一种提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法与流程

1.本发明属于细胞工程领域，具体地说，涉及一种提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法。

背景技术：

2.嵌合抗原受体巨噬细胞（car-mac）疗法已经成为细胞免疫领域的一个重要的方向。该疗法是将从外周血来源的cd14阳性单核细胞诱导成巨噬细胞，并通过病毒的形式将外源基因导入巨噬细胞，生产car-mac。
3.目前，通过病毒转染方式生产嵌合抗原受体巨噬细胞（car-mac）主要有两种方式：慢病毒和腺病毒，这两种方式虽然都有一定的转染效率，但是由于巨噬细胞的特性，转染效率在20%以下。有部分研究人员通过改造腺病毒（ad5f35腺病毒）感染巨噬细胞，虽然提高了腺病毒转染巨噬细胞的效率，转染效率约为提50%左右，但是该种方法需要使用大量腺病毒，使得嵌合抗原受体巨噬细胞（car-mac）成本较高。虽然有其他研究人员也试图通过改造慢病毒，使用lv-vpx慢病毒转染巨噬细胞，但是转染效率依然不高，而且，慢病毒转染有随机整合的风险，存在造成巨噬细胞基因突变的风险。
4.综上可知，现有技术中，腺病毒转染巨噬细胞的方法，存在转染效率低，浪费材料，成本高的缺点。

技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明提供一种提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法，该方法适用于腺病毒转染外周血来源的巨噬细胞，转染效率高达90％以上，同时，该转染方法易操作，成本低。
6.为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法，包括如下步骤：s1、巨噬细胞培养：将pbmc复苏后通过cd14磁珠进行阳性分选出单核细胞，放入培养皿，添加25-100ng/ml gm-csf促进单核细胞分化为巨噬细胞，达到规定的细胞接种密度后，将其放入co2培养箱，培养24-72h；s2、巨噬细胞激活和极化：更换步骤s1中的巨噬细胞的培养基，向新培养基中添加25-100ng/ml ifn-γ和25-100ng/ml lps,激活极化巨噬细胞6-48h；s3、腺病毒转染巨噬细胞：向激活极化后的巨噬细胞中按照100-1000 moi加入腺病毒，转染24-172h，转染目的基因。
7.s4、转染后基因表达检测：将腺病毒转染后的巨噬细胞，消化处理，200-500g 离心2-10min，收集细胞，用流式检测目的基因的表达（car:嵌合抗原受体）。
8.进一步的技术方案，所述步骤s1中，细胞接种密度为0.5
×
106～4
×
106个/ml；所述co2培养箱的温度为35～38℃,co2浓度为3～7％。
9.进一步的技术方案，所述的ifn-γ的浓度为40-60ng/ml ，优选50ng/ml ；lps的浓
lps，激活和极化巨噬细胞8h。
21.s3、巨噬细胞腺病毒转染：将巨噬细胞激活和极化巨噬细胞8h后，换液培养基，加入ad5f35腺病毒(moi=300)，混匀共孵育，在37℃，5％的co2浓度的培养箱中培养。
22.s3、巨噬细胞收获：病毒转染24h后换液，并继续培养48h。用tryple select细胞消化液消化细胞,300g离心5min收获细胞，目的细胞用dpbs重悬，用于检测。
23.s4、转染后基因表达检测：收获后检测目的基因表达，检测巨噬细胞极化指标cd80、cd86、cd163、cd206；目的基因表达达到90%；巨噬细胞为m1型巨噬细胞表型。
24.实施例2 一种提高腺相关病毒转染效率的方法，包括如下步骤：s1、巨噬细胞培养：细胞复苏：取一支pbmc细胞，迅速将其放入37℃的水浴中速溶，加入到10ml x-vivo15培养基中混合均匀，于300g的条件下离心3min，去掉上清液，通过cd14磁珠进行阳性分选出单核细胞，加入10ml完全培养基重悬细胞，将重悬好的细胞接入细胞培养瓶中，放入co2细胞培养箱中，于37℃条件下静置培养；细胞分化培养：在细胞培养基中加入50ng/ml gm-csf，达到规定的细胞接种密度后，将其放入co2培养箱，进行分化培养48h。
25.s2、巨噬细胞激活和极化：巨噬细胞激活和极化培养基配制：在培养基中加入50ng/mlifn-γ和50ng/mllps，激活和极化巨噬细胞12-16h。
26.s3、巨噬细胞腺病毒转染：将巨噬细胞激活和极化巨噬细胞12-16h后，换液培养基，加入ad5f35腺病毒(moi=300)，混匀共孵育，在37℃，5％浓度的co2培养箱中培养。
27.s3、巨噬细胞收获：病毒转染24h后换液，并继续培养48h。用tryple select细胞消化液消化细胞,300g离心5min收获细胞，目的细胞用dpbs重悬，用于检测。
28.s4、转染后基因表达检测：收获后检测目的基因表达，检测巨噬细胞极化指标cd80、cd86、cd163、cd206；目的基因表达达到95%；巨噬细胞为m1型巨噬细胞表型。
29.实施例3 一种提高腺相关病毒转染效率的方法，包括如下步骤：s1、巨噬细胞培养：细胞复苏：取一支pbmc细胞，迅速将其放入37℃的水浴中速溶，加入到10ml x-vivo15培养基中混合均匀，于300g的条件下离心3min，去掉上清液，通过cd14磁珠进行阳性分选出单核细胞，加入10ml完全培养基重悬细胞，将重悬好的细胞接入细胞培养瓶中，放入co2细胞培养箱中，于37℃条件下静置培养；细胞分化培养：在细胞培养基中加入100ng/ml gm-csf，达到规定的细胞接种密度后，将其放入co2培养箱，进行分化培养72h。
30.s2、巨噬细胞激活和极化：巨噬细胞激活和极化培养基配制：在培养基中加入100ng/mlifn-γ和100ng/mllps，激活和极化巨噬细胞24h。
31.s3、巨噬细胞腺病毒转染：将巨噬细胞激活和极化巨噬细胞24h后，换液培养基，加入ad5f35腺病毒(moi=300)，混匀共孵育，在37℃，5％浓度的co2培养箱中培养。
32.s3、巨噬细胞收获：病毒转染24h后换液，并继续培养48h。用tryple select细胞消化液消化细胞,300g离心5min收获细胞，目的细胞用dpbs重悬，用于检测。
33.s4、转染后基因表达检测：收获后检测目的基因表达，检测巨噬细胞极化指标cd80、cd86、cd163、cd206；目的基因表达达到92%；巨噬细胞为m1型巨噬细胞表型。
34.针对上述实施例2以及对比例进一步研究，具体如下：1、目的基因car转染效率对比实验样品：携带目的基因car的腺病毒ad5f35转染效率和细胞活率检测：以实施例2的提高腺病毒转染巨噬细胞的方法，用moi=300感染目的细胞，然后利用流式细胞仪检测腺病毒的转染效率，用细胞计数仪检测细胞活率。
35.细胞形态检测：用显微镜观察实施例2中被激活和极化后的巨噬细胞。其他实验组：对比例1：转染方法与实施例2相同，与实施例2的区别在于，对比例1中的步骤s2细胞培养时，在培养基中未添加ifn-γ和lps。
36.对比例2：转染方法与实施例2相同，与实施例2的区别在于：对比例2中的步骤s2细胞培养时，在培养基中只添加50ng/mlifn-γ。
37.对比例3 ：转染方法与实施例2相同，与实施例2的区别在于：对比例3中的步骤s2细胞培养时，在培养基中只添加50ng/mllps。
38.转染效率和细胞活率的结果如下表1和图1所示，细胞形态检测结果如图2所示：表1不同实验组的转染效率和细胞活率实验组car表达细胞活率对比例140%95%对比例242%93%对比例343%90%实施例295%94%实验结果：由表1和图1可知，本发明同时使用ifn-γ+lps极化激活巨噬细胞后，将ad5f35-car腺病毒转染效率提高至95%左右，远高于对比例1中未添加ifn-γ+lps的。
39.同时，从对比例1-对比例3的数据可以看出，ifn-γ单一使用、lps单一使用与未添加ifn-γ+lps相比，数据相差不大，说明ifn-γ或lps单一使用对腺病毒转染无太大影响，但是从对比例2、对比例3、实施例3的数据可以看出， ifn-γ和lps组合使用的转染效率，远远高于ifn-γ单一使用、lps单一使用的转染效率，这说明，ifn-γ和lps组合使用会促进腺病毒转染巨噬细胞；本发明同时使用ifn-γ+lps极化激活巨噬细胞后，大幅度提高转染效率的同时，还使得细胞活率仍然保持较高水平，与对比例1中未添加ifn-γ+lps的细胞活率相比，相差不大。
40.从图2可以看出，ifn-γ单一使用、lps单一使用与未添加ifn-γ+lps相比，巨噬细胞都有一定程度的激活，部分巨噬细胞的体积增大；但是ifn-γ+lps组合使用，大大的激活的巨噬细胞，使得巨噬细胞被超活化，单个巨噬细胞体积上大大增加，具有较强的吞噬能力，这使得腺病毒转染巨噬细胞时，可以大大提高转染效率和外源基因的导入效率。
41.2、目的基因car和标记基因gfp同时转染效率对比实验样品：携带目的基因car和标记基因gfp的大片段基因的腺病毒ad5f35转染效率和细胞活率检测：以实施例2的提高腺病毒转染巨噬细胞的方法，用moi=300感染目的细胞，然后利用流式细胞仪检测腺病毒的转染效率，用细胞计数仪检测细胞活率。
42.对比例1：转染方法与实施例2相同，与实施例2的区别在于，对比例1中的步骤s2细胞培养时，在培养基中未添加ifn-γ和lps。
43.对比例2：转染方法与实施例2相同，与实施例2的区别在于：对比例2中的步骤s2细胞培养时，在培养基中只添加50ng/mlifn-γ。
44.对比例3 ：转染方法与实施例2相同，与实施例2的区别在于：对比例3中的步骤s2细胞培养时，在培养基中只添加50ng/mllps。
45.具体的实验结果见表2。
46.表2
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不同试验组的转染效率对比实验组car表达gfp表达细胞活率对比例125%25%96%对比例221%27%94%对比例323%22%93%实施例245%77%95%从上表中对比例1-对比例3的数据可以看出，ifn-γ单一使用、lps单一使用与未添加ifn-γ+lps相比，数据相差不大，有些还会降低转染效率，但是从对比例1、对比例2、对比例3、实施例3的数据可以看出， ifn-γ和lps组合使用的car表达和gfp表达转染效率，都是远远高于ifn-γ单一使用、lps单一使用、未添加ifn-γ+lps的转染效率，这说明，即使腺病毒携带多个目的基因，ifn-γ和lps组合使用也会促进腺病毒转染巨噬细胞；本发明同时使用ifn-γ+lps极化激活巨噬细胞后，大幅度提高转染效率的同时，还使得细胞活率仍然保持较高水平，与对比例1中未添加ifn-γ+lps的细胞活率相比，相差不大。
47.表2中car表达转染效率相较于表1中car表达转染效率有所下降，这是因为表2中的腺病毒同时携带目的基因car和标记基因gfp，同时携带两种基因，外源基因比较大，导致最终的car表达效率会比表1中的数据有所降低。但是，从表2中可以看到，实施例2的数据仍然比对比例1、对比例2、对比例3都要高。
48.3、细胞表型分析实验样品：携带目的基因car的腺病毒ad5f35实验方法：用流式方法检测实施例2的细胞表型，检测巨噬细胞极化指标cd80、cd86、cd163、cd206；其他实验组： control组：转染方法与实施例2相同，与实施例2的区别在于，control组中的步骤s2细胞培养时，在培养基中未添加ifn-γ和lps，步骤3中未添加腺病毒；ifn-γ+lps组：转染方法与实施例2相同，与实施例2的区别在于，步骤3中未添加腺病毒。
49.实验结果：巨噬细胞极化结果见图3。
50.由图3可知，本发明的方法不仅提高腺病毒转染巨噬细胞效率和目的基因的表达效率，显著提高了巨噬细胞m1型表型cd80和cd86；降低m2细胞表型cd163和cd206。

技术特征：

1.一种提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法，其特征在于，包括如下步骤：s1、巨噬细胞激活和极化：将外周血单核细胞pbmc分化为巨噬细胞；加入25-100ng/ml ifn-γ和25-100ng/ml lps,激活极化巨噬细胞6-48h；s2、腺病毒转染巨噬细胞：向激活极化后的巨噬细胞中按照100-1000 moi加入腺病毒，转染12-24h，转染目的基因。2.如权利要求1所述的提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法，其特征在于，所述步骤s1中，外周血单核细胞pbmc分化为巨噬细胞的具体方法为：将pbmc复苏后通过cd14磁珠进行阳性分选单核细胞，将分选后的单核细胞放入培养皿，添加25-100ng/ml gm-csf促进单核细胞分化为巨噬细胞，达到规定的细胞接种密度后，将其放入co2培养箱，培养24-72h。3.如权利要求2所述的提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法，其特征在于，细胞接种密度为0.5
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106～4
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106个/ml；所述co2培养箱的温度为35～38℃,co2浓度为3～7％。4.如权利要求1所述的提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法，其特征在于，所述的ifn-γ的浓度为40-60ng/ml ，lps的浓度为40-60ng/ml 。5.如权利要求4所述的提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法，其特征在于，所述的ifn-γ的浓度为50ng/ml，lps的浓度为50ng/ml。6.如权利要求1所述的提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法，其特征在于，还包括步骤s3、转染后基因表达检测：将步骤s2中获得的腺病毒转染后的巨噬细胞，消化处理，200-500g 离心2-10min，收集细胞，通过流式检测目的基因的表达car:嵌合抗原受体。7.如权利要求1所述的提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法，其特征在于，所述的步骤1中，激活活化后的巨噬细胞为m1型巨噬细胞。8.如权利要求1所述的提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法，其特征在于，所述的腺病毒为ad5f35腺病毒。9.如权利要求1所述的提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法，其特征在于，所述的步骤2中，转染目的基因后，可以换液，继续培养细胞一段时间。

技术总结

本发明公开了一种提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法，属于细胞工程领域。该方法包括如下步骤：将外周血单核细胞PBMC分化为巨噬细胞；加入25-100ng/ml IFN-γ和25-100ng/mlLPS,激活极化巨噬细胞6-48h；激活极化后，按照100-1000 MOI加入腺病毒，转染12-24h，转染目的基因。采用本发明的方法，转染效率高达90%以上，提高了巨噬细胞基因导入的成功率，而且，该方法操作简单，大大节约成本。大大节约成本。大大节约成本。