赵静; 王振国; 赵琳
【期刊名称】《《遵义医学院学报》》八角钢
【年(卷),期】2019(042)004
【总页数】6页(P406-411)
【关键词】吡格列酮; ZDF大鼠; 胰岛素抵抗; 脂肪分布
【作 者】赵静; 王振国; 赵琳
【作者单位】武警特医学中心内分泌与血液科 天津300162; 武警特医学中心医研部 天津300162; 上海市第四人民医院老年医学科 上海200080
【正文语种】中 文
【中图分类】R587.1
随着人们生活水平的提高，2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus, T2DM)已成为威胁人类健康的重要因素，而肥胖症是T2DM发病率增高的重要因素之一[1]。T2DM的主要病理机制是胰岛素抵抗，而脂肪组织是胰岛素作用的重要靶器官[2]。吡格列酮(Pioglitazone，PGZ)是一种过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome proliferator-activated receptor-γ, PPARγ)激活剂，可以提高脂肪组织、肝脏和骨骼肌等对胰岛素的敏感性，改善机体的胰岛素抵抗，广泛用于T2DM的[3]。本研究通过观察吡格列酮干预后Zucker糖尿病-肥胖(Zucker diabetic fatty，ZDF)大鼠及其对照组Zucker lean (ZL)大鼠胰岛素抵抗和脂肪分布变化，提高对吡格列酮T2DM的作用机理的认识。
1 材料与方法
1.1 实验动物及干预方法 5～6周龄ZDF大鼠和ZL大鼠各18只(动物为清洁级，购于北京维通利华实验动物有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0006)，体重(220±15 g)，分别随机分为ZDF-吡格列酮组(ZDFPGZ)、ZDF-生理盐水组(ZDFVE)、ZL-吡格列酮组(ZLPGZ)、ZL-生理盐水组(ZLVE)，每组各9只。所有大鼠均用高脂饲料喂养于SPF级动物实验室，每周测量动物的体重，取尾静脉血液监测血糖，空腹血糖超过7.0 mmol/L、ZDF组体重超过Z
L组平均体重的20%即为诱导糖尿病-肥胖模型成功。8周后将符合条件的ZDF和ZL大鼠用吡格列酮和生理盐水进行灌胃干预8周，剂量为10 mg/(kg·d)，生理盐水10 mL/(kg·d)。干预结束后麻醉处死动物，取腹主动脉血1 mL置于肝素抗凝管中；取大鼠肾周脂肪组织，一部分置于冻存管储存于-196℃的液氮中，另一部分置于4%的多聚甲醛溶液中固定，24 h后进行上机石蜡包埋。 沟槽三通1.2 主要试剂及仪器 无水葡萄糖，购自四川峨嵋山药业股份有限公司；诺和灵精蛋白生物合成人胰岛素注射液，购自江苏万邦生化医药股份有限公司；盐酸吡格列酮片，购自天北京太洋药业股份有限公司；大鼠胰岛素、胆固醇(Cholesterol, CHOL)、甘油三酯(Triglycerides, TG)和低密度脂蛋白(Low density Lipoprotein-cholesterol, LDL-C)ELISA试剂盒，购自美国RapidBio公司；RT-PCR转录试剂盒，购自瑞士Roche公司；ABI Prism 7300 型荧光定量PCR仪(Applied Biosystems 公司)；ECLIPSE 80i 荧光显微镜(日本尼康公司)。
1.3 大鼠血浆胰岛素、血脂水平检测及胰岛素抵抗评价 将大鼠抗凝血2 500×g离心10 min，分离出血浆，通过酶联免疫吸附测定技术(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)测
定大鼠血浆胰岛素、CHOL、TG和LDL-C浓度。通过建立稳态评估模型(Homeostasis model assessment, HOMA)计算胰岛素抵抗指数(HOMA of insulin resistance, HOMA-IR)，公式为[空腹胰岛素(mU/L)×空腹血糖(mmol/L)]/22.5[4]。
1.4 MRI扫描观察大鼠腹部脂肪分布 采用西门子Verio 3.0T磁共振仪器、大鼠专用线圈对大鼠腹部进行扫描和信号采集。应用异氟烷、氧气混合气体(异氟烷浓度1.5%～2%)对大鼠进行吸入麻醉，动物呈仰卧位。扫描序列为T2WI，参数：采用快速自旋回波序列进行采集，TR时间6 000 ms，TE时间74 ms;层厚1.5 mm；扫描野(FOV)120 mm×96 mm。在后处理工作站上测量大鼠内脏脂肪(Visceral adipose tissue, VAT)及皮下脂肪(Subcutaneous adipose tissue，SAT)面积，并计算VAT所占腹部脂肪比例，即[VAT面积 /(VAT+SAT) 面积×100%]。
1.5 HE染测量大鼠内脏脂肪细胞大小 取大鼠肾周脂肪蜡块置于切片机上切片，厚度为5 μm，将石蜡切片进行HE染，利用imageJ软件测量大鼠VAT脂肪细胞直径。
1.6 RT-qPCR检测大鼠内脏脂肪组织GLUT-4、PPAR-γ基因表达 将液氮中保存的大鼠肾周脂肪研磨至粉末，加入Trizol及等提取脂肪组织总mRNA，使用Roche逆转录试剂
盒，按照说明在GeneAmp2400 PCR仪中将mMRA逆转录为cDNA。配制SYBR Green Master(ROX)反应体系：SYBR Green Master(ROX)10 μL、cDNA模板2 μL、5 μmol/mL上游引物和下游引物各1 μL、Milli-Q超纯水补足至20 μL。用RT-qPCR方法检测大鼠脂肪组织葡萄糖转运蛋白-4(Glucose transporter-4，GLUT-4)、PPAR-γ基因表达水平，引物序列：β-actin，上游引物5’-AAT TAC TCC CTC TCC TA-3’，下游引物5’-ACT CAT CTA CTC CTC TTC T-3’；GLUT-4，上游引物5’-GACATTTGGCGGAGCCTAAC-3’，下游引物5’-TAACTCCAGCAGGGTGACACAG-3’；PPAR-γ，上游引物5’- CCAGAGTCTGCTG ATCTGCG -3’，下游引物5’- GCCACCTCTTTGCTCTGCTC -3’。反应条件为95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火1 min，共40个循环。将结果用ZLVE组标准化，用2-△△CT 方法计算目的基因表达水平。
太阳能沼气1.7 腹腔葡萄糖耐量试验(IPGTT)和胰岛素耐量试验(IPITT) 在处死动物前1周进行IPGTT和IPITT，用于评价大鼠胰岛素敏感性和胰岛素抵抗程度。IPGTT：扎刺大鼠尾静脉，用血糖试纸蘸取血液测量血糖基线值，然后腹腔注射20%的D-葡萄糖溶液(1g/kg体重)并开始记录时间，在30、60、90、120 min分别测量血糖值。IPITT：采血方法与IPGTT相同，测量基线血糖浓度后腹腔注射胰岛素工作液(0.1U/kg体重)并开始记录时间，在30、60、90、120
min分别测量血糖值。
1.8 统计学方法 用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料用均数±标准差 表示，体重、血糖、IPGTT及IPITT采用两因素方差分析进行比较，其他数据多组之间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Fisher最小显著性差异法(正态分布数据)或Kruskal-Wallis法(非正态分布数据)。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 体重和血糖 ZDF组大鼠在高脂喂养1周后较ZL组血糖明显升高(P<0.01)，并且ZDF组体重明显大于ZL组。除1只ZDFPGZ大鼠死亡，1只ZDFVE大鼠因体重达不到超过对照组平均体重的20%标准而诱导失败，余ZDF和ZL大鼠均符合模型要求。吡格列酮/生理盐水干预后，2周内ZDFPGZ组血糖下降至正常水平，ZDFVE组血糖持续升高;而ZDFPGZ组体重持续增加，ZDFVE组体重较ZDFPGZ组小(P<0.01，见图1A、B)。
玻璃胶配方与 ZDFVE组比较，a：P< 0.01； 与 ZL组(ZLVE和ZLPGZ组)比较，b：P< 0.01；与ZDFPGZ组比较，c：P< 0.01。图1 血糖和体重
焊锡炉
2.2 血浆胰岛素、血脂水平及HOMA-IR 造模成功后ZDF大鼠与ZL大鼠比较表现为明显的高脂血症和高胰岛素血症，ZDF大鼠TG、CHOL、胰岛素水平均明显高于ZL大鼠(P<0.01)，ZDF大鼠较ZL大鼠HOMA-IR明显增大(P<0.01)，表现为严重的胰岛素抵抗。吡格列酮干预后ZDFPGZ组大鼠TG、CHOL、LDL-C、胰岛素水平及HOMA-IR较ZDFVE组均明显降低(P<0.01)，差异有统计学意义，说明大鼠的高脂血症、高胰岛素血症及胰岛素抵抗明显改善(见表1)。
表1 血脂、胰岛素水平及
检测指标ZDFVEZDFPGZZLVEZLPGZFPTG (mmol/L)3.18±0.23b2.11±0.15a0.54±0.12c0.45±0.08c70.85<0.01CHOL (mmol/L)3.63±0.18b2.72±0.14a1.97±0.02c1.84±0.11c43.15<0.01LDL-C (mmol/L)0.62±0.04b0.40±0.03a0.44±0.010.46±0.056.81<0.01胰岛素(mU/L)5.33±0.35b3.12±0.3a3.04±0.263.08±0.1810.25<0.01HOMA-IR4.54±0.35b0.89±0.93a0.93±0.080.90±0.0595.28<0.01
与ZDFVE组，a：P< 0.01; 与ZL组(ZLVE和ZLPGZ组)比较，b：P< 0.01; 与 ZDFPGZ组比
较，c：P< 0.01。TG, 甘油三酯; CHOL, 胆固醇; LDL-C: 密度脂蛋白;HOMA-IR, 胰岛素抵抗指数。
2.3 大鼠腹部脂肪分布情况 ZDFPGZ组大鼠腹部VAT和SAT含量百分比均高于ZDFVE组，差异有统计学意义(P<0.01)，说明用药后VAT和SAT均有所增加；ZDFPGZ组大鼠的VAT含量百分比低于ZDFVE组(68.26±1.03 vs. 74.11±0.79，P<0.01)，说明吡格列酮干预后虽然总脂肪量增加，但是VAT的相对含量减少，更倾向于增加SAT的含量(见表2)。
化学泥浆2.4 大鼠内脏脂肪细胞大小 造模成功后，ZDF组大鼠脂肪细胞直径明显大于ZL组，差异有统计学意义(P<0.01)。吡格列酮干预后，ZDFPGZ组大鼠脂肪细胞明显大于ZDFVE组(P<0.01)，差异有统计学意义，说明吡格列酮可以使脂肪细胞扩增；ZLVE组与ZLPGZ组脂肪细胞直径相比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表2)。 大鼠内脏脂肪HE染结果见图2。
表2 脂肪分布及脂肪细胞大小
项目ZDFVEZDFPGZZLVEZLPGZFPVAT面积(mm2)2228.00±90.40b2981.00±91.30a262.
00±28.29c317.60±20.66c215.30<0.01SAT面积(mm2)778.90±43.77b1377.00±51.19a181.30±10.02c214.80±14.14c262.90<0.01 VAT含量百分比(%)74.11±0.79b68.26±1.03a58.37±1.75c59.64±0.85c40.67<0.01AC直径(μm)115.3±2.92b 128.4±1.59a67.27±1.45c63.66±1.42c287.10<0.01
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