丁献荣;提高兰;杨琳;汪庆旗;蒋涛
【摘 要】胞苷酸样品中的虫草素、尿苷和腺苷用纯水经水浴80℃/30 min提取,采用CALESIL ODS-100 C18柱(5μm,4.6×250 mm),在流动相为10 mmol/L KH2PO3缓冲液(pH=6.0):甲醇=85:15的谱条件下分离,紫外260nm下检测.结果显示,虫草素、尿苷和腺苷的检测限分别为0.02 μg/mL、0.01μg/mL和0.01μg/mL(以进样浓度计);方法的相对标准偏差分别为1.8%、0.68%和0.10%;方法的加标回收率分别为96.7%、96.4%和99.4%.实验所建立的方法简便、快速、结果准确、可靠,能应用于虫草制品中虫草素、尿苷和腺苷含量的测定.
【期刊名称】《食品与发酵工业》
【年(卷),期】2010(036)009
【总页数】5页(P143-147)
【关键词】HPLC;保健食品;虫草素;尿苷;腺苷
【作 者】丁献荣;提高兰;杨琳;汪庆旗;蒋涛
【作者单位】mpo3浙江公正检验中心有限公司,浙江,杭州,310009;浙江公正检验中心有限公司浙中分公司,浙江,义乌,322000;浙江公正检验中心有限公司浙中分公司,浙江,义乌,322000;浙江公正检验中心有限公司,浙江,杭州,310009;浙江公正检验中心有限公司,浙江,杭州,310009;浙江公正检验中心有限公司,浙江,杭州,310009;浙江公正检验中心有限公司浙中分公司,浙江,义乌,322000
【正文语种】绕线电阻中 文
虫草是一类具有显著医疗保健功能的药用真菌,与人参、鹿茸齐名。虫草性味甘温,其功效为补肺益肾、化痰、平喘,主治久咳、虚喘、劳咳咯血、阳痿、遗精、腰膝酸软等病症,具有提高免疫力、抗疲劳、延长寿命、抑制肿瘤等功效[1]。冬虫夏草是一种昆虫和真菌的混合体,寄身的真菌是冬虫夏草菌,被寄身的虫体是虫草蝙蝠蛾的幼虫;它含有虫草素、虫草多糖、麦角甾醇、腺苷、氨基酸、维生素等多种营养成分,其中虫草素和腺苷是重要的活性成分。由于天然的冬虫夏草生态环境特殊,生长缓慢,资源稀少,产量低,加之人们使用量不断增加,使虫草身价倍增,价格非常昂贵,为此许多科学工作者对虫草的人工培育及其产业化进行了探索[1-
2]。据文献报道,人工虫草和天然虫草的化学成分和药理作用相似[3]。目前人工培育的虫草主要为蛹虫草,又名北虫草、北冬虫夏草,是冬虫夏草的近缘体,也是虫草重要活性成分——腺苷、虫草素的主要产生菌[4]。
腺苷(Adenosine),全称腺嘌呤核苷,分子式为C10H13N5O4,分子量为267,腺苷具有参与人体代谢和生理调节的功能,它除了存在于虫草等生物体中,还广泛存在于动物的肝脏中[5]。虫草素(Cordycepin)(3,-脱氧腺苷)又称虫草菌素、蛹虫草菌素,其分子式为C10H13N5O3,分子量为251;它是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗生素,具有抗菌、消炎、抗氧化、抗肿瘤、调节人体内分泌等作用[6]。尿苷(Uridine)是生物体内广泛存在的一种核苷类物质,它的理化性质与虫草素和腺苷相近。近年来,市场上出现了许多以腺苷和虫草素为主要功能因子的保健品。目前,已有一些对腺苷和虫草素含量测定的报道[7-9]。保健食品中腺苷含量的测定国家标准方法[10],但虫草素的测定无国家标准方法,按腺苷的国家标准方法测定时,提取出来的样液颜较深,虫草素、尿苷和腺苷谱峰的峰形也较差。为此本研究改进了样品的提取方法,优化了谱分离条件,能同时测定虫草素、尿苷和腺苷的含量,所建立的方法简便、快速、结果准确、可靠。
地下水净化设备
Agilent 1200 series高效液相谱仪(高压二元泵,紫外检测器,自动进样器,柱温箱,Chemstation工作站);KS-300EI超声波清洗器;Waters Oisis HLB固相萃取柱(3 mL,200 mg);溶剂过滤器;0.45μm滤膜。KH2PO3、K2HPO4、乙醇、乙腈,均为分析纯;甲醇为谱纯;水为重蒸馏水。实验样品由检测站提供;尿苷、腺苷标准品为Sigma试剂,含量99%以上,虫草素标准品为Sigma试剂,含量98%以上。
准确称取1.60 mg虫草素标准品到10 mL容量瓶中,用水溶解并定容作为标准储备液(浓度为160μg/mL)。准确称取11.20 mg尿苷标准品于10 mL容量瓶,用水溶解并定容作为标准储备液(浓度为1120μg/mL)。准确称取10.00 mg腺苷标准品于10 mL容量瓶,用水溶解并定容作为标准储备液(浓度为1000μg/mL)。
分别吸取5 mL上述标准储备液到100 mL容量瓶中,用水定容配制成混标工作液。
谱柱:CALES IL ODS-100 C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm);检测器:紫外检测器,检测波长:260 nm;流动相:10 mmol/L KH2PO4缓冲液(pH=6.0)∶甲醇=85∶15;流速:0.8 mL/min;柱温:30℃;进样量:20μL。
取粉碎均匀的样品0.1～1.0 g(精确至0.001 g)于50 mL容量瓶中,加入约40 mL水,摇匀后放入80℃水浴锅浸泡30 min,取出后冷却至室温,再用水定容至刻度。先用漏斗粗滤,再用0.45μm微孔滤膜过滤,滤液供HPLC分析。
称取5 g(精确至0.01 g)左右样品,定容到50 mL,用0.45μm微孔滤膜过滤,滤液供HPLC分析。
rj45防水接头本研究以虫草菌粉为试验样品,采用V(甲醇)∶V(水)=3∶2、V(乙醇)∶V)(水)=3∶2、100%甲醇、100%乙醇及水等5种不同溶剂对其进行提取比较。结果表明,用100%乙醇提取虫草素、尿苷和腺苷的结果明显偏低;用100%甲醇提取的结果虽高但平行不是非常好,用V(甲醇)∶V(水)=3∶2、V(乙醇)∶V(水)=3∶2和水提取的结果均较理想;但用V(甲醇)∶V(水)=3∶2和V(乙醇)∶V(水)=3∶2提取的样液虫草素和腺苷谱峰的峰形较差,而用水提取的样液虫草素、尿苷和腺苷谱峰形较好;因此选择水作提取溶剂。
用水作为提取剂,分别采用了超声振荡(30 min)、水浴(80℃/30 min)和沸水回流(30 min)3种方法对虫草菌粉样品进行提取比较。结果表明,3种提取方法无明显差异;超声振荡需用专用仪器,沸水回流比较麻烦,水浴比较简单、方便,因此本文选择水浴(80℃/30 min)作为提取方法。
通过对虫草素、尿苷和腺苷的标准在190～360 nm波长范围内进行紫外吸收扫描,结果表明虫草素、尿苷和腺苷在200 nm和260 nm处有吸收峰,考虑到200 nm干扰较大,本法选用260 nm为检测波长。
2.2.2.1 KH2PO4缓冲液和甲醇配比的选择
本实验选用10 mmol/L KH2PO4缓冲液和甲醇体系作为流动相,分别采用25%甲醇、20%甲醇、15%甲醇、10%甲醇4种不同的流动相作比较。随着流动相体系中甲醇含量的降低,保留时间变慢,样品中标准谱峰与杂质峰的分离度不断改善,但峰形变差;当甲醇含量为15%时样品中腺苷、尿苷和虫草素能与杂峰完全分离,故选择V(10 mmol/L KH2PO4缓冲液)∶V(甲醇)=85∶15为流动相。
2.2.2.2 KH2PO4缓冲液pH值的选择
本实验以5种pH值,分别为3.0,4.0,5.0,6.0,7.0的缓冲液作流动相进行比较,结果当pH值为6.0时样品中虫草素、尿苷和腺苷与杂质峰的分离度最佳,因此选择6.0的pH值。
本实验结合虫草素、尿苷和腺苷谱峰的保留时间、与杂峰的分离度和柱压等因素,选用0.8
mL/min的流速。
pop油墨胞苷酸、尿苷酸、鸟苷酸、肌苷酸和腺苷酸等与虫草素和腺苷结构较相似的核苷酸类物质在本方法的谱条件下保留时间为分别为2.5、4.4、5.7、6.1和8.4 min,均不会对虫草素、尿苷和腺苷的测定造成干扰。
准确吸取一定量的储备液用水稀释至虫草素浓度分别为0.800、1.60、3.20、6.40、9.60、12.8、16.0、19.2、22.4μg/mL,尿苷浓度分别为5.60、11.2、22.4、44.8、67.2、89.6、112.0、134.4、156.8μg/mL,腺苷浓度分别为5.00、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0、120.0、140.0μg/mL的9种不同浓度系列的混标工作液。分别进样后,将浓度与面积的关系绘制成表标准曲线(图略),虫草素线性方程为Y=97.96X+1.040,尿苷线性方程为 Y=54.58X+9.161,腺苷线性方程为Y=92.02X+8.598,3种组分的线性相关系数均达到0.9999以上。
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