一、抗原多肽选择的基本原则
3、N,C端的肽段比中间的肽段更好
4、避免蛋白内部重复或接近重复段的序列
5、避免同源性太强的肽段
6、交联可以交联在N，C两端，选择依据就是交联在对产生抗体不太重要的一端 7、序列中不能有太多的Pro,但有一两个Pro有好处，可以使肽链结构相对稳定一些，对产生特异性抗体有益。
二、抗原多肽设计的基本原则超低碳钢
为了使生产抗体获得最佳效果，仔细地设计抗原多肽是很有必要的，设计应满足一个基本条
件：在免疫过程中，该抗原既不会产生过强的免疫反应，同时又能产生出对感兴趣的蛋白有结合能力的抗体。尽管抗原设计是一个很复杂的课题，有诸多需要注意的细节，已超过了我们所能提供的范围，根据我们所积累的经验，有几点关键的基本设计原则可以提供给大家参考：
1、确定抗体的用途（应用）新开展一个研究项目，弄清楚所感兴趣的蛋白的一些基本特性是很有必要的，特别是如果知道蛋白的结构会对选择抗体易于接触和识别的识别区域有很大的帮助。然而，在没有这样精确的结构信息（多数是这种情况）的情况下，了解研究的用途（应用）会影响多肽设计的策略。例如：如果研究重点是集中在蛋白的不同区域，如C端或N端，或在一种特定状态下的蛋白，如磷酸化等，那么按照所需序列设计的多肽和产生的相应的抗体在应用上应该没有太大的困难，然而，蛋白的构象将影响抗体与其识别区域之间的相互作用。这种情况下可能存在的问题是如果在折叠的蛋白中，该识别区域被藏在蛋白的内部，抗体将无法接触到该区域。（无法产生相互作用）。 2、识别区域的选择原则一般说来最理想的抗原性识别区域应具备亲水、位于蛋白表面和结构上易变形性等特点。因为在大多数的天然（自然）环境中，亲水区域倾向于集中在蛋白
表面，而疏水区域常常被包裹在蛋白内部，同样道理，抗体只能与在蛋白表面发现的识别区域相互作用，而当这些识别区域有足够的结构易变形性而转移到抗体可接触的位置时，将会与抗体间有很高的亲和性。
3、连续的与不连续的识别区域连续的区域是指由连续的氨基酸序列（残基）构成的识别区域。大多数抗体是针对连续识别区域的，抗体能与这类区域以很高的亲和力相结合表明这段序列不在蛋白内部。不连续的识别区域是代表有一定折叠的一段多肽序列，或是将两段分离开的多肽连在一起的抗体的识别区域。在某些情况下，针对这样不连续识别区域的抗体也能产生，只是用来免疫的抗原多肽必须具备与该不连续识别区域相似的二级结构，而序列的长度需要符合相关的要求。
4、基本建议为了避免识别区域隐藏在蛋白内部的风险，我们通常建议选择蛋白的N，C两端来产生的相应的抗体。因为在完整的蛋白中，N，C两端通常是暴露在蛋白表面的。然而，一定要注意膜蛋白的C端疏水性太强，不适合作为抗原。
5、序列的长度通常我们建议抗原多肽的序列长度在8-20个氨基酸残基之间，如果太短，就有多肽太特殊、所产生的抗体与天然蛋白之间的亲和力（结合能力）不够强的风险，同样，
如果序列长度超过20，将有可能引入二级结构，所产生的抗体失去特异性的可能，而且肽链越长，通常合成难度增大，不易获得高纯度的产品。
6、载体蛋白交联的选择
基本原则：将载体蛋白加在远离抗体识别区域的一端，在序列中没有Cys的情况下在N或C端加上Cys为交联的首选方法。
7、常用分析软件 MacVecfor TM ;DNA star TM;PC-Gene TM
多肽合成的常见问题（一）
问：多肽的两端应如何处理？是保持自由状态还是屏蔽起来？
答：多肽是用来模拟蛋白的，为了模仿蛋白的表现，我们需要合成与蛋白有相似的结构和电荷的多肽。当一条肽段从一个蛋白中“切出”之后，两端的电荷数将与基因体蛋白有差异。我们需要改变合成策略来使他们一致。 总体而言： 如果是出自蛋白C端的序列，通过乙酰化将N端屏蔽； 如果是出自蛋白N端的序列，通过酰胺化将C端屏蔽； 如果是出自蛋白中间部分，用乙酰化和酰胺化将两端都屏蔽。
多肽修饰
多肽合成的常见问题（二）
问：如果我的肽纯度是95%，那么，其余的5%都是些什么物质？ rgd-208
答：多肽的纯度通常是通过HPLC，用每分钟1%的标准乙晴梯度来检测决定的。合成过程中，氨基酸之间的交联效率不是总能达到100%，因而产生一系列的氨基酸缺失的杂质。大多数这样的氨基酸缺失的杂质在纯化过程中都被去掉了，但有少数的杂质其谱表现与目标多肽很相近。这些氨基酸缺失的杂质肽留在了多肽样品中就构成了余下的几个百分
多肽合成的常见问题（三）
问：如何重新溶解多肽？
答：多肽的溶解与多肽的序列相关，首先试蒸馏水和超声（1-10MG/ML），如果不溶，计算肽中的碱性残基（Lys,Arg,His和自由氨基端）和酸性残基（Gly,Asp和自由羧基端）的数目。如果碱性基团偏多，可以滴加1N的醋酸，直到溶解为止，如果酸性基团居多，滴加1N的氨水，直到溶解为止。如果在实验中需要用缓冲液，建议在多肽完全溶解之前不要加入盐，因为盐会使肽的溶解度降低。如果上述溶液中肽都不溶，可以试试用少量有机溶剂如
DMSO，乙晴或DMF。
多肽合成的常见问题（四）
问：什么是多肽的净含量，它的意义是什么？
答：干品多肽的重量中不仅仅包含多肽，还包含有一些非肽的组份，如水，被吸收的溶剂、配位离子和盐等。肽的净含量是指肽在其中的重量百分比，这个百分比的数值范围很大，可能从50%到90%，取决于纯度、序列以及合成和纯化的方法，不要将肽的净含量和肽的纯度混为一谈，它们是完全不同的两个概念。纯度通常是由HPLC决定的。纯度定义的是多肽样品中含正确序列的组分的百分比，而肽的净含量是指样品中肽类物质相对于非肽类物质所占的百分比，肽的净含量通常是用氨基酸组分分析或紫外分光法测定的。这个信息主要是在一些对肽的浓度很敏感的实验中，对计算肽的浓度是很重要的。
多肽合成的常见问题（五）
问：对不同的实验，如何选择肽的纯度？
答：肽的纯度是很重要的指标，纯度的选择取决于实验的目的。对不太灵敏的筛选实验，建议使用粗品或>75%，对免疫级别，建议选用>85%。对于受体与LIGAND相互作用的研究，生物ASSAY研究，或细胞水平的研究，建议>95%，对于结构研究，建议>98%。
双模单待多肽合成的常见问题（六）
问：如何保存多肽？
答：在可能的情况下，应该尽量将多肽以冻干粉的形式在-20℃下保存，这样会在几年内避免细菌的降解，二级结构的形成、氧化或其他修饰的发生。多肽在溶液中的稳定性要差一些，所以强烈建议使用灭菌水或灭菌过滤的方式进行溶解，如果序列中有Cys,Met或Trp等残基，用无氧的溶剂进行溶解以避免氧化。使用冷冻的溶液时，建议将溶液进行分装，以避免多次的溶解和冷冻对多肽造成的损害。pH的推荐范围是3-6之间。使用前应保证包装容器和所装物品回温到室温，以避免吸水。多肽溶液最好即配即用，使用过程中将肽溶液保持在低温但不结冻的状态下。长期保存（3个月到5年）：冻干粉，在-20℃下冷冻干燥保存；中期保存（0-3个月）：-20℃冷冻液体或冻干粉冷藏；短期保存（<1周）：冷藏的液体或冻干粉。
多肽合成的常见问题（七）
问：你们用什么方法生产多肽？
答：线性多肽肽链的延伸采用Fmoc固相合成法，由C端到N端逐步依次将氨基酸连接上。开始，将第一个氨基酸通过一段对酸敏感的连接物连接在不溶性的支撑物树脂上。用六氢吡啶将Fmoc保护基去掉后，第二个Fmoc保护的氨基酸被连接了上去，连接方法有预活化或“一锅煮”等。目标序列连接完毕后，用TFA将肽链从树脂上洗脱得到粗品。
载体蛋白交联的相关问题（一）
问：为什么需要将多肽与载体蛋白交联？
答：对在动物体内产生免疫反应而言，大多数多肽的分子量都太小。将多肽与载体蛋白如KLH等交联之后，不仅能增加抗原的大小，也能增强免疫性。我们可以提供与KLH和BSA两种蛋白的交联。大多数客户选择与KLH交联，因为KLH的免疫性更好，而且BSA在很多实验中作为Blocking试剂，由于动物体内既会产生对多肽的抗体也会产生对载体蛋白的抗体，这样会出现假阳性。
载体蛋白交联的相关问题（二）
问：为什么要使用抗体？
答：由于抗体与很多生物分子，以蛋白和多肽等尤为著称，有很强的结合能力，抗体在生物医学研究中占据独特的重要地位，在对蛋白的特性、含量的测定、分布情况的分析和蛋白的确证等方面都需要用到抗体。例如：诊断试剂盒类似于怀孕检查等、蛋白microalloy，immunohistochemistry 和普通的ELISA实验等。由于抗体有对特定分子很强的结合能力的特点，用抗体进行体内成了许多努力的方向。成功的范例包括Genetech的Herceptin,用于一类特殊的乳腺癌和IDEC药业公司的Ritaxan，用于特定类型的Mon-Hodgkin’s Lymphomas B-细胞。
酒窖恒温恒湿
载体蛋白交联的相关问题（三）
问：什么是抗原和识别区域？
答：大多数情况下，antigen和immunogen两个字是可以互换使用的，他们的差别是很小的。他们是分别指一个分子与免疫系统之间的两种类型的相互作用。一个immunogen是指
能使一个生物组织的免疫系统产生免疫反应的分子，而一个antigen是指能与这种免疫反应的产物结合的分子，所以immunogen一定是antigen，但antigen不一定是immunogen，我们这里通用antigen，特指能与免疫反应的产物—抗体结合的分子。识别区域（epitopes）是指一个抗原分子中一个与抗体直接结合的一段特定的序列，对于任何抗原，（抗原蛋白），很有可能有多个抗体识别区域，对生产抗体而言，易于抗体识别的部位的识别区域最为理想。
载体蛋白交联的相关问题（四）
问：对抗原多肽什么样的肽链长度比较合适？
答：通常建议10-15个残基。肽链越长，抗体识别的区域越多，但也就越多机会形成稳定的二级结构。就不再是天然的形式了。太短的肽通常是没有用的，除非有充足的理由，如与相关家族蛋白或其他蛋白有序列同源性等。
载体蛋白交联的相关问题（五）
问：你们通常用什么化学方法进行KLH交联？
发动机油封答：我们用MBS活化KLH，这样能将载体蛋白（KLH）上面的自由-SH与多肽末端的Cys的侧链-SH连接起来，这种方法直接，特异性高，而且稳定，通常选择对免疫不重要的一端进行交联。 EDC活化载体上的-COOH，将载体的-COOH和多肽的-NH2连接起来也是一种可行的方法。但我们只建议在多肽序列中有多个Cys时采用该方法。但如果肽链中含有多个-COOH或-NH2基因，不建议使用该方法，因为会造成多重点交联的情况，使多肽结构受影响。常用载体蛋白除KLH外，还有BSA，Ovalbumin等，造成KLH的优势是它不干扰ELISA或Western Blot等实验。
载体蛋白交联的相关问题（六）
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