ｄｏｉ：１０ ３９６９／ｊ ｉｓｓｎ １００４－２７５Ｘ ２０２０ １２ ３４
王耀祺，蔡鹰，康信煌，邓春梅，吴育廉，张国光
（广东海洋大学化学与环境学院，广东 湛江 ５２４０８８）
一个度导航摘 要：以壳寡糖、透明质酸为原料包载鲎血蛋白，考察包载不同分子量鲎血蛋白的微球对α－葡萄糖苷酶、乙酰胆碱酯酶的相关活性。结果表明鲎血蛋白壳寡糖－透明质酸微球表面较为规整，平均粒径为（３ １１±０ ４２）μｍ，包封率为（６０ ５７±０ ５２）％，载药量为（６３ ０２±２ １３）％，ｐＨ６ ８磷酸盐缓冲液中１２ｈ的累积释放率为４６ ２３％。三种载药微球对乙酰胆碱酯酶都具有良好的抑制活性。 关键词：鲎血蛋白；微球；α－葡萄糖苷酶；乙酰胆碱酯酶
中图分类号：ＴＱ４６９ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４－２７５Ｘ（２０２０）１２－１１３－０３
ＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄＡｃｔｉｖｉｔｙＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＣｈｉｔｏｓａｎＯｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ－ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃＡｃｉｄ
ＭｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓｗｉｔｈＢｌｏｏｄＰｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍＴａｃｈｙｐｌｅｕｓＴｒｉｄｅｎｔａｔｕｓＷａｎｇＹａｏｑｉ，ＣａｉＹｉｎｇ，ＫａｎｇＸｉｎｈｕａｎｇ，ＤｅｎｇＣｈｕｎｍｅｉ，ＷｕＹｕｌｉａｎ，ＺｈａｎｇＧｕｏｇｕａｎｇ （ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔＧｕａｎｇｄｏｎｇＯｃｅａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＧｕａｎｇｄｏｎｇＺｈａｎｊｉａｎｇ５２４０８８）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＣＯＳ－ＨＡｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓｗｉｔｈｂｌｏｏｄｐｒｏｔｅｉｎｗｅｒｅｐｒｅｐａｒｅｄｆｒｏｍＣＯＳａｎｄＨＡ Ｔｈｅｒｅｌａｔｅｄａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｔｈｅｍｉ ｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｂｌｏｏｄｐｒｏｔｅｉｎｏｎα－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅａｎｄａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ＲｅｓｕｌｔｈａｓｓｈｏｗｎｔｈａｔｔｈｅｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓｏｆＣＯＳ－ＨＡｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓｗｉｔｈｂｌｏｏｄｐｒｏｔｅｉｎｗｅｒｅｗｉｔｈａｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｒｅｇｕｌａｒｓｕｒｆａｃｅ Ｔｈｅａｖｅｒａｇｅｐａｒｔｉｃｌｅｓｉｚｅｗａｓ（３ １１±０ ４２）μｍ，ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎｒａｔｅｏｆ（６０ ５７±０ ５２）％，ｄｒｕｇｌｏａｄｉｎｇｏｆ（６３ ０２±２ １３）％ａｎｄｃｕｍｕｌａｔｉｖｅｒｅｌｅａｓｅｒａｔｅｏｆｐＨ６ ８ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｗａｓ４６ ２３％ａｆｔｅｒ１２ｈ Ｔｈｅｔｈｒｅｅｄｒｕｇ－ｌｏａｄｅｄｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓａｌｌｈａｄｇｏｏｄｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｎａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｂｌｏｏｄｐｒｏｔｅｉｎｏｆＴａｃｈｙｐｌｅｕｓＴｒｉｄｅｎｔａｔｕｓ；ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ；α－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ；ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ
作为“无脊椎动物献血冠军”的鲎，其血液中蕴含了许多珍贵的活性物质［１］。但是，其生物利用度较低，因此，本研究以壳寡糖、ＨＡ为原料，制备负载鲎血蛋白的微球，以提高其生物利用度。同时研究包载不同分子量鲎血蛋白的微球对α－葡萄糖苷酶、乙酰胆碱酯酶的抑制活性，为中国鲎药用和保健价值的进一步开发利用提供更为丰富的实验依据。
１ 材料
１ １ 仪器
二级膜分离实验机；核酸蛋白检测仪；酶标分析仪；冷冻干燥机（上海田枫实业有限公司）；紫外可见分光光度计；扫描电镜；Ｚｅｔａ电位及粒度分析仪；低温高速离心机
１ ２ 药品与试剂
蛋白酶抑制剂Ｃｏｃｋｔａｉｌ、胰蛋白酶、对硝基苯基－α－Ｄ－吡喃葡萄糖苷、α－葡萄糖苷酶、乙酰胆碱酯酶、５，５－二硫代双－２－硝基苯甲酸、硫代乙酰胆碱、１，１－二苯基－２－三硝基
苯肼、壳寡糖、透明质酸钠
２ 方法与结果２ １ 鲎血蛋白的提取
根据文献［２－３］的方法，提取小于１５０、１５０～３０００、大于３０００的３段不同相对分子质量范围的蛋白水解物Ａ、Ｂ和Ｃ。本文以水解物Ｃ作为被包载物进行表征。
２ ２ 鲎血蛋白－ＣＯＳ－ＨＡ微球的制备
精密称取５ｍｇ鲎血蛋白水解物，加入到含ＴＰＰ的ＨＡ溶液中使其溶解。在搅拌条件下，将溶解好ＴＰＰ、鲎血蛋白的ＨＡ溶液逐滴加入到壳寡糖水溶液中，搅拌３０ｍｉｎ，即得鲎血蛋白－ＣＯＳ－ＨＡ微球混悬液，冷冻干燥后即得冻干粉。
２ ３ 正交实验设计
以微球包封率为指标，通过探究壳寡糖浓度、ｐＨ值、ＨＡ和ＴＰＰ的浓度优化最适条件。每个因素采用三个水平，按照Ｌ
９
（３４）正交设计表进行试验，因素表见表１，结果见表２。
表１
正交设计因素表
表２
正交设计结果分析表
空气加温器 由表２可知，微球制备的最佳条件为Ａ１Ｂ２Ｃ２Ｄ２，即当壳寡糖质量浓度为２ｍｇ／ｍＬ、ＨＡ质量浓度为０ １ｍｇ／ｍＬ、ＴＰＰ质量浓度为０ ２ｍｇ／ｍＬ及溶液ｐＨ为４ ５时为最佳条件。２ ４ 微球的表征２ ４ １ 粒径与表面形貌
取微球混悬液置于扫描电镜中观察表面形貌及测量尺寸，结果见图１
。
图１ ＣＯＳ－ＨＡ微球的ＳＥＭ图
由图１可知，鲎血蛋白－ＣＯＳ－ＨＡ微球呈球形或
类球形，大小较均一，粒径为（３ １１±０ ４２）μｍ。２ ４ ２ Ｚｅｔａ电位的测定
取微球适量，用适量蒸馏水稀释，置于Ｚｅｔａ电位及粒度分析仪中测定。结果，Ｚｅｔａ电位测定值为（－３４ ３５±２ ６６）ｍＶ，体系稳定。２ ４ ３ 包封率和载药量的测定
１）鲎血蛋白溶液标准曲线的制备。称取鲎血
蛋白５ｍ
ｇ，添加ＰＢＳ缓冲液配制成０ １ｍｇ／ｍＬ的标准蛋白液。取６只试管依次加入标准蛋白液０ ０、０ １、０ ２、０ ３、０ ４、０ ５ｍＬ，再补充ＰＢＳ溶液至１ｍＬ，各加入５ｍＬ考马斯亮蓝。混匀后，在室温下静置２ｍｉｎ，以１号管作空白对照，在波长５９５ｎｍ处，测定吸光度，绘制标准曲线。标准曲线回ccr5
归方程为Ａ＝
６ ６１５ｃ＋０ ０８７，ｒ＝０ ９９９４。２）包封率和载药量的计算。在４℃条件下，
将微球混悬液离心（
４０００ｒ／ｍｉｎ）２０ｍｉｎ，分离上清液与沉淀。取上清液，于５９５ｎｍ处测定鲎血蛋
白的含量。沉淀用纯化水洗涤，经冷冻干燥２
４ｈ后称重即得载药微球冻干粉。
计算公式：包封率＝（Ｗ总－Ｗ游）／Ｗ总×１００％；载药量＝（Ｗ总－Ｗ游）／
微球质量×１００％。式中，Ｗ总为鲎血蛋白总药量；Ｗ游为上清液中游离的鲎血蛋白药量。
结果，包封率为（６０ ５７±０ ５２）％，载药量为（６３ ０２±２ １３）％。２ ４ ４ 体外释放实验
分别准确称取一定量载药微球、游离蛋白，混悬于３ｍＬｐＨ６ ８的磷酸盐缓冲液介质中，使浓度达到３ｍｇ／ｍＬ，置于透析袋内（截留量７０ｋＤａ）悬
浮于含有３
０ｍＬ释放介质的烧杯内，在３７℃下恒温振荡（１００ｒ／ｍｉｎ），分别在１、２、３、５、７、９、１２ｈ各准确取出１ｍＬ释放介质，并添加等量介质。取出的释放介质于５９５ｎｍ波长处测定吸光度。计算药物的累积释放率，并绘制体外释放曲线。结果见图２。Ｑ＝〔Ｃｎ×Ｖ０＋（Ｃ１＋Ｃ２＋Ｃ３＋……＋Ｃｎ－１
）×Ｖ〕／
ｍ图２ 鲎血蛋白原液与载药微球的体外释放曲线
由图２可知，在第５ｈ，鲎血蛋白原液累积释放
率达到９１ ０１％，而载药微球累积释放率仅为４３ ２１％，１２ｈ后，鲎血蛋白原液基本释放完全，而载药微球仅释放４６ ２３％，说明具有缓释效果。２ ５ 微球对α－葡萄糖苷酶的抑制活性
按照文献方法［４］
，取样品混悬液加入酶液，３７℃孵化１０ｍｉｎ，再加入底物，３７℃反应３０ｍｉｎ，测定Ａ４０５
，计算酶抑制活性，以阿卡波糖作为阳性对照，蒸馏水作为空白对照。
抑制率＝〔１－（Ａｓ－Ａｃ）／Ａｂ
〕×１００％结果可知，水解物微球Ａ和Ｂ对α－葡萄糖苷酶抑制能力都随质量浓度增加而增长；当质量浓度达到０ ２
（下转第１１７页）
表１
类别
ｗ（Ｓｉ）／％
１２３４５６
ｗ（Ａｌ）／％
１２３４５６
测得量９ ９１０９ ９９９ ９５９ ８２９ ９５５ ０１４ ９８５ １５５ ０２４ ９６平均值９ ９４５ ０１
误差－０ ０４０ ０６０ ０５０ ０１－０ １２０ ０６０ ００－０ ０３０ ０９－０ ０１０ ０１－０ ０５相对误差０ ３５０ ６５０ ５５０ １５１ １６０ ６５０ ０３０ ６３１ ７６０ ２３０ １７１ ０３标准偏差０ ０７０ ０５
相对标准偏差０ ６７０ ９６
滚珠丝杠副安装 从表１看出，检测方法的重复性可以，精密度不错。
２ ５ 加标回收实验
用１０００μｇ／ｍＬ铝标准溶液，对同一个气雾化铁硅铝粉样品做加标回收试验，在２５０ｍＬ锥形瓶中分别加入２５ｍＬ试样液，依次加入０、２、４、６、１０ｍＬ铝标准溶液，按上文实验步骤滴定，结果见表２。
表２ 加标回收实验结果
加标量／ｍＬ０２４６１０
试样值／％５５ ２５ ４５ ６６
测得值／％４ ９８５ ２２５ ３９５ ５６６ ０５
回收率／％９９ ６１００ ３９９ ８１９９ ２９１００ ８３
从表２可以看出，检测方法的准确度不错，回收率是９９ ２９％～１００ ８３％。挂包钩
３ 结语 联合测定气雾化铁硅铝粉中硅和铝的相对标准偏差分别为０ ６７％和０ ９６％，相对误差小，铝的回收率很好，说明此方法精密度及准确度均能达到要求，又省时简便准确。
参考文献：
［１］夏玉宇．化验员实用手册［Ｍ］．第三版 北京：化学工业出版社，２０１２，８：６０２－６１８．
［２］曹宏燕．冶金材料分析技术与应用［Ｍ］ 北京：冶金工业出版社，２００８，９：１６．
［３］曹宏燕．冶金材料分析技术与应用［Ｍ］ 北京：冶金工业出版社，２００８，９：６０．
［４］夏玉宇．化验员实用手册［Ｍ］ 第三版．北京：化学工业出版社，２０１２，８：６０－６６．
收稿日期：２０２０－０９－１５
作者简介：王迎春（１９７９－），女，桑植人，大专，工程师，从事锰系新材料、真空冶炼等合金产品的检测工作及合金材料的配比、性能研究。
（上接第１１４页）
ｍｇ／ｍＬ时，两者最大抑制率分别达到（１４ ５７±０ ５０）％和（１４ ２１±０ ６０）％，水解物Ｃ微球则对α－葡萄糖苷酶基本没有抑制活性，但都少于阿卡波糖的最大抑制率（２８ ４２±０ ２０）％。
２ ６ 微球对乙酰胆碱酯酶的抑制活性
参照Ｅｌｌｍａｎ＇ｓ比法，取样品溶液加入乙酰胆碱酯酶液、５，５－二硫代双－２－硝基苯甲酸溶液和ＰＢＳ溶液，于３７℃孵化２ｍｉｎ，然后加入硫代乙酰胆碱溶液，３７℃孵化３０ｍｉｎ，测定Ａ
４１０
，以石杉碱甲作为阳性对照，蒸馏水作为空白对照。按上式计算酶抑制活性。
结果可知，在０～０ ０４ｍｇ／ｍＬ范围内，微球和石杉碱甲抑制乙酰胆碱酯酶的能力均随浓度的增加而增加；达到０ ０４ｍｇ／ｍＬ后，酶抑制能力不再显著增长。与石杉碱甲最高抑制率（９９ ２２±０ ６０）％相比，微球水解物Ａ和Ｂ的最高抑制率分别为（４３ ９２±０ ４０）％和（３０ ５８±０ ５０）％，微球水解物Ｃ的酶抑制活性最好为（６７ ４５±０ ２０）％。３ 讨论
本研究从鲎血中成功提取并水解分离得到三种不同分子量的鲎血蛋白水解物并将其制备成鲎血蛋白壳
寡糖－透明质酸微球，其生物相容性高，药物释放具有明显的缓释效果，三种蛋白水解物微球对α－葡萄糖苷酶、乙酰胆碱酯酶具有一定抑制作用。
参考文献：
［１］李俊，韦世秀 鲨血中超氧化歧化酶的提取及部分性质的研究［Ｊ］ 时珍国医国药，２０１１，２２（４）：８４２－８４４
［２］张丽华，随志刚，张玉奎 一种可保持活性的蛋白顺序提取方法：中国专利：ＣＮ１０３５０９０８１Ａ［Ｐ］．２０１４－０１－１５
［３］李涛，程雪娇，胡美变，等 蝉蜕蛋白的提取工艺优化及体外抗氧化活性研究［Ｊ］ 中国药房，２０１８，２９（７）：９６８－９７２
无菌检查薄膜过滤器［４］王远，郑雯，袁田青，等 辣木叶总黄酮微波辅助提取工艺优化及其抑制α－葡萄糖苷酶活性研究［Ｊ］ 核农学报，２０１８，３２（１）：８４－９４
收稿日期：２０２０－０９－０１
基金项目：国家级大学生创新创业训练计划项目（２０１９１０５６６０２８）
作者简介：王耀祺（１９９７－），女，汉族，广东广州人，本科，研究方向：化学制药。
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