现代高效液相谱中，分离效果好坏的一个重要指标是谱填料的选择。但是谱填料的选择范围很宽，因此，要做合适的选择，必须对此有一定的认识和了解。 一、硅胶基质填料
1、正相谱 正相谱用的固定相通常为硅胶（Silica）以及其他具有极性官能团胺基团，如（NH2，APS）和氰基团（CN，CPS）的键合相填料。
由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他极性基团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出谱柱。正相谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正已烷（Hexane），氯仿（Chloroform），二氯甲烷（Methylene Chloride）等。 2、反向谱 反向谱用的填料常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团的键合相。反向谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲醇、乙腈等的混合物。样品流出谱柱的顺序是极性较强的组分最先被冲洗出，而极性弱的组分会在谱柱上有更强的保留。
常用的反向填料有：C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl）等。
二、聚合物填料 聚合物填料多为聚苯乙烯—二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂等，其重要优点是在PH值为1—14均可使用。相对于硅胶基质的C18填料，这类填料具有更强的疏水性；大孔的聚合物对蛋白质等样品的分离非常有效。现有的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料，谱柱柱效较低。
三、其它无机填料 其它HPLC的无机填料谱柱也已经商品化由于其特殊的性质，一般仅限于特殊的用途。如，石墨化碳黑正逐渐成为反向谱柱填料。这种填料的分离不同于硅胶基质烷基键合相，石墨化碳的表面即是保留的基础，不再需其它的表面改性。该柱填料一般比烷基键合相硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强。石墨化碳可用于分离某些几何异构体，由于在HPLC流动相中不会被溶解，这类柱可在任何PH与温度下使用。氧化铝也可以用于HPLC。氧化铝微粒刚性强，可制成稳定的谱柱柱床，其优点是可以在PH高达12的流动相中使用。但由于氧化铝与碱性化合物的作用也很强，应用范围受到一定限制，所以未能广泛应用。新型谱氧化锆基质填料也可用于HPLC。商品化的只有聚合物
涂层的多孔氧化锆微球谱柱，应用PH1-14，温度可达100℃。由于氧化锆填料是最近几年才开始研究，加之面临的实验难度，其重要用途与优势尚在进行之中。
怎样选择填料粒度 目前，商品化的谱填料粒度从1um到超过30um均有销售，而目前分析分离主要用3和5um填料进行。填料的粒度主要影响填充柱的两个参数，即柱效和背压。粒度越小，柱压越大，柱压的增加限制了粒度小于3um的填料应用。在相同选择性条件下，提高柱效可提高分离度，但不是唯一的因素。如果固定相选择是正确，但是分离度不够，那么选用更小的粒度的填料是很有用的。3um填料填充柱的柱效比相同条件下的5um填料的柱效提高近30%；然而，3um的谱柱的背压却是5um的2倍。与此同时，柱效提高意味着在相同条件下可以选用更短的谱柱，即相同的塔板数或分离能力，但是柱长更短，以缩短分析时间。另外，可以采用低粘度的溶剂做流动相或增加谱柱的使用温度，比如用乙腈代替甲醇，以降低谱柱的压力。
谱柱维护
二钼酸铵
防止谱柱堵塞
原因1：溶剂中的不溶物
— 应使用谱纯溶剂，膜过滤（孔径不超过0.45μm）
原因2：样品中的不溶物
— 应对样品进行膜过滤（孔径不超过0.45μm）
原因3：泵，进样器等中的不溶物
— 在泵和进样器之间安装内置过滤器，在进样器和柱之间安装预过滤器
原因4：柱内不溶物的形成
焊锰钢板用什么焊条4-1．由于溶剂的不互溶而产生的沉淀
—用能溶解沉淀物的溶剂冲洗谱柱
4-2．在不互溶溶剂中由于进样而产生的沉淀
—检查样品液和流动相是否互溶
4-3．由于温度的改变或固定相的干涸而产生的沉淀
—将谱柱密封紧，并保持室温恒定
操作压力上升故障排除
HPLC系统流程图：
吸入过滤器>>泵>>内置过滤器>>进样器>>预过滤器>>保护柱>>主分析柱>>检测器
和排放系统
从流程图的末端依次断开部件，如从检测器开始断开，最容易引起阻塞的部件是：
预过滤器，保护柱和主分析柱
[注]：应记录新柱子在常规分析条件下的操作压力
柱堵塞的修复
步骤1：使用含盐缓冲液后（如离子对试剂）应用溶解性强的溶剂（如水）进行冲 自救手环
洗
步骤2：先断开检测器，然后用对来自样品中的物质有强溶解性的溶剂进行冲洗。
对于反相谱柱，可使用甲醇，乙睛，四氢呋喃，氯仿，庚烷等，在此条件下，应
避免溶剂的pH低于2或高于8
若经过步骤1和步骤2后，压力仍没下降至步骤3
步骤3：断开检测器，将谱柱反方向放置，然后检查柱压
（1）若压力稳定下降，至步骤4
（2）若压力不下降，至步骤5
步骤4：保持谱柱反方向连接，用低于0.5 ml/min 流速冲洗1小时
若步骤4不能降压，至步骤5
步骤5：若内置过滤器被堵塞，应冲洗或更换。柱连接端的拆卸或重装会导致柱效
下降，（有效塔板数下降和不对称峰），若步骤5不能降低柱压，至步骤6
步骤6：若进口端的填料发生堵塞，柱子将不可能被彻底恢复，只能通过去掉进口
端的部分填料，重新填充进行有限的柱效恢复。（2~5mm）
[注]：在多数情况下，柱效将严重地下降
步骤7：若步骤6无法改善柱子性能，那么柱子已无法修复，请注意当拆开连接端时
柱子已不再得到质量保证。
柱效的下降：
导致柱有效塔板数和分离能力下降的主要原因是固定相的恶化和硅胶表面活性链的
吸咪头
损失，在这些条件下柱子已不可能再恢复
谱柱的使用
1、谱柱的使用说明：
（1）谱柱使用前注意事项：谱柱的储存液无特殊说明，均为评价报告所示的流动相。在使用前，一定要注意谱柱的储存液与要分析样品的流动相是否互溶。在反相谱中，如用高浓度的盐或缓冲液作洗脱剂，应先用10％左右的低浓度的有机相洗脱剂过渡一下，否则缓冲液中的盐在高浓度的有机相中很容易析出，堵塞谱柱。
（2）流动相：流动相中所使用的各种有机溶剂要尽可能使用谱纯，配流动相的水最好是超纯水或全玻璃器皿的双蒸水。如果将所配得流动相再经过0.45μm的滤膜过滤一次则好，尤其是含盐的流动相。另外，装流动相的容器和谱系统中的在线过滤器等装置应该定期清洗或更换。
以常规硅胶为基质的键合相填料通常的PH值适用范围是2.0-8.0，BDS C18适合于碱性化合物，PH值适用范围为2.0-10.0。当必须要在PH值适用范围的边界条件下使用谱柱时，每次使用结束后立即用适合于谱柱储存并与所使用的流动相互溶的溶剂清洗，并完全置换掉原来所使用的流动相。
（3）样品：样品也要尽可能清洁，可选用样品过滤器或样品预处理柱（SPE）对样品进行预处理；若样品不便处理，要使用保护柱。在用正相谱法分析样品时，所有的溶剂和样品应严格脱水。
2、谱柱的保存
（1）反相谱柱每天实验后的保养：使用缓冲液或含盐的流动相，实验完成后应用10%的甲醇/水冲洗30分钟，洗掉谱柱中的盐，再用甲醇冲洗30分钟。注意：不能用纯水冲洗柱子，应该在水中加入10%的甲醇，防止将填料冲塌陷。
（2）长期保存谱柱：如谱柱要长时间保存，必须存于合适的溶剂下。对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中，正相柱可以储存于严格脱水后的纯正己烷中，离子交换柱可以储存于水（含防腐剂叠氮化钠或柳硫汞）中，并将购买新谱柱时附送的堵头堵上。储存的温度最好是室温。
3、谱柱的再生
因为谱柱是消耗品，随着使用时间或进样次数的增加，会出现谱峰高降低，峰宽加
大或出现肩峰的现象，一般来说可能是柱效下降。
（1）反相柱的再生：依次采用20-30倍的谱柱体积的甲醇：水=10：90 （V/V），乙腈，异丙醇作为流动相冲洗谱柱，完成后再以相反顺序冲洗谱柱。
（2）正相柱的再生：依次以20-30倍谱柱的体积的正己烷、异丙醇、二氯甲烷、甲醇作为流动相冲洗谱柱，然后再以相反的顺序冲洗谱柱。要注意上述溶剂必须严格脱水。
4、谱柱在使用过程中易出现的问题和解决办法
谱柱在使用中最常见的问题就是柱压升高，如果柱压是在长时间使用过程中缓慢增加，属于正常现象。但柱压在使用过程中突然升高（系统管路堵塞及压力传感器故障除外），以下列举了部分常见原因及解决办法：
（1）谱柱头的过滤筛板堵塞或污染；
解决方法：如确定是谱柱头的过滤筛板被污染，可以将谱柱反方向用甲醇冲洗至正乙烯基涂料
常压力，或者卸下谱柱头，将其放在10％的稀硝酸内超声清洗10分钟，后再用纯水超声10分钟，重新装入谱柱。
（2）谱柱头的填料被样品污染；
解决方法：如确定谱柱头的填料被污染，将柱头螺丝卸下，挖出柱内前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔细修复后，重新安装上柱头螺丝。
（3）谱柱内缓冲液中的盐遇到高浓度的甲醇或其他有机溶剂，形成结晶析出； 解决方法：如确定定是盐结晶，用10%的甲醇/水冲洗谱柱使柱内盐全部溶解，再换高浓度甲醇。
（4）流动相PH值过大或过小使固定相结构破坏或溶解。解决方法：如果因PH值使用不当，很难恢复 液相谱仪由高压液体泵、检测器及液相谱柱等三部分组成，其中液相谱柱的正确安装和使用，是液相谱工作的关键；也是液相谱工作者获得正确可靠的实验数据的必经之路。
一、液相谱柱的安装：
1、液相谱柱的结构：
a、空柱由柱接头、柱管及滤片组装而成。
柱接头采用低死体积结构，柱接头是两端螺纹组件，一端是为7/16英寸外螺纹，另一端是3/16英寸的内螺纹(国内外已规范化)。7/16英寸外螺纹与1/4英寸柱管(Φ6.35mm)连接，中间放置压坏用于密封。3/16英寸的内螺纹与1/16英寸(Φ1.57mm)的连接管连接，中间也放置压环用于柱接头的密封。为了尽量减少柱外死体积，在安装谱柱时，用Φ1.57mm连接管通过空心螺钉压环后要尽量插到底，然后再拧紧空心螺钉。压环被空心螺钉挤压变形后紧箍在连接管上(连接管通过压环后露出的管长度应严格控制在2．5mm长或其他固定尺寸)。
在两端柱接头内，柱管两端各放置一片不锈钢滤片(或滤网)，用于封堵柱填料不被流动相冲出柱外而流失。空柱各组件均为316#不锈钢材质，能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。
堆芯
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