Glu-C，将糖蛋白降解为适当的片段。再用多种组合方法对片段进行检测，例如对EPO的检测。
糖蛋白质降解形成糖多肽，在MS分析之前，通常使用HPLC对糖多肽进行分类富集，以克
服因电离子引起的糖肽信号抑制。可以通过HPLC和ESI-MS的联合使用实现在线检测，或使用MALDI-MS进行离线检测，现在较为广泛高效使用的LC-ESI-MS可以实现在线检测。由于共洗脱高丰度糖肽的离子抑制，使用传统C18柱RPLC-MS分析检测低丰度糖肽时面临诸多挑战。HILIC可以更好地分离亲水性糖多肽和常规多肽。但是，具有相同质量糖多肽的异构体不能通过这种方法进行分离。最近，一种新型纳米LC-MS方法可以用于分离糖多肽异构体。在包被微流毛细管芯片的多孔石墨碳中，链霉蛋白酶E可以将糖多肽异构体的肽链进行非特异性消化，使肽链的氨基酸残基小于3个，便于糖多肽的分离和检测。另一方面，发酵过程中Fc糖基化的高通量检测技术得到了发展[10]。用结合Protein A 96孔板对IgG进行纯化，胰蛋白酶消化糖蛋白， HILIC提取，再进行ESI-MS分析，这种方法可以不使用HPLC对糖多肽进行分离[11]。
单电荷离子产生的MALDI质谱图相对简单，因此MALDI较ESI更适合用于糖肽分析。但是存在非唾液酸糖肽的衰变对实验的干扰，需要在MALDI-MS分析时对样品进行唾液酸衍生处理。
糖肽串联质谱分析可以测定糖肽上的糖基化位点及多糖组成。最近开发的电子转移解离(ET
D)技术，可以裂解肽键对糖蛋白的糖基化位点进行分析。而碰撞诱导解离(CID)技术，可以将多糖从糖肽上解离下来，分析多糖的组成和序列信息。将这些方法组合在一个LC-MS实验中，可以得到有效的糖肽序列信息[12]。
CE-MS可以在糖肽水平上对其特异结合位点的微观异质性进行有效分析。传统RPLC-MS检测中，高度亲水性肽可能与RP谱基质发生作用，造成样品在上样和脱盐过程中的丢失。因此CE-MS可以更好的用于亲水性多肽检测并实现完整的序列覆盖。
N-糖苷酶F可以将N-链接多糖从糖蛋白上解离下来。通常使用还原碱性技术将O-链接多糖从糖蛋白上释放，但是，很难将全部的多糖释放。MALDI-TOF MS对糖链进行快速鉴定，使用甲基化加强电离的有效性和唾液酸化糖的稳定性。此外， 酯化唾液酸可以增加唾液酸的稳定性，同时可以使用MALDI-MS对不同的唾液酸键(a2-3和a2-6)进行分别检测。
脱硝催化剂成分为了方便HPLC和MS的多糖分析，通常使用还原胺化反应对多糖进行荧光标记。最常用的荧光标记物有：2-氨基苯甲酰胺(2-AB)和氨茴酸(2-AA)。2-AB缺少负电荷，HPLC是数据库建立的金标准，但是电离效率低。2-AA带有一个负电荷，适用于CE和MALDI分析。最近研究表明，普鲁卡因胺较2-AB荧光标记多糖，具有更好的电离效率和荧光强度，有利于对应
低丰度N-链接多糖的分析[13]。HPLC和MS分析前的纯化步骤有利于多余标签和盐的去除，他们包括用于标记检测的HILIC、RP、PGC和凝胶过滤等方法[14]。
使用HILIC、RP-HPLC或阴离子交换HPLC(AE-HPLC)等谱方法对标记的多聚糖进行分离。HILIC较HPLC方法在分离多糖时，表现出更好的分辨率。2-AB标记的多糖洗脱同2-AB标记的葡聚糖标准(葡萄糖均聚物)进行比较，葡聚糖标准是一组葡萄糖聚合数已知的物质标准。这个信息可以用于计算单糖丰度，预测糖链结构。另一方面，没有荧光标记的N-糖链，可以通过HPLC同HPAEC-PAD或是PGC谱联用进行分析，但是方法的耐用性和重复性较差。
水垢过滤器
荧光标记的解离多糖也可以使用CE进行分析，得到高灵敏度和分辨率的分析结果。低聚糖CE分析常使用APTS(或2-AA等)作为荧光标记物，可以用于区分糖链结构的同分异构体。然而，只有几个多糖标准有相对应的糖链结构CE峰信号。因此，利用CE对糖苷外切酶顺序消化的寡糖进行分析，可以得到更详细的多糖序列信息。MS和CE-MS联用可以对肽和糖型特性进行分析，但在寡糖分析中的应用有限。利用HILIC、CE和HPAEC-PAD等7种方法，对Fc解离的多糖进行分析，各种分析方法得到的糖型和含量结果相似。由于寡糖异构
和支链的存在，对糖链结构的确认带来了挑战。传统方法是使用糖苷外切酶，将末端的单糖依次解离，再用HILIC、CE或MALDI-MS进行分析。根据不同糖苷酶实验得到的葡萄糖数目、消化时间和质谱数据变化，推测糖链原始结构对于新糖链结构分析，使用这些方法可以得到有价值的信息，但是方法耗时长，且需要高纯度糖苷酶进行糖链消化[15]。LC-ESI-CID-MS/MS用于糖链测序，具有速度快、灵敏度高的优势。使用MS分析糖苷链方式时，需要在负离子模式低能量CID条件下，使用ESI-QTOF MS将糖苷环切开。但是，MS分析不能解决结构异构体及确定糖链的三维结构等问题。上述问题可以通过核磁共振(NMR)和结晶X射线等方法解决。核磁共振被用于新糖链信息结构的确认，但是需要样品量大。新研发的离子迁移(IM) MS技术，根据分子大小、形状、电荷情况将其电离为气相，增加了检测糖链异构体的有效性。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议