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人乳头瘤病毒（HPV）基因分型检测标准操作规程1.目的：规范人乳头瘤病毒（HPV）反向点杂交（RDB）基因分型检测操作流程，保证检测结果的准确性。
大豆油墨3.职责:
3.1 文件编写：实验室技术员。
3.2 文件审核：实验室主管。
3.3 文件审批：实验室主任。
3.4 执行：PCR实验室所有工作人员。
4. 参考文献:
4.1《中山大学达安基因股份有限公司乙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒说明书》
4.2 中山大学达安基因股份有限公司核酸扩增荧光检测系统DA7600型使用说明书
5. 内容：
5.1 检测方法：PCR-反向斑点杂交法。
5.2 实验原理：选取人乳头瘤病毒（HPV）基因组保守序列为扩增靶序列，设计通用引物和特异型别探针（包括16种中高危型和3种低危型HPV），将RNA逆转录为cDNA后，利用生物素标记的通用引物对cDNA进行PCR 扩增，得到的产物与固定在膜上的特异型别探针按照碱基互补配对的原理杂交。若PCR产物和探针完全配对，则膜条上相应探针位置捕获到标有生物素的PCR产物，并和亲和素–辣根过氧化物酶偶联，再与四甲基联苯胺（TMB）反应呈现较强的深蓝，若与探针不完全配对，则经严格杂交和洗涤后膜条上相应探针位置不能捕获到标有生物素的PCR产物，结果无显反应或显很淡的背景。
5.3 标本采集：由合作单位按照以下要求进行采集。 5.3.1 标本类型：尿道分泌物、宫颈脱落细胞、疣体细胞等。
5.3.2 标本采集：
5.3.2.1 道分泌物：在无菌条件下，用棉拭子伸入尿道内，旋转数周并停留片刻后取出。
5.3.2.2 宫颈脱落细胞：在无菌条件下，用宫颈刷伸入宫颈管内2cm，旋转数周并停留片刻后取出。
5.3.2.3 疣体细胞: 用无菌棉拭子在疣体部位刮取上皮细胞。
5.3.3 标本保存：采集的标本置于盛有1ml生理盐水的小试管中，2～8℃保存。
5.3.4 运送条件：标本长途运送时采用冰壶。
5.3.5 标本拒收标准：污染标本。
5.4 设备和试剂:
5.4.1 设备：DA7600荧光定量PCR仪、低速水平离心机、生物安全柜、台式高速离心机、移液器、混匀器、恒温水浴箱/干式恒温器、冰箱（4℃、-20℃）、移动/固定紫外灯、冷冻离心机。
5.4.2 试剂：
滑动门技术5.5.2.1 试剂品牌：《中山大学达安基因股份有限公司人乳头瘤病毒（HPV）反向点杂交（RDB）基因分型试剂盒》
鸡笼的做法5.5.2.2 试剂批准文号：国药准字 3401298。
互助系统5.5.2.3 试剂组成： DNA 提取液（500μL/管）1 管；HPV PCR反应管，单管单人份10管，HPV 阳性
质控品(HPV16型)（50μL/管）1管，阴性质控品（50μL/管）1管，杂交液Ⅰ浓缩液（50ml/瓶）1瓶，杂交液Ⅱ浓缩液（30ml/瓶）1瓶，溶液Ⅰ（100μL/管）1管，溶液Ⅱ浓缩液（25ml/瓶）1瓶，溶液Ⅲ（1ml/管）2管，溶液Ⅳ（100μL/管）1管，杂交膜条（10人份/袋）1袋。
5.5.2.4 试剂包装规格：单管单人份，10人份/盒。
5.5.2.5 试剂保存和有效期：保存于-20℃；有效期6个月。
5.6 质控程序：
5.6.1 质控品：
5.6.1.1 质控品品牌：随试剂盒，由厂家提供。
5.6.1.2 保存条件：置于-20℃冰箱中保存，也可以保存于-70℃，应避免反复冻融。
5.6.1.3 保存期限：保存于-20℃，保存期为1个月；保存于-70℃，保存期为2年。
5.6.2 质控频率：每天一次。
对甲苯磺酸吡啶盐5.6.3 质控操作步骤：与临床标本同步处理。
5.6.4 质控结果分析：
5.6.4.1 显反应控制点：应显为边缘清晰的蓝圆点, 则杂交过程正常。否则需要重新检查杂交过程。
5.6.4.2 IC位点：应显为边缘清晰的蓝圆点, 表示DNA抽提和PCR过程正常。不显或显强度很弱表示DNA抽提或PCR过程不成功，或未采集到宫颈或疣体脱落细胞，该样品应重复实验或重新采样。
5.6.4.3 阳性质控品：杂交膜条上除显反应控制点和IC位点外, 只有HPV16分型位点显为边缘清晰的蓝圆点。其它位点不显。
5.6.4.4 阴性质控品：除显反应控制点和IC位点外，其他位点不显。
5.6.4.5 以上各项需同时满足，否则全部试验应重新进行。
5.7 操作过程：
5.7.1 标本与质控品的处理：
5.7.1.1 打开或恒温水浴箱或干式恒温器，设定温度100℃。
5.7.1.2 从试剂盒中取出DNA提取液、阴性质控品和阳性质控品，让其在室温下完全融化。
5.7.1.3 样本的处理：转动宫颈刷或棉拭子，将宫颈刷或棉拭子上的细胞洗脱于1ml生理盐水中，洗脱液转至1.5ml 离心管中,12,000rpm离心5min。弃上清，加50μL DNA提取液打匀 (提取液内含不溶于水的物质，取样时需用加样器充分混匀后吸取。如出现因吸头嘴部太细不能吸取或取样后堵塞吸头的现象，可先用洁净无污染的剪刀将吸头嘴部剪去一截)。100℃保温10±1min。12,000 rpm离心5min,4℃待用。
5.7.1.4 阴、阳性质控品的处理：分别取阳性质控品及阴性质控品各50μL，加等量DNA提取液打匀。100℃保温10±1min。
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