鸡新城疫血凝(HA)与血凝抑制(HI）抗体水平测定法
１.本次实验得目得与要求
掌握鸡新城疫血凝（ＨA)与血凝抑制（HI）抗体水平测定法,以便检查疫苗使用效果与制定合理免疫程序.
２.实验内容或原理
某些病毒(如新城疫病毒，禽流感病毒等）能够与动物得红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现象(HＡ）。这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异免疫血清所抑制，即为红细胞凝集抑制试验（HI)。 ３．需用得仪器或试剂等
动物 健康成鸡2-5只,被检鸡１5—2５只。
器材 高压灭菌器、滤纸、试管、试管架、离心机、离心管、三棱针、内径2mm聚乙烯塑料管100cm、酒精灯、石蜡、96孔V型微量凝集试验板、0．02５mm微量吸液器、微型振荡器、
微量移液器、脱脂棉等。
药剂（１)浓缩抗原;(２)生理盐水或磷酸缓冲盐水(PＢS)；(3）Alsｅver细胞保存液；(4)红细胞悬液;（5)待检血清
4。实验步骤
（１)发现与鉴定病毒：鸡新城疫与禽流感病毒分离后，这些病毒能凝集鸡得红细胞，又能被特异性得已知免疫血清抑制其凝集反应,即可鉴定此病毒。
(２）诊断病毒性疾病:如取同一发病得动物早期与恢复期血清进行红细胞凝集抑制实验,如抗体效价有4倍以上升高，即有诊断意义.
(3)免疫机体抗体效价得测定：
３、鸡新城疫(ND)得HA与HI
（1）试验准备
① 抗原：一般以鸡新城疫Ⅱ系或LaUｒａ系冻干苗作为已知抗原，进行试验。
② ０、7％细胞悬浮液：由鸡翅静脉或心脏采血,放入含有抗凝剂得灭菌试管(按每毫升血加入３、8%灭菌柠檬酸钠０、２毫升做抗凝剂)内，迅速混匀。如当时不用,可直接采血放入红细胞保存液内（保存液2份，血液1份）于4℃冰箱内可保存两周。
红细胞悬液得配制：将血液注入离心管中,经３0０0转／分钟，离心５－10分钟,用吸管吸去上清液与红细胞上层得白细胞薄膜，将沉淀得红细胞加稀释液(生理盐水）洗涤。再用离心机3000转/分钟离心５—1０分钟，弃上清,再加稀释液洗涤，如此反复洗涤三次,将最后一次离心后得红细胞泥,按0、7%得稀释度加入稀释液（0、7毫升红细胞泥加９9、3毫升稀释液）。
③ 被检血清：将被检鸡编号登记，用消毒过得干燥注射器采血,注入洁净干燥试管内(微量法可用孔径2—3毫米塑料管由翅静脉采血），在室温中静置或离心，待血清析出后使用。每只鸡应更换一个注射器,严禁交叉使用。
④ 稀释液:为灭菌得生理盐水.
⑤ 红细胞保存液得配制方法：葡萄糖２。05克,柠檬酸钠(SHOO)0.8０克，柠檬酸（2H２0）
0．055克,氯化钠0.42克，蒸馏水加至100毫升。过滤分装,高压灭菌10分钟,放4℃冰箱保存。
(2)红细胞凝集试验(HA) 主要就是测定病毒得红细胞凝集价，以确定红细胞凝集抑制试验所用病毒稀释倍数(抗原单位）。
鸡新城疫病毒得ＨA试验与HI试验现采用微量法，以u或v形微孔塑料板代替试管。
① 首先用移液器向每个孔加入稀释液一滴(0、０5毫升)。
② 用微量移液器取病毒抗原0、０5毫升,加入第一孔，反复抽动６次后，吸出0、０5毫升加入第二孔，在第二孔反复抽动6次后,吸出０、05毫升加入第三孔,如此连续稀释至第十一孔后吸出0、05毫升弃去。第12孔不加病毒液为红细胞空白对照。
判断：沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀,表明红细胞未被或不完全被病毒凝集;如果孔底得红细胞铺平孔底,凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集.
如上例:病毒液得HＡ效价以出现完全凝集得抗原最大稀释度为准.HI试验时,病毒抗原液为0、05毫升内须含4个凝集单位,则应将原病毒液作成64／４=1６倍得稀释液。
活动防盗窗孔号: 1 2 3 ４ 5 6 7 8 ９ １0 11 12 滴度： １：2 1：４ 1：8 1：１６ １:３２ 1：64 1：1２8 １：2５６ 1：５17 1：1０24 1：２０４8 对照 |
稀释液 25 25 25 2５ 2５ ２５ 25 25 25 ２5 25 25 抗原（病毒) 25 25 25 ２５ 2５ ２5 ２5 2５ ２5 25 2５ 红细胞悬液 2５ 25 ２５ 25 2５ 2５ 2５ 2５ 25 2５ ２5 ２５ |
作用时间与温度 轻轻振荡１-2mｉｎ 静置3０-60min |
结 果 +＋+ +＋+ +++ ++＋ +++ +++ ++ ﹣ ﹣ ﹣ ﹣ ﹣ 合成氨工艺流程 |
|
注意：＋++为完全凝集 ++为部分凝集 — 为不凝集
(3)红细胞凝集抑制试验（HＩ试验）：新城疫病毒凝集红细胞得作用，能被特异性抗体抑制，因此，可用HI试验(简称血凝抑制试验）测定鸡血清中得HI抗体效价(滴度），并可用标准血清,作新分离病毒得鉴定与未知病毒得诊断.
微量法:具体操作如下:
①用移液器向每孔加0、05毫升稀释液，十一孔加0、1毫升.
②用移液器吸取被检血清(或高免卵黄抗体)０、05毫升注入第一孔，抽放6次后，吸出0、０5毫升，注入第二孔,如此连续稀释至第１0孔，并从第十孔吸出0、05毫升弃去,血清稀释倍数依次为１:2～1０24,11孔与１2孔空白。
③ 每孔再加入已标定好得四单位病毒液0、05毫升,第十一孔为红细胞对照孔,不加病毒液。
④ 置振荡器上振荡１-2分钟,放18～2２℃静置20分钟。
⑤ 每孔再加入0、7％红细胞悬浮液0、05毫升，放振荡器上振荡l－2分钟，置1８-2２℃，
３0-60分后判定结果。
⑥ 第十一孔为红细胞对照孔，第十二孔作为抗原对照孔。
ＨI试验与结果
孔号 | 1 2 3 4 5 6 ７ 8 9 10 １1 １2 |
被检血清 稀释倍数 | 红细胞 抗原 1：２ 1：4 1：8 １:１6 １7-aca：32 1：64 1：1２8 1：2５6 1：5１2 １:1024 对照 对照 |
稀释液 被检血清 | 25 25 2５ 2５ ２５ 25 25 25 2５ 2５ ５0 25 ２5 ２５ ２５ 25 2５ 25 2５ ２5 ２5 ２５ 弃去 |
稀释液 标准阳性血清 | 2５ 25 ２５ ２5 2５ 2５ 25 ２5 ２5 25 50 ２5 2５ 25 25 25 25 25 25 2５ ２５ ２5 弃去 | 南瓜加工
4单位病毒 | ２５ 2５ 25 25 ２５ 25 25 ２5 2５ ２5 25 灵性锁 |
作用时间 与温度 | 振荡１—2min，静置20 mｉn |
红细胞悬液 | 25 25 2５ 2５ 25 25 25 ２5 2５ 25 ２５ 2５ |
作用时间 与温度 | 振荡1-２min,静置30-60 ｍiｎ |
结果1 | - — — — — - ++ ++＋ +＋+ +++ - +++ |
结果2 | — — - — — - — — — +++ — +++ |
| |
邬婧婧结果观察：将反应板倾斜成４5℃角,沉于管底得红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底得红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。
能将4单位病毒物质凝集红细胞得作用完全抑制得血清最高稀释倍数，称为该血清得红细胞凝集抑制效价，用被检血清得稀释倍数或以2为底得对数(ｌog2）表示.如上例，该血清得红细胞凝集抑制效价为1:64或HI效价为6（ｌog2）。第十一孔仅含稀释液与红细胞为不凝集对照孔,第十二孔含稀释液,病毒液与红细胞为凝集对照孔。
结果分析如下：
① 一般认为鸡得免疫临界水平为1：8(成年）或1：16（雏鸡)，但随地区不同而有差异。
② 鸡血清得ＨI抗体效价高于1：16时可适当推迟新城疫免疫得时间,ＨＩ抗体效价在１:16以下，须马上进行新城疫疫苗接种,在新城疫流行得地区或鸡场，鸡得免疫临界水平，应再提高。
③ 鸡得HI抗体水平就是以抽检样品得HI抗体效价(1og2)得平均值表示得。
如果某鸡得10份样品中,HI抗体效价为８得有３份样品，为7得有5份样品,为６得有２份样品,它们得平均值为：
平均水平在4（ｌog2），说明该鸡为免疫鸡。若在检样中HI抗体效价得最高值与最低值相差太大时，则不能用上法计算平均水平，应根据临界水平以下得样品数在全部样品中所占得百分比决定免疫与否.
④ 大型养鸡场,每次进行抽测时，抽样率一般不低于0、1%～０、5％,小型鸡，抽样率应有所增加，一般认为理想得抽样率应为２％。
⑤ 鸡接种新城疫疫苗后，经2～3周测血清中得HI抗体效价，若提高2个滴度以上，表示鸡得免疫应答良好,疫苗接种成功;若HI抗体效价无明显提高，表示免疫失败。
附注：
①采用HA试验对各生物药厂生产得新城疫疫苗产品有质量检测作用。
②采用HＩ试验对各厂家生产高免血清及卵黄抗体有质量检测作用.
实验二 兔有机磷中毒得诊断与
1、 本次实验得目得与要求
掌握有机磷中毒得诊断要点
熟悉有机磷中毒得简易检验方法。
了解有机磷中毒得解毒原理与措施。
２．实验内容或原理
１、阿托品（Aｔropinum）抗胆碱药
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