Mg2+ATPase活性测定

叶绿体膜上Mg2+-ATPase活性的测定

一．材料、仪器、药品

1. 材料：叶绿体悬浮液

2. 仪器：台式离心机、分光光度计。

3. 药品：20%三（TCA）id卡制作、Na2HPOVBTA-123、钼酸铵、硫酸（10mol/L）、硫酸亚铁、重蒸馏水、50mmol/L Tris-HCl pH8.8 ; 2.5mmol/L MgCl2 , 5mmol/L ATP，20mmol/L NaCl，0.33ml CH3OH 和含20μg叶绿素的叶绿体。

二．实验步骤：

1. 绘制无机磷标准曲线：

1 配制10%硫酸钼酸铵溶液：将10g钼酸铵基因测序仪溶解在100ml的硫酸（10N）中。

2 配制硫酸钼酸铵-硫酸亚铁溶液：称取5g硫酸亚铁，量取10ml硫酸钼酸铵溶液，加重蒸馏水至87.5ml，摇匀备用（现配现用）。

3 配制Na2智能营销客户管理系统HPO3溶液：取7个100ml容量瓶，分别配制浓度为0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06mol/L 的Na2HPO3溶液。

4 在7个试管中每管中加0.1ml20%的三（TCA）、0.3mlH2O 和0.1mlNa2HPO3溶液,使各试管中磷含量分别为0、1、2、3、4、5和6μmol。每管再加入2.5ml硫酸钼酸铵-硫酸亚铁溶液。

5 摇匀后在波长660nm处测定光密度（OD）值，并记录。以测定OD值为纵坐标和相应的无机磷浓度（μmol）为横坐标作图。

2. Mg二钼酸铵2+-ATPase活性测定

甲醇激活法：

①反应液的配制：反应液（含50mmol/L Tris-HCl , pH8.8 ; 2.5mmol/L MgCl2 , 5mmol/L ATP，20mmol/L NaCl，0.33ml CH3OH 和含20μg叶绿素的叶绿体金属化膜

②取1.0ml反应液，在37℃保温2min，加0.2ml20%的三（TCA）终止反应。

③离心后吸取0.5ml上清液，加2.5ml硫酸钼酸铵溶液，摇匀后在波长660nm处测定其OD值，依据OD值在标准曲线上查处所代表的无机磷含量，再按公式计算出酶的活性。用在37℃水浴保温前加TCA的作对照，酶活力以μmol Pi mg-1 chl h-1表示。

三．实验流程图

本文发布于:2024-09-21 22:02:20，感谢您对本站的认可！

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