我做的组织为肾，切片后开始我放到70c烤三个小时，出现严重脱片，于是我又在同样的温度加烤3小时，但仍有拖片，不知各位同道是否也遇到同样问题，有什么好建议请告诉我。 另照相怎样才能得到好的效果？我的片在显微镜下看挺好的，可照的相黄黄的，我胶卷是400的，是否暴光过度，或不足？
另照相怎样才能得到好的效果？我的片在显微镜下看挺好的，可照的相黄黄的，我胶卷是400的，是否暴光过度，或不足？
不知道你用的什么显微镜，如果照出来的相片是黄的，可能是显微镜光源的原因，你可以在光源上加张滤光片就可以了，同时光源强度适当加大点
我做的组织为肾，切片后开始我放到70c烤三个小时，出现严重脱片，于是我又在同样的温度加烤3小时，但仍有拖片，不知各位同道是否也遇到同样问题，有什么好建议请告诉我。
另照相怎样才能得到好的效果？我的片在显微镜下看挺好的，可照的相黄黄的，我胶卷是400的，是否暴光过度，或不足？
1.组织切片的烘烤温度应该是60摄氏度温箱内烘干1~3小时，而不是70摄氏度。一般最多烤3个小时，而不是越多越好。否则会影响免疫组化结果。
2.免疫组化容易出现脱片问题是因为用了未经处理的普通玻片，常规解决办法是用铬矾明胶处理玻片，或者用APES处理的玻片后再捞片。如果用处理过的玻片还有脱片现象，那么要检查一下你所用的液体、振洗方法以及抗原修复方法是否合理。
3.关于照相问题，首先你要明白什么是ISO400。这个是表示胶片的感光度，值越高表明它对光的灵敏度越高，所以这种高灵敏度的胶片也称为“快片”。不是任何情况下都适用快片的，选择快片的条件如下：
排线焊接
（1）光照条件不足；
表贴式永磁同步电机（2）相机光圈低；
（3）高速运动的物体。
我们显微成相不存在上述问题，所以没有必要选择高曝光量值的胶卷。另外，快片的价格高，而且它的颗粒度要粗很多，致使底片的细腻程度差，得不到细腻的效果。
明白了胶片的选择，那就要注意照相条件了。一般OLYMPUS、LEICA等显微摄影器材都有电脑控制曝光量，不存在曝光不足或曝光过量的问题，但你首先要把灯光亮度调至有一个照相标志的地方（一般光亮度表示灯占满一半）。或者将灯光打至最大值。
最后是冲洗相片。一般的冲洗店都没有给显微照片冲洗的经验，因此，用生活相片冲洗标准来给我们的相片冲洗，往往得不到满意的相片。建议你去一个有冲洗这种相片经验的店里冲洗，或者一张自己比较满意的相片拿给店家，使之比照着冲洗。店家的经验也会随着你的到来而得到更加的丰富的。：）
jbluming wrote:正弦波发生器
我想问那应该选200的还是100的胶卷呢？的确冲洗相片也很重要。
关于组织脱片问题，我用的已是防脱玻片，我问了我们的一些老师他们多认为是烤片时间不足，我真有点疑惑
其实ISO100的和200的胶片差别不是很大的。如果你觉得灯光亮度不是很强的话，ISO200的也可以。我通常用ISO100的胶片，在OLYMPUS显微成象系统下拍摄相片，然后去一家非常熟悉此类相片冲洗的店内冲洗。效果比别的同学的好的多。
巧克力工艺品
关于组织脱片问题，烤片在60摄氏度下1～3个小时是技术规范中的规定，时间不可以再长了。你的防脱玻片是自己制备的么？要注意制备的是否合格。再就是灭活内源性过氧化物酶的一步中，过氧化氢的浓度不可以太大，否则容易起气泡，引起脱片。还有可能就是抗原修复的过程引起脱片（如微波温度过高），或振洗过程（剧烈震荡）引起脱片。如果这些都不存在问题，那我觉得应该不会有脱片了。能力有限，希望我能够想到的对你能有所帮助。
请各位老师指点：
我的标本是大鼠眼球，做视网膜免疫组化，要求进行抗原热修复，我按照说明书要求－－－将切片浸入0.01m枸橼酸盐缓冲液（PH
双人雨披6.0），微波炉加热至沸腾后断电，间隔5-10分钟后，反复1-2次，冷却后PBS洗涤－－－做了一遍，发现容易掉片，后来经人指点改进了实验方法，在二甲苯透明后浸入0.5％火棉胶（据说可以防脱）然后进行水化，热修复，并且看见快沸腾时就停止加热了，不幸的是这次片子掉得更彻底了。
疑点：1.玻片上防脱处理是否得当？我的片子不是自己涂的多聚赖氨酸，做切片那里提供的，他说涂过美国的一种进口胶。。。。
2.在热修复前我用显微镜观察过视网膜，结构还是比较完整的，第一次修复后有一些片子掉了，一些结构不完整了，第二次是随着后来涂上去的火棉胶干干净净的全掉了，那么火棉胶看来是不能用的？
3.究竟该如何进行抗原热修复呢，应该注意些什么呢？
望各位师兄师，老师指点！掉片了就没法进行实验啊.......
冰凉一下wrote:
1.玻片上防脱处理是否得当？
2.火棉胶看来是不能用的？
3.究竟该如何进行抗原热修复呢，应该注意些什么呢？
一、眼球包埋切片
>制作眼球切片，当以火棉胶包埋法为佳，但做活检常规检查时，用火棉胶包埋法不
但费时甚久，而且切片过厚（10um），不能做细菌或其它特殊染。因此不能满足某些需要。若以普通之石蜡包埋切片，则眼球经二甲苯及浸蜡等处理，收缩过甚，而使视网膜有折卷脱位现象，切片亦破碎不整，各层次之间的联系紊乱。为防备此弊端起见，无论行火棉胶或是石蜡包埋，在开始固定时即非常注意。固定整个眼球，先在眼球旁开一个小窗，以Bouin 液固定2～4天，火棉胶包埋则需要10
％福尔马林固定。脱水应该从50％酒精开始，更换脱水剂时，避免直接用液体冲击眼球，最好先将眼球取出，待溶液入瓶后，再轻轻将眼球放入瓶内。
二、石蜡包埋切片法：
1.整个眼球以Bouin液固定2～4d。
2.50％酒精24h，切开眼球继续脱水。
3.60％～95％各级酒精脱水各12h。
4.纯酒精12h（更换一次）。
5.香柏油透明4～6h。
6.再以二甲苯透明2h。
7.二甲苯及56摄氏度软蜡等量混合液浸入30min。
8.浸56摄氏度石蜡2h，再浸58～60摄氏度石蜡1h。
9.常规包埋，制片。
经过以上处理的眼球，如果刀片锋利，可得到较满意的完整的6～8um切片。
三、火棉胶包埋法
celloidin包埋常用于大块组织的包埋，可避免纤维组织和肌肉组织的过渡硬化，减少纤维组织的收缩和扭转，利于保持原有组织结构，相对较费时，切片较厚，价格也较贵。一般过程如下：
发热涂料
1. 组织块经过固定（时间根据组织类型确定，眼球一般固定12～24h，气温低时适当延长）水洗后入50％和60％酒精各6～12h。
2. 70％、80％和90％酒精各6～24h。
3. 95％和100％酒精各12～24h。
4. 乙醚和100％酒精等量混合液24h。
5.2％火棉胶液（2g火棉胶，50ml乙醚，50ml纯酒精）24～48h。
6. 4％火棉胶液（4g火棉胶，50ml乙醚，50ml纯酒精）24h至数周。
7. 8％火棉胶液（8g火棉胶，50ml乙醚，50ml纯酒精）24h至数周，使其浸透饱和。
8.16％火棉胶液（16g火棉胶，50ml乙醚，50ml纯酒精）一周。
9.用足量16％或30％火棉胶液倒入平底玻璃器皿，组织平放，埋于其中，用盖遮挡并略留出缝隙，使其缓慢蒸发，用手指轻压火棉胶不出现指纹时硬度即可。注意挥发过快胶内会产生气泡。
10.倒入2倍氯仿使其硬化12～24h。
11.修去组织周围多余的火棉胶，浸入浓度为80％的酒精中硬化6h。
12.将胶块底面和木快同时浸入乙醚、酒精混合液，稍溶后，加少许胶，使胶块和木快粘合，待乙醚、酒精挥发后放入浓度为80％的酒精液中使其硬化，即可切片，包埋好后的组织块可存放人浓度为70％的酒精液内。
火棉胶切片法：刀片锋利，一般切片厚度大于或等于10um，切好的胶片应先放在浓度为70％或80％的酒精液中，而不立即贴在载玻片上，余下的胶块也应保存在浓度为70％的酒精液中，防止火棉胶继续挥发影响硬度。
四、火棉胶切片粘片法：
1.蛋白甘油粘片法：
切片放在涂有薄层蛋白甘油的载玻片上，用滤纸吸干，加几滴丁香油，放置数分钟，用滤纸沾去丁香油，经95％酒精和蒸馏水冲洗，即可染。
2.明胶粘片法：
明胶4g溶于20ml冰醋酸，在65～70摄氏度水浴内加温荣华，加70％酒精70ml和5％铬矾水溶液1～2ml。将以上混合液滴在载玻片上，干燥后即形成一层明胶薄膜，遇水后明胶薄膜略有溶化，产生一定黏性，将切片贴附。
3.火棉胶粘片法：将切片从70％酒精转移到载玻片，展平后滤纸吸干，在切片上涂一层0.5％的火棉胶溶液，蒸馏水洗后染。
五、热修复
理论上关于抗原修复的问题仍未清楚，提高抗原-抗体阳性检测率的同时可以出现假阳性。
1.微波处理：在250ml塑料盒内加入200ml
buffer，在微波高档加温至96摄氏度左右（大约1～2min），将切片插入25片塑料架上，移入修复液中，微波4挡20min
96摄氏度左右，取出后自然冷却至室温。
2.水浴锅法：热水浴是一种传统的抗原修复方法，调节水温使标本达95摄氏度左右，将切片置于内含200ml
buffer的塑料盒内，温度平衡后开始计算时间20min，取出塑料盒后自然冷却至室温。
3.压力锅法：该法需要购置一个不锈钢压力锅，并在高压锅内加入一定量的buffer，开始在煤气灶上加温至煮沸，将切片插入切片架并置入锅内，盖上锅盖，不加阀，开始冒气时计算时间5min，关闭气阀，使之加压10min。压力锅置于流水槽中冲洗10min，冷却后取出切片，PBS洗。
这些也许对你的实验有所帮助。
我做的是胎儿大脑的组织，载玻片用铬钒明胶处理后效果挺好，热修复后没有出现掉片现象，大家可以试试。配方为：铬钒0．5g，明胶5g，双蒸水1000ml。配制步骤：以1000ml 水加入明胶5g一起加温（〈60℃），待完全溶解，再加入铬钒。处理玻片时溶液先预热，玻片完全进入溶液在60℃恒温箱内10分钟，取出烤干就能用了。整个过程温度不能超过70℃。
烤片时间已经足够了，温度太高时间太长反倒会因可能烤干组织而影响结果，我看还是玻片处理的问题。其实多聚赖氨酸处理又省又好，我感觉不错，我处理过很多都没有出现脱片的问题。
我们做精巢组织和脑组织，铬钒明胶处理后效果挺好，热修复后没有出现掉片现象，大家可以试试
。配方为：铬钒0．5g，明胶5g，双蒸水1000ml。配制步骤：以1000ml水加入明胶5g 一起加温（〈60℃），待完全溶解，再加入铬钒。平时冰箱4度保存。玻片一定要干净，首先去污粉洗净，铬酸泡24－48小时，捞出洗净，入盐酸酒精24小时，再95％酒精，然后稠布擦干，入铬钒明胶5－10分钟，然后40－60度考干。组织贴片后，一定要60－70度考的彻底的干，这样就不掉片了。
切片在56－60℃的恒温箱内烤片至少2小时才不至于脱片，亦可过夜，千万不可使温度过高，原因是高温干燥条件下可以加速组织切片中的抗原的氧化。脱片的原因你可以从以下方面考虑：1、切片是否过厚。2、脱水、浸蜡的处理是否适当。3、采用粘片剂。各个实验室采用的粘片剂不一。目前通用的是Sigma的多聚左旋赖氨酸。
建议你在做时，同时做一批H-E切片，但脱蜡做好和免疫组化的分开。如果H-E切片染不出满意的结果，免疫组化染也无从谈起，根本无法保证质量。
脱片的问题可能是温度过高，石蜡切片后，考片温度不宜超过60℃，视你包埋用的石蜡的熔点而定，另外，载波片一定要清洗干净，做免疫组化实验用的片子最好能用粘片剂处理一下，最常用的为多聚赖氨酸（比较贵，效果好）、APES（比较便宜，效果不如多聚赖氨酸好）。对于你提到的H2O2的使用浓度的问题，我们实验室的经验：石蜡切片最好用3％的，冰冻切片最好用0.3％。
我们想做微管蛋白的免疫荧光，但是片子上一直都不成功，想问大家一下如果要作石蜡切片的话，对于挂抗体有没有什么特殊要求？怎么处理？还有就是对于石蜡切片和冰冻切片那个更好一些啊？谢谢！
我们做免疫荧光都喜欢用石蜡切片，因为石蜡切片组织的位置恒定，相比之下冰冻切片就差一点了，尤其是做共聚焦时。石蜡切片对于抗体没有特殊要求，先看一下你的抗体说明书，看看它是不是也支持做石蜡。
石蜡切片的荧光组化和普通组化的是一样的，只是要注意以下几点（我们的体会，供参考）
一，一抗的作用时间和温度：（1），4度过夜，非特异性染少，背景比较浅淡，（2）37度2小时孵育，背景就比较深一点，
二，二抗作用时间，一般不超过一小时
三，加二抗的时候尽量在光线比较暗的地方。
因为孵育的时间太长、加二抗时光线太强都会加快荧光淬灭。
95%酒精固定细胞后，为什么细胞会变形，变大，觉得胞浆好象有分解现象。还有就是做鉴定DAB染后，细胞完全分裂，是不是和染液DAB有关，请指教
我做的是新生大鼠脑组织，脱片非常少，方法如下，供参考：玻片用餐具洗涤剂清洁后，清水洗10次，浓硫酸泡48h，清水洗10次，一蒸水洗5次，双蒸水洗3次，烤干后95％乙醇泡2h，绸布擦干，多聚赖氨酸泡5min。
"我做的组织为肾，切片后开始我放到70c烤三个小时，出现严重脱片，于是我又在同样的温度加烤3小时，但仍有拖片，不知各位同道是否也遇到同样问题，有什么好建议请告诉我"
我的一点建议：波片处理方法：
1、1%盐酸乙醇浸泡4小时后纱布擦干（用力单向）
2、涂多聚赖氨酸：在一张片上点一滴，再拿2张，一张在液滴蘸一点后两张面对面，
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