水中总大肠杆菌的测定
保温碗来源:加入时间:2010-3-30 12:15:51
1 原理
总大肠杆菌可用多管发酵法或滤膜法检测。多管发酵法的原理是根据大肠菌细菌能发酵乳糖,产 酸产气以及具备革兰氏染阴性,无芽孢,呈杆状等有关特性,通过三个步骤进行检验,求得水样中的总 大肠菌数,实验结果以最可能数(most probable number,简称 MPN 表示。
2仪器
2.2 恒温培养箱,冰箱。
2.3 生物显微镜,载玻片。
2.4 酒精灯,镍铬丝接种棒。
2.5 培养皿 (直径 100mm ,试管(5×150mm,小倒管,吸管 (1, 5, 10ml ,烧杯 (200, 500, 2000ml , 锥形瓶 (500, 1000ml ,采样瓶。
3.1 乳糖蛋白胨培养液:
将 10g 蛋白胨、 3g 牛肉浸膏、 3g 乳糖和 5g 氯化钠加热溶于 1000mL 蒸馏水中,调节 pH 为 7.2-7.4, 再加入 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1mL ,充分混匀,分装于试管(内有倒管中,于 121℃高压灭菌器中灭菌 15min ,贮存于冷暗处备用。
3.2 三倍浓缩蛋白胨溶液:
按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法制备。除蒸馏水外,各组分用量增加至三倍。
3.3 品红亚硫酸钠培养基
3.3.1 贮备培养基的制备
8导
于 2000mL 烧杯中,先将 20-30g 琼脂加到 900mL 蒸馏水中,加热溶解,然后加入 3.5g 磷酸氢二钾及 10g 蛋白胨,混匀,使其溶解,再用蒸馏水补充到 1000mL 调节溶液 pH 至 7.2-7.4。趁热用脱脂棉或绒布过 滤,再加 10g 乳糖,混匀,定量分装于 250或 500mL 锥形瓶内,置于高压灭菌器中,在 121℃灭菌 15min , 贮存与冷暗处备用。3.3.2 平皿培养基的制备
将上法制备的贮备培养基加热融化。根据锥形瓶内培养基的容量,用灭菌吸管按 1:50比例吸取 5%碱性品红乙醇溶液,置于灭菌空试管中;再按 1:200比例称取无水亚硫酸钠,置于另一灭菌空试管内,加 灭菌水少许使其溶解,再置于沸水浴中煮沸 10min (灭菌。用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液,滴 加于碱性品红乙醇溶液内至深红再褪至淡红为止(不宜加多。将此混合液全部加入已融化的贮备培
养基内,并充分混匀(防止产生气泡。立即将此培养基适量(约 15mL 倾入已灭菌的平皿内,再冷却凝 固后置于冰箱内备用,但保存时间不宜超过 2周。如培养基由淡红变成深红则不能再用。
3.4 伊红美蓝培养基制备
硅胶气囊
于 2000mL 烧杯中,先将 20g 琼脂加到 900mL 蒸馏水中,加热溶解,再加入 2g 磷酸二氢钾及 10g 蛋白 胨,混合使之溶解,用蒸馏水补充至 1000mL ,调节溶液 pH 值至 7.2-7.4,趁热用脱脂棉或绒布过滤,加入 2%伊红水溶液(0.4g 伊红溶于 20mL 水中 20ml 和 0.5%美蓝水溶液(0.065g 美蓝溶于 13mL 水中 13ml , 再加入 10g 乳糖,混匀后定量分装于 250或 500mL 锥形瓶内,于 121℃高压灭菌 15min ,放冷至 45℃左右, 无菌操作下将此培养基适量倾入已灭菌的空平皿内,待冷却凝固后,置于冰箱内备用。
3.5 革兰氏染剂
半有源rfid3.5.1 结晶紫染液:
将 20mL 结晶紫乙醇饱和溶液(称取 4-8g 结晶紫溶于 100mL95%乙醇中和 80mL1%草酸铵溶液混合并 过滤。该溶液放置过久会产生沉淀,不能再用。
3.5.2 助染剂:
将 1g 碘与 2g 碘化钾混合后,加入少许蒸馏水,充分振荡,待完全溶解后,用蒸馏水补充至 300mL 。 此溶液 2周内有效。 当溶液由棕黄变为淡黄时应弃去。 为易于贮备,可将上
述碘与碘化钾溶于 30mL 蒸 馏水中,临用前再加水稀释。
3.5.3 脱剂:95%乙醇。
3.5.4 复染剂:将 0.25g 沙黄加到 10mL95%乙醇中待完全溶解后,加 90mL 蒸馏水。
电动
4测定步骤
4.1 生活饮用水
4.1.1 初发酵实验:在两个装有已灭菌的 50mL 三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的大试管或烧瓶中(内有 倒管,以无菌操作加入充分混匀的水样 10mL ,混匀后置于 37℃恒温箱内培养 24h 。
4.1.2 平板分离:上述各发酵管经培养 24h 后,将产酸,产气及只产酸的发酵管分别接种于伊红美蓝 培养基或品红亚硫酸钠培养基上,置于 37℃培养箱内培养 24h ,挑选符合下列特征的菌落。
a. 伊红美蓝培养基上:深紫黑,具有金属光泽的菌落;紫黑,不带或略带金属光泽的菌落:淡
紫 红,中心较深的菌落。
b. 品红亚硫酸钠培养基上:紫红,具有金属光泽的菌落;深红,不带或略带金属光泽的菌落;淡 红,中心颜较深的菌落。
4.1.3 取有上述特特征的落进行革兰氏染
a 、 用已培养 18-24h 的培养物涂片,涂层要薄。
b 、 将涂片在火焰上加温固定,待冷却后滴加结晶紫溶液, 1min 后用水洗去。
c 、 滴加助染剂, 1min 后用水洗去。
d 、 滴加脱剂,摇动玻片,直至无紫脱落为止(约 20-30s ,用水洗去。
e 、 滴加复染剂, 1min 后用水洗去,晾干、镜检,呈紫者为革兰氏阳性菌,呈红者为阴性菌。
4、复发酵实验:上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢的杆菌,则挑选该菌落的另一部
分接种 于装有普通浓度乳糖蛋白胨培养液的试管中(内有倒管,每管可接种分离自同一初发酵管(瓶的最典 型菌落 1-3个, 然后置于 37℃恒温箱中培养 24h , 有产酸、 产气者 (不论倒管内气体多少皆作为产气论 , 即证实有大肠菌存在。根据证实有大肠菌存在的阳性管(瓶数查表 2-5“大肠菌检数表”,报告 每升水样中的大肠菌数。
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