(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
预埋槽道
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911120718.3
(22)申请日 2019.11.15
(66)本国优先权数据
201910850717.8 2019.09.10 CN
(71)申请人 中国医学科学院北京协和医院
地址 100730 北京市东城区王府井帅府园1
号
申请人 北京大学
(72)发明人 张博 周德敏 张烜 王妍
孙家琦
(74)专利代理机构 北京智为时代知识产权代理森林防火预警系统
事务所(普通合伙) 11498
代理人 王加岭 杨静
(51)Int.Cl.
C07K 14/55(2006.01)
A61K 38/20(2006.01)A61P 37/02(2006.01)
(54)发明名称
自身免疫病中的应用
(57)摘要
本发明涉及可使人白细胞介素-2靶向性激
人白细胞介素-2，以及在这些位点定点修饰的人
白细胞介素-2。修饰后的长效白细胞介素-2可以
在宽广的窗内靶向性激活调节T细胞，较少
甚至不激活其它效应细胞，起到长效系统性的抑
制免疫效果。本发明进一步涉及此类定点突变或
修饰的白细胞介素-2的应用，如作为稳定、长效
免疫抑制剂用于多种自身免疫病的用途。权利要求书2页 说明书14页序列表1页 附图9页CN 110642934 A 2020.01.03
C N 110642934
A
1.可使人白介素-2靶向激活Treg的修饰位点和修饰位点组合，所选修饰位点选自：示于SEQ ID No.1的第H16位，D20位、Y31位、N33位、R38位、T51位、A73位、K76位、H79位、N88位、D109位或其它具有靶向激活Treg活性修饰位点中的一个位点或多个位点的组合。
2.定点突变的人白介素-2，其在如权利要求1所述的特定位点的一个氨基酸或多个氨
基酸被突变为非天然氨基酸，所述非天然氨基酸为所
示的非天然氨基酸或其它含有叠氮结构的非天然氨基酸中的至少一种；所述特定位点选自：示于SEQ ID No.1的第H16位，D20位、Y31位、N33位、R38位、T51位、A73位、K76位、H79位、N88位、D109中的一个位点或多个位点的组合。
3.定点突变的人白介素-2，其与示于SEQ ID NO No.1的序列的区别在于：在SEQ ID No.1所示的序列的第N位的氨基酸被突变为非天然氨基酸，所述突变氨基酸与SEQ ID No.1所示的序列的连接方式如下式(II)所示：
由R1到R2的方向为氨基酸序列的N末端到C末端方向，其中第N位的氨基酸选自第H16位，D20位、Y31位、N33位，R38位、T51位、A73位、K76位、H79位、N88位、D109位氨基酸中的一个或几个，
R1为SEQ ID No.1所示序列的第1至第N-1位氨基酸残基，
R2为SEQ ID No.1所示序列的第N+1位至C末端的氨基酸残基，
R4为手机硬件加速
4.经过修饰的权利要求2或3所述的定点突变的人白细胞介素-2，其中用含非天然氨基酸的连接方式如下式(III)或(IV)所示：其中R3可为相同或不同分子量PEG，脂肪酸链、环糊精，糖，核酸，氨基酸，多肽或羧基端修饰基团，
(III)含有叠氮基团的非天然氨基酸插入人白细胞介素-2后用需要催化剂的修饰剂定点偶联的分子式；
(IV)含有叠氮基团的非天然氨基酸插入人白细胞介素-2后用含有环辛炔官能团的修饰剂定点偶联的分子式。
5.如权利要求4所述的经过修饰的人白细胞介素-2，其特征在于，当取代的氨基酸位点多于一个时，不同的取代位点偶联的修饰物可以是相同的，也可以是不同的。
6.经PEG、脂肪酸链、糖修饰的如权利要求1-5中任一项所述的特定位点突变的人白细胞介素-2，其在修饰位置引入的修饰剂分子量范围为1kDa-100kDa。
7.如权利要求6所述的经PEG修饰的特定位点突变的人白细胞介素-2，所述PEG分子量是5kDa，10kDa，20kDa，30kDa，或40kDa。
8.如权利要求7所述的经PEG修饰的特定位点突变的人白细胞介素-2，具体是H16-5K，H16-10K，H16-20K，D20-5K，D20-10K，D20-20K，Y31-5K，Y31-10K，Y31-20K，R38-5K，R38-10K，R38-20K，T51-5K，T51-10K，T51-20K，A73-5K，A73-10K，A73-20K，K76-5K，K76-10K，K76-20K，H79-5K，H79-10K，H79-20K，Y31/T51-20K或其它其中任意两位点组合并修饰20kDa大小PEG 的修饰产物，优选为H16-10K,H16-20K,D20-10K,D20-20K,Y31-20K,T51-20K，A73-20K、K76-20K、H79-10K、H79-20K、Y31/T51-10K或Y31/T51-20K。
9.药物组合物，其含有有效量的权利要求2或3所述的人白细胞介素-2或者权利要求4-8中任一项所述的经修饰的白细胞介素-2，以及药学上可以接受的载体。
10.权利要求2或3所述的白细胞介素-2或者权利要求4-8中任一项所述的经修饰的白细胞介素-2在制备用于免疫调节和多种自身免疫病药物中的用途。
11.权利要求2或3所述的白细胞介素-2或者权利要求4-8中任一项所述的经修饰的白细胞介素-2在制备用于移植物抗宿主病、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、自身免疫病性糖尿病、皮肌炎、硬皮病、多发性硬化、重症肌无力、脱髓鞘疾病、原发性肾上腺皮质萎缩、慢性甲状炎、慢性非特异性溃疡性结肠炎、慢性活动性肝炎、恶习性贫血与萎缩性胃炎、自身免疫性肾小球肾炎、肺肾出血性综合症、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、特发性白细胞减少症，自身免疫性脱发的药物中的用途。
靶向调节T细胞的长效白介素-2及其在自身免疫病中的
应用
技术领域
[0001]本发明属于生物制药领域，具体涉及定点修饰的白细胞介素-2，例如进行定点聚乙二醇化的白细胞介素-2的衍生物，使其具备靶向性调节T细胞的作用。本发明进一步涉及上述定点修饰的白介素-2在自身免疫病的用途，如作为安全、有效的类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、自身免疫性糖尿病等的用途。
背景技术
[0002]白细胞介素-2(interleukin-2)是第一类细胞因子，作为最早发现并药用的细胞因子之一，IL-2在免疫调节中具有至关重要的生物学作用。剪切了信号序列的人IL-2分子量为15418.02道尔顿，由133个氨基酸残基组成。
[0003]IL-2通过与细胞膜上的IL-2受体(IL-2R)结合发挥生物作用，IL-2R是由α、β、γ三分子亚基组成，其中α链(CD25)不具备信号传递功能，仅能与β和γ链一起，作为三分子复合物与IL-2形成高亲和力结合(Kd＝10pM)；而β链(CD122)和γ(CD132)链都属于I型细胞因子受体超家族，两者可以在缺失α链的前提下，与IL-2形成中亲和力结合(Kd＝1nM，进而传导下游信号(R.Spolski et al.,2018).三种受体亚基在不同的细胞亚中表达量各不相同，例如IL-2Rα可以在调节T细胞(Treg)表面持续长效表达；自然杀伤细胞(NK)和CD8+T杀伤细胞则在一般状态下低表达IL-2Rα而常规表达IL-2Rβ和γ。因此Treg细胞在机体无外来抗原刺激情况下，对IL-2的敏感性大于NK，CD8+T等效应细胞(Boyman et al.,2006).IL-2作为免疫调控的一柄“双刃剑”，在体内，稳态水平的IL-2浓度可以保证CD4+CD25+Treg细胞的存活和维持，但却不足以激活其它效应细胞；而由于效应细胞的数量大量高于Treg，过多的IL-2又会激活一定量的效应细胞，造成免疫增强的效果。因此，IL-2复杂的生物学效果决定了将其作为药物，用于免疫类疾病的复杂性和挑战性。
[0004]Treg细胞作为免疫抑制的关键效应细胞之一，对自身免疫病的发生发展具有重要意义。已有的研究表明，IL-2通过与Treg上的三分子IL-2Rs结合，传递下游信号通路，可将未成熟的CD4+CD25low
Foxp3low细胞转化为功能性Treg，通过上调CD25和Foxp3功能分子，发挥Treg的免疫抑制作用；另一方面，IL-2也可通过诱导Treg细胞的分化和生长，维持Treg在外围的功能稳态。IL-2作为Treg细胞激活调控的关键分子，在免疫病的上有巨大的潜力。如上所述的，由于IL-2α在Treg细胞表面的持续性高表达，因此Treg细胞在机体无外来抗原刺激的情况下，对IL-2更为敏感。通过精确的设计给药剂量和疗程，低剂量IL-2在自身免疫病中得到了越来越广泛的认可和应用。已有的研究表明，对患有恶性SLE的患者连续5天注射IL-2后，患者体内的Treg细胞水平和功能能够明显提高，症状得到明显改善(C.von Spee-Mayer et al.,2016)。随后的进一步研究表明，低剂量IL-2SLE中，除了改善Treg数量和功能外，还可抑制Tfh和Th17分化来调节免疫炎症反应而使机体恢复免疫稳态，为低剂量IL-2狼疮奠定了理论基础(J.He et al.,2016).此外，通过精确的控制给药剂量和给药方案，低剂量IL-2方案在包括I性糖尿病、移植物抗宿主病、类风湿关
用电监控
节炎、病毒诱导性血管炎等领域均起到一定效果，进一步支持了低剂量IL-2多种自身免疫疾病的可行性。
[0005]基于IL-2广泛且高效的生物学效应，使IL-2选择性激活靶细胞，提高IL-2对特定疾病的窗，对提高IL-2疾病的安全性和有效性具有重要意义。由于IL-2与受体复合物结合的高度灵活性，IL-2构象的改变或者对IL-2进行不同位置的屏蔽，将会显著影响IL-2对不同细胞亚的激活作用，起到靶向激活的效果。通过将IL-2与特定抗体偶联，形成IL-2抗体复合物，是实现这一策略的有效手段之一。Bo
yman等人的研究结果表明，通过将鼠源的IL-2与特定抗体JES6-1结合形成复合物，可以达到更显著激活Treg而较低水平激活其它效应细胞的效果(Boyman et al.,2006)；而将IL-2与另一种抗体S4B6结合，则可以在激活所有相关免疫细胞的前提下，更偏向激活效应细胞。更进一步的研究表明，JES6-1与IL-2结合后，空间上阻碍了IL-2与IL-2Rβ和γ的结合，同时也降低了IL-2与IL-2α的结合，使IL-2更偏向激活Treg；而抗体S4B6与IL-2的结合，不仅在空间上阻碍了IL-2与IL-2Rα的结合，而且使结合后的IL-2构象可以更稳定的与IL-2Rβ形成复合物，从而使IL-2/S4B6抗体复合物具有靶向性激活效应细胞的效果(J.B.Spangler et al.,2015)。基于上述研究工作，Eleonora等人筛选并优化了一系列针对人源的IL-2抗体，并最终确定了F5111.2可以和IL-2形成抗体复合物，用于偏向性激活Treg以移植物抗宿主病和自身免疫病性糖尿病等多种自身免疫病(E.Trotta et al.,2018)。另一方面，将IL-2与抗体或者抗体Fc段融合表达，对IL-2上多个位点进行精细的多点突变，以及对IL-2进行基于结构的重新设计合成等(J.B.Spangler et al.,2018；L.B.Peterson et al.,2018；A.B.Shanafelt et al.,2000；
多肽修饰>曲轨侧卸式矿车D.A.Silva et al.,2019)均可显著增加IL-2对特定免疫细胞的靶向性激活作用，起到更有效的激活或抑制免疫作用，进而用于特定疾病的。
[0006]尽管上述研究已经取得了一定的临床效果，但依然存在明显的实际应用问题。低剂量IL-2的方案针对不同疾病和不同个体存在很大的差别，难以在人体进行预测及剂量爬坡验证；另一方面，对于自身免疫病这类慢性疾病，IL-2需要长期多次注射给药也严重降低了病人的依从性；从应用抗体方
面，IL-2/抗体复合物的化学剂量配比和复合物稳定性使其不利于工业制备以及临床实际使用，而应用此类抗体或其它IL-2突变体带来的免疫原性也限制了此类型的方法在临床的广泛应用。因此，开发新型的以IL-2为基础的生物技术药物，使其靶向性激活特定免疫细胞亚，是该领域一直持续研究的关键科学问题，具有重要的临床转化意义。
发明内容
[0007]为了解决上述问题，本发明提供靶向调节T细胞的长效白介素-2及其在自身免疫病中的应用。
[0008]首先，本发明提供可使人白介素-2靶向激活Treg的修饰位点和修饰位点组合，所选修饰位点选自：示于SEQ ID NO：1的第H16位，D20位,Y31位,N33位，R38位、T51位，A73位，K76位，H79位，N88位，D109位或其它具有靶向激活Treg活性修饰位点中的一个位点或多个位点的组合，这些位点在修饰效果上，将更影响IL-2与IL-2受体β的结合，而较少影响对IL-2受体α的结合。
[0009]本发明还提供定点突变的人白介素-2，其在所述的特定位点的一个氨基酸或多个
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