CD4$CD%&$’细胞在CD($’细胞抗肿瘤免疫中的调节作用 施敏敏，刘炳亚，李强，张轶，陈雪华，陈皓，朱正纲
(上海第二医科大学附属瑞金医院外科上海消化外科研究所，上海200025)
摘要：实验旨在研究CD4+CD25+T细胞在CD8+T细胞抗肿瘤免疫中的调节作用。将小鼠脾脏中分离的单个核细胞分为两组，即去除CD4+CD25+T细胞组和未去除CD4+CD25+T细胞组，测定树突状细胞提呈的肿瘤抗原多肽刺激不同T细胞增殖活性、细胞因子IFN!γ分泌，以及多肽特异性CD8+T细胞对同源性胃癌细胞株MFC的杀伤活性。结果显示预先去除未致敏T细胞中的CD4+CD25+T细胞，所诱导的特异性CD8+CTL对肿瘤细胞免疫应答增强，表现为反应性T细胞对树突状细胞提呈的肿瘤抗原多肽增殖反应增强,IFN!γ分泌量提高及CD8+T细胞对MFC杀伤活性增强。这些结果表明，预先去除未致敏T细胞中的CD4+CD25+T细胞，肿瘤抗原多肽修饰的树突状细胞肿瘤疫苗效能可明显增加。CD4+CD25+T细胞在CD8+T细胞抗肿瘤免疫中起下调作用。 关键词:CD4+CD25+T细胞；多肽表位；树突状细胞；肿瘤；免疫
中图分类号:R392;R730.54文献标识码:A文章编号:1001!2478(2005)05!0384!05
!"#$#%&’()*$+$*’,*-./01.234156,’’789)",.2:;56,’’7<,=8>),?>9)8!)&! <*$8<<&98)+
SHI Min!min,LIU Bing!ya,LI Qiang,ZHANG Yi,CHEN Xue!hua,CHEN Hao,ZHU Zheng!gang(Department of Surgery,Shanghai Institute of Digestive Surgery,Ruijin Hospital,Shanghai Second Medical University,Shang_ hai@AAABC,Dhina)
@A7)$(6):The regulatory role of CD4+CD25+T cells in the CD8+T cell mediated anti!tumor immunity was investi! gated in the present study,in which the mononucleated cells(MNC)isolated from mouse spleen were divided in! to the CD4+CD25+T cells eliminated group of mice and that without elimination of cells,and the proliferative ac! tivity of T lymphocytes induced by peptides of tumor antigens presented through dendritic cells,release of IFN!γand the killing activity of peptide!specific CD8+T cells to the homologous gastric carcinoma cell line MFC were assayed in vitro,respectively.The experimental results demonstrated that the CD8+T cells in group of mice with elimination of CD4+CD25+T cells could induce enhanced anti!tumor immunity in terms of stronger proliferative activity of T lymphocytes against peptide pulsed dendritic cells,elevation of IFN!γsecretion as well as enhanced cell lysis against homologous cancer cells.It is concluded that the elimination of the CD4+CD25+T cells in the na"ve T cells population can significantly improve the potency of peptide augmented dendritic cells based tumor vaccine,and the CD4+CD25+T cells can down!regulate the CD8+T cell mediated anti!tumor immunity.
B,+C*$?7:CD4+CD25+T cells;peptide epitope;dendritic cells;tumor immunotherapy
树突状细胞(dendritic cells,DC)是一类功能强大的专职抗原提呈细胞，能刺激初始型T细胞增殖，激发机体免疫应答，在诱导、调节及维持机体抗肿瘤免疫中起核心作用[1]。以DC为基础的肿瘤疫苗是目前国内外免疫学领域研究热点，原因是其可以充分调动机体主动性免疫功能来清除肿瘤细胞，但临床疗效尚不理想，主要因素为机体免疫反应是一个完整的网络，肿瘤疫苗虽然可以在一定程度上刺激免疫应答，但体内存在调节机制，在活化CTL的同时，调节性T细胞功能也可能上调，因此，研究高效肿瘤疫苗，在诱导强效抗肿瘤免疫应答的同时，需避免调节性T细胞引起的免疫抑
收稿日期:2004!11!22；修回日期:2005!05!25
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30170915)
作者简介：施敏敏(1981!)，女，上海市人，实习研究员，主要从事移植免疫学研究。
通讯作者：刘炳亚(Email:*****************)
制。CD4+CD25+T细胞作为一类调节性T细胞，最初因在诱导机体免疫耐受方面发挥重要免疫调节功能而备受重视[2]。在肿瘤患者中CD4+CD25+T细胞比例升高，由此推测该类细胞在肿瘤免疫中起下调作用[3]。研究预先去除未致敏T细胞中的CD4+CD25+T 细胞，观察是否影响多肽修饰的DC肿瘤疫苗
的抗肿瘤免疫效能。
!材料与方法
!"!实验动物与细胞株6～8周清洁级615小鼠(H-2K K,MHC II)购自上海必凯实验动物公司。来源于615小鼠的表达MAGE-3的小鼠前胃细胞癌(MFC)，由我所传代培养[4]。
!"#试剂淋巴细胞分离液购自上海华精生物高科技有限公司。小鼠CD11c、CD8a及CD4+CD25+T 细胞分离磁珠购自德国Miltenyi Biotec公司。Cytotox TM96细胞杀伤试剂盒及CellTiter96!细胞增殖试剂盒购自Promega公司。重组小鼠细胞因子IL-2、IL-7、IL-4、TNF-!、GM-CSF购自R&D公司。小鼠IFN-"ELISA试剂盒购自Biosource公司。PE或FITC标记的抗-CD3、抗-CD4、抗-CD8、抗-CD25及相应同型对照单克隆抗体购自BD公司。Opti-MEM无血清培养液及IMDM粉剂购自GIBCO 公司。RPMI1640培养液购自杭州吉诺生物医药技术有限公司。小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。
!"$多肽及引物合成615小鼠MHC I类分子(H-2K K)限制性多肽表位MAGE-341-49(序列:SNKVYG-SAI)由本所筛选[5]。该多肽由上海生物工程公司合成，纯度>95%。Foxp3引物(上游:5'-TCA ATG TGG CCA GTC TGG AAT-3'，下游:5'-TGA GTA CTG GTG GCT ACG ATG C-3')，内参GAPDH引物(上游:5'-CAT CAC CAT CTT CCA GGA GCG-3'，下游:5'-TGA CCT TGC CCA CAG CCT TG-3')由博亚公司合成。
复合肥振动筛!"%&’的分离与培养断椎法处死小鼠，取其脾脏，研碎后制成单细胞悬液加入淋巴细胞分离液中，以2000g×20min密度梯度离心，收集界面细胞即为单个核细胞(mononuclear cells,MNC)。计数后每1×108MNC加入100#l CD11c磁珠4℃孵育15min，充分洗脱后加入磁分选柱进行细胞分选，正选获得CD11c+未成熟DC。加入DC培养液(10%IMDM+25ng/ml GM-CSF+25ng/ml IL-4+50ng/ml TNF-!)37℃、5%CO2培养24h诱导成熟。!"(’&%)’&#()*细胞的分离及鉴定每1×107 MNC加入10#l生物素标记抗体混合物4℃孵育10min，再加入20#l抗-生物素磁珠及10#l PE 标记抗CD25抗体,4℃孵育15min后过柱正选获得CD4-T细胞，负选即为CD4+T细胞。CD4+T细胞中再加入10#l抗-PE磁珠,4℃孵育15min后过柱正选获得即为CD4+CD25+T细胞，负选的CD4+CD25-T细胞与CD4-T细胞混合作为去除CD4+CD25+T细胞的反应性T细胞。分离到的CD4+ CD25+T细胞Foxp3表达如文献[6]所述。
!"+多肽冲激&’诱导成熟的DC用Opti-MEM 重悬，细胞浓度调整为1×106/ml。加入MAGE-341-49多肽，终浓度为20#g/ml。孵育4h，洗2遍后用10%IMDM重悬，细胞浓度调整为5×105/ml作为刺激细胞待用。
!"，淋巴细胞增殖试验实验分两组：一组初始反应性T细胞为去除CD4+CD25+T细胞的MNC；另一组初始反应性T细胞为未去除CD4+CD25+T细胞的MNC。用10%IMDM重悬反应性T细胞，细胞调整为2×106/ml，多肽冲激的DC与反应性T细胞的比例为1:10、1:20、1:40。平底96孔板中分别加入100#l反应性T细胞及不同浓度的刺激细胞100#l，每种浓度设4个复孔。另设未多肽冲激DC组及空白组。培养3
d后收集100#l上清测定IFN-"分泌量。再向96孔板中加入20#l CellTiter 96!一步性MTS缓冲液，孵育4h，在波长490nm 处测定吸光度(A值)。分别计算其刺激指数，刺激指数=(多肽冲激的DC刺激组A值-空白组A值)/ (未多肽冲激的DC刺激组A值-空白组A值)。!"-./01!$%!!%2多肽特异性’*3体外诱导分组同前，用10%IMDM重悬反应性T细胞，细胞调整为2×106/ml。于96孔圆底板中各加入100#l反应性T细胞及100#l前述已多肽冲激抗原的DC共培养,7d后再用多肽冲激抗原的DC刺激一次(反应细胞：刺激细胞比为20:1)，每隔3d细胞半量换液，加入含IL-2(2ng/ml)和IL-7(5ng/ml)的10% IMDM培养液。刺激3个循环后收集MAGE-341-49多肽特异性CTL进入下一步实验。
!"2细胞杀伤试验用CD8+磁珠分选得到CD8+ CTL，与靶细胞共培养4h后以LDH释放值评价CTL的杀伤效应。按照试剂盒推荐的程序操作。所用的培养基为含5%胎牛血清的无酚红RPMI1640,
每种反应均设3个复孔，测定靶细胞自发释放值、靶细胞最大释放值、效应细胞自发释放值、容量校正值和培养液背景A 值。应用如下公式计算杀伤效应：杀伤率(%)=(实验值-效应细胞自发释放值-靶细胞自发释放值)/(靶细胞最大释放值-靶细胞自发释放值)×100%。
1.10IF&!!测定
轮胎套筒ELISA 测定IFN -!分泌按照试
剂盒推荐的程序操作。
1.11
统计学处理电源线扣
统计学处理利用Excel 6.0软
件,P <0.05视作具有统计学意义。
’
结果
’.1
脾脏()*+()’,+-细胞的分离及鉴定
流式
细胞仪检测脾脏来源T 细胞表型提示,CD4+CD25+
T 细胞占正常小鼠脾脏MNC 的2.52%。经磁分选后,CD4+CD25+T 细胞仅占脾脏MNC 的0.04%,
提示CD4+CD25+磁珠可有效的从MNC 中去除CD4+
CD25+T 细胞(图1)。RT -PCR 证实Tr +组T 细胞表达Foxp3(图2)。
正常MNC
磁珠分离后MNC
100101102103104
100101102103104
100101102103104
100101102103104
100101102103104
100101102103104
C D 4P E
一氧化氮 笑气
Mouse IgG1FITC
CD25FITC
M o u s e I g G 2a P E
0.04%
2.52%
CD25FITC
C D 4P E
图1
()*+()’,+磁珠有效去除()*+()’,+-细胞
’.’)(负载./01!2*1!*3多肽刺激.&(增殖分别用去除和未去除CD4+CD25+T 细胞的MNC 作为
反应细胞，在负载抗原多肽的DC 刺激下，去除
CD4+CD25+T 细胞的MNC 较未去除CD4+CD25+T 细胞的MNC 增殖反应强烈，表现为DC :MNC 不同比例时前者刺激指数均高于后者(P <0.05，图3)。
去除CD4+CD25+T 细胞MNC 在多肽冲激的DC 刺激下分泌的IFN -!量比未去除CD4+CD25+T 细胞的
MNC 高(550pg/ml vs 250pg/ml ,P <0.05)。上述结果表明,MNC 中去除CD4+CD25+T 细胞后，在负载多肽的DC 刺激下增殖反应可以增强。
’42./01!2*1!*3多肽特异性(-5对.F(的杀伤
功能
去除CD4+CD25+T 细胞的MNC 和未去除
CD4+CD25+T 细胞的MNC 分别用DC 提呈的多肽刺激，每周一次连续3周获得的效应性T 细胞表型分
析提示主要为CD8+CTL (图4)。未去除CD4+CD25+T 细胞的MNC 经多肽抗原致敏后,CD8+CTL 在效应性T 细胞比例为67.60%(图4A )；而去除CD4+
CD25+T 细胞的MNC 经多肽抗原致敏后,CD8+CTL 在效应性T 细胞比例为72.64%(图4B )。两组CTL
与表达MAGE -3抗原的同源性胃癌细胞株MFC 分别以25:1、12.5:1、 6.25:1、 3.12:1的比例做杀伤试验。结果表明，去除CD4+CD25+T 细胞的MNC 在多肽抗原刺激下，诱导产生的CTL 对MFC 的杀伤活性明显高于未去除CD4+CD25+T 细胞的MNC 组(图5)。
刺激指数
未去除CD4+CD25+T 细胞组去除CD4+CD25+T 细胞组
4.54.03.53.02.52.01.51.00.50
1:40
1:201:10
DC :MNC
Tr +
Tr -Foxp3GAPDH
图’-67与-68F9:;2表达
图2负载./01!2*1!*3多肽的)(刺激.&(增殖反应
!讨论
CD4+CD25+T 细胞在许多炎症反应起免疫调节
作用[7]。最初的研究关注CD4+CD25+T 细胞在器官特异性自身免疫病中的调节作用，认为CD4+CD25+T 细胞可抑制针对自身抗原的自身反应性T 细胞功能，该免疫调节作用表现为对自我抗原的免疫耐受[8]。识别"自我"和"非我"是免疫学中的中心问题，既然CD4+CD25+T 细胞可以诱导对自身抗原的免疫耐受，理论上该类细胞必然在识别外来抗原方面起免疫调节作用。新近的研究亦证实该设想,
CD4+CD25+T 细胞在调节机体识别外源性抗原(如
细菌、利什曼原虫)免疫应答中起抑制作用，表现为抑制CD4+T 细胞针对病原体的超敏反应，分泌
IL -4等Th2型细胞因子以调节Th1/Th2平衡向Th2
漂移等[9,10]。Sumit 等[11]研究表明：在单纯疱疹病毒感染前预先去除外周血中的CD4+CD25+T 细胞可以明显提高病毒多肽疫苗针对病毒的免疫应答，并且去除CD4+CD25+T 细胞的小鼠针对病毒多肽抗原的
CD8+
T 细胞免疫记忆应答是未去除CD4+
CD25+
T 细胞的小鼠的3倍。
肿瘤细胞作为一种机体"非我"成分，能够逃逸
机体的免疫监视原因复杂。随着T 细胞识别抗原的
"TCR -多肽-MHC "三分子复合物模型提出[12]，人们一直在寻求能强效诱导机体免疫应答的肿瘤抗原
多肽。MAGE -3来源的多肽是一类良好的肿瘤特异性抗原，原因是除了胎盘、睾丸外，正常组织不表达
该类抗原。而睾丸是免疫豁免器官，不表达MHC I 、
II 类分子，因此利用MHC I 类分子限制性MAGE -3多肽表位修饰的DC 肿瘤疫苗免疫不会攻击机
体正常细胞[13]。研究表明,MAGE -3多肽体外诱导的
CD8+T 细胞抗肿瘤免疫应答受CD4+CD25+T 细胞调节。在DC/MAGE -341-49刺激前，预先用磁珠去除未致敏T 细胞中的CD4+CD25+T 细胞，所诱导的特异性CD8+CTL 对免疫原性表位MAGE -341-49免疫应答反应增强，表现为反应性T 细胞对负载MAGE -341-49的DC 增殖反应增强，分泌Th1型细胞因子IFN -!及CD8+CTL 对表达MAGE -3(+)的同源性胃癌细胞株MFC 杀伤活性增强。因此，预先去除未
致敏T 细胞中的CD4+CD25+T 细胞，肿瘤抗原多肽修饰的DC 肿瘤疫苗效能可明显增加。与前述病毒多肽疫苗一致，实验结果提示预先去除未致敏T 细胞中的CD4+CD25+T 细胞，可以明显提高MAGE -3多肽修饰DC 体外诱导CD8+T 细胞的能力。因此，结果对多肽修饰DC 肿瘤疫苗设计策略提出了一个新的思路，即预先在未致敏T 细胞中用抗CD25单克隆抗体封闭外周血中的CD4+CD25+T 细胞可以增强该类肿瘤疫苗的疗效。参考文献
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Tera]e M,^erzo[s_Y JAW ImmunoreZulatorY T cells in tumor im -munitY[J]W Curr Opin Immunol,2004,1\T2UV157-1\2W
图"
#$%&!!’(!’)多肽特异性*+，对#-*的杀伤功能
杀伤率T ‘U
去除CD4+CD25+T 细胞组
未去除CD4+CD25+T 细胞组25"1
效靶比
3W12"1
\W25"1
12W5"1
25
20151050
!
"
!
!
!
!
"
""
"
小鼠I Z G 1X e r C X
100
104
100
104
小鼠IZG1FITC
小鼠IZG1FITC
100
104100
104
小鼠I Z G 1X e r C X
100
104
10
104
CD8XE
C D 3X e r C X 72W\4‘
CD8XE
C D 3X e r C X
100
10410
104
\7W\0‘
AW Tr +组
^W Tr a 组
图.
负载多肽的/*刺激诱导的效应+细胞表型分析
$%&吕斌，刘炳亚，陈雪华，等’小鼠胃癌()*+，抗原-2./限制性抗原肽的筛选$0&’上海免疫学杂志1200,12,(%):222
22%’
$5&李强，张轶，陈雪华，等’小鼠(-34类分子限制性()*+，多肽表位筛选$0&’上海第二医科大学学报12005125 5678956990’
$9&-:;<=1>:?@;A B1=A/AC@DE<=’3:FG;:H:I;JC@HAG:;K B DJHHL MJ NJH:O?JFG PK GEJ G;AFLD;<OG<:F IADG:;Q:RO,$0&’=D<JFDJ1200,12SS 5590S7820562092’
$6&TJAM=1(AH?LG;:?U1V:W;<J Q’3KG:G:R<D B HK?OE:DKGJ ALL:D< AGJM AFG<CJF%OHAKL AF JLLJFG<AH;:HJ<F GEJ I@FDG<:F:I3X255Y7 3X%5Y7;JC@HAG:;K DJHHL GEAG D:FG;:H<FGJLG<FAH<FIHA??AG<:F$0&’0 +RO(JM1200012S252782S5,02’
$Z&=A/AC@DE<=1=A/AC@DE<>1)LAF:(1JG AH’4??@F:H:C<D LJHI G:H J;AFDJ?A<FGA<FJM PK ADG<NAGJM B DJHHL JRO;JLL<FC4[2;JDJOG:;
AHOEA DEA<FL53X257’\;JA/M:WF:I A L<FCHJ?JDEAF<L?:I LJHI
G:HJ;AFDJ DA@LJL NA;<:@L A@G:<??@FJ M<LJALJL$0&’04??@F:H1 2SS512555,782252229%’$S&-:;<=13A;NAHE:B[1XJ?JFCJ:G0’3X25Y3X%Y;JC@HAG:;K B DJHHL L@OO;JLL3X%Y B DJHH?JM<AGJM O@H?:FA;K EKOJ;<FIHA??AG<:F M;<N
JF PK P e$%&’()*+)’,-+ ++<F<??@F:MJI<D<JFG?<DJ$0&’+@;0 4??@F:H120021,2557822Z222S2’
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,2%2’
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$22&周光炎’免疫学原理$(&’上海8上海科技技术文献出版社1 2000822S2,,’
$2,&XJ VHAJF+1XJ\AD/J;‘1);FA@M X1JG AH’)FJW IA?<HK:I ?:@LJ CJFJL E:?:H:C:@L G:GEJ E@?AF()*+CJFJL$0&’*J
F:?<DL12SSS155********Z%’
(上接第383页)
岁，平均年龄%0’S岁。所有研究对象均无内分泌疾病病史, 9个月内未使用激素等影响免疫功能的药物。
1.2标本的采集受试着空腹20～22E，晨起抽肘静脉血%?H。其中2?H离心后取上清液,2?H抗凝血提取淋巴细胞，标本-20℃保存。
1.3试剂及方法
1.3.11,25(()*2+3测定,2-放射免疫法，试剂盒为X<A=:;<F =G<HHWAGJ;(>'_=)产品。
1.3.2淋巴细胞维生素+3受体的测定采用淋巴细胞分离和裂解及+[4=)法，试剂由美国X[公司出品。UXT的测定步骤如下:!淋巴细胞的分离;"淋巴细胞的裂解：按5×206的淋巴细胞加入5?H的均质缓冲液。%℃、2000;]?<F 离心90?<F，取上清液置%℃测UXT的含量;#UXT的测定:+[4=)法，按试剂盒说明书进行。
1.4统计学处理所有数据均用3±)表示，两组数据比较用*检验，有关指标用=V==统计软件包做相关分析,4a0’05有统计学意义。
2结果
2.1(=患者U<GX,、血淋巴细胞UXT的含量均显著低于正常对照组(表2)。
2.2缓解期(=患者U<GX,、UXT略高于复发期，但无显著性差异(表2)。
2.3多发性硬化症患者VitD3与VDR之间的关系采用单
因素直线相关分析,(=患者U<GX
，与UXT之间的相关系数
3讨论
本文显示,(=患者U<GX
,
、UXT水平明显低于正常对
照组，我们认为正常情况下，维生素X
,
可以协助维持一种
免疫抑制紧张状态，但当维生素X及(或)其受体缺乏或减
少时，这种免疫抑制状态受到破坏，发生免疫紊乱，从而
促进了(=的发生和发展。还发现缓解期U<GX
,
、UXT虽然
低于复发期但无统计学意义，进一步证实维生素X
,
和(或)
其受体减少是(=的潜在危险因素，是(=频繁复发的病理
生理基础。此外，研究观察到随着维生素X的降低,UXT
多肽修饰有增高的趋势，但无明显的相关性，在此作者认为维生素X
的变化对UXT的负反馈调节作用是次要的，而UXT基因
自身决定的转录表达起主要作用。如有报道(=患者存在
UXT基因多态性。
(=是一种自身免疫性疾病，其主要应用免疫抑制
剂，但副作用很大。维生素X作为一种免疫调节剂，既可
预防及疾病；又不会引起广泛的免疫抑制作用，虽然
其在动物实验已经证实有一定的预防作用，但在患者中的
保护机制还有待进一步研究，且对其剂量和时间亦需进一
步探讨。
参考文献
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I:;?@HG<OHJ LDHJ;:L<L8C@<MJH<FJ I:;;JLJA;DE O;:G:D:HL$0&’)FF
>J@;:H12SZ,12,82262,2’
$2&周波，王晓红，王松涛，等’中国北方老年人血浆维生素X水
平的季节变化[!]"!中国骨质疏松杂志,200,,S(,):2S22S2’
表1正常对照组与+，组之间VitD
3
、VDR比较
组别U<GX
管式热交换器,
5FC]?H7UXT5F?:H]H7正常组,%2,’Z2±9’0S2,’65±5’S% (=组%220’26±5’5,b2S’%,±6’20b 与正常组比较,b P a0’05
表2复发缓解型+，患者复发期与缓解期VitD
3
、VDR比较
组别U<GX
,
5FC]?H7UXT5F?:H]H7复发期2Z S’5,±6’S22Z’S,±20’95缓解期2220’6Z±6’0920’22±S’S0为-cd0’226,P e0’05，无统计学意义。
豫公网安备41160202000603
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