雷港L2，武和明1>3，江飞1_4
[摘要]目的研究成轴细胞瘤细胞（human ameloblastoma-derived cells，hAMCs)对骨髓间充质干细胞（human bone marrow-derived mesenchymal stem cells，hBMSCs)增殖、成骨分化，以及白樓水平的影响，初步探讨成釉细胞瘤抑制骨髓干细胞骨再生 的部分机制。方法组织块结合酶消化法分离培养hAMCs并鉴定，收集其条件培养液（hAMC(•onditioned media，hAMC-CM)。以hAMC-CM刺激hBMSCs，通过CCK-8检测hBMSCs增殖变化，碱性磷酸酶实验，茜素红染及Western b lot检测hBMSCs成 骨分化相关表达的变化，Western b lo t检测hBMSCs自噬相关指标的变化结果丨iAMC-CM处理hBMSCs后，丨iBMSCs形态及 增殖状态没有变化，细胞早期及晚期成骨相关指标下调，同时自噬相关蛋白表达也下调。结论hAMCs旁分泌作用可抑制 丨iBMSCs成骨分化，该表型与hBMSCs自噬水平下调密切相关 [关键词]成釉细胞瘤细胞；骨髓间充质干细胞；骨再生；自噬
[中图分类号]R349.5 [文献标识码]A[文章编号]1003-9872(2020)12-1067-06
[doi] 10.13591/jki.kqyx.2020.12.002
Research on human amelobastoma cells inhibiting the osteogenic differentiation of hBMSCs
LEI Gang y WU Herning %JIANG Fei. ( Jiangsu Key Laboratory of Oral Diseases y Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China) Abstract ：Objective To explore the mechanism of ameloblastoma in inhibiting proliferation, osteogenic differentiation and autophagy of human hone marrow derived mesenchymal stem cells ( hBMSCs) which affects bone regeneration. Methods Human ameloblastoma cells (hAMCs) were isolated and identified through tissue pieces and enzymatic digestion culture. The hAMC conditioned media was collected to culture hBMSCs. CCK-8 kit was used to detect hBMSC proliferation, while ALP staining, Alizarin Red staining and Western blot were applied to investigate the osteogenic differentiation and autophagy of hBMSCs. Results After the treatment with hAMC-CM, the morpholog>r and proliferation of hBMSCs were not affected, hut the osteogenic phenotype of hBMSCs was inhibited. The markers of osteogenesis, such as RUNX2, OSX, AI.P, OCN, OPN, Collagen I, ATG5, Beclinl and LC3h, and autophagy in hBMSCs were down-regulated. Conclusion hAMCs could inhibit the osteogenic differentiation of hBMSCs via their paracrine functions. The mechanism of the phenotype is closely related to the down-regulated autophagy of hBMSCs.
Key words：hAMCs；hBMSCs；osteogenesis；autophagy-
Stomatology,2020,40( 12) ：1067-1072
成袖细胞瘤（ameloblastoma，A M)是一'种临床常 见的牙源性良性肿瘤，虽归属于良性肿瘤，但呈现浸 润性生长、易复发、易恶变，具有恶性肿瘤的性质[1]。约占颌骨肿瘤的14%[2]，在发展中国家发病 率相对更高[3]。目前临床上对于成釉细胞瘤的治 疗主要采用手术切除病变颌骨:1)。由于该病起病 症状不明显，进展缓慢，往往发现临床症状时已造成 大范围颌骨缺损。切除大块病变颌骨后的重建修复基金项目：国家自然科学基金（81900960)；江苏省高校f t然科学研究面上项目（17KJB320004)；江苏省高校优势学科建设丁程资助项目（PAPD,2018-87)；南京医科大学附属口腔医院“科教兴院”工程 作者单位：1南京医科大学口腔疾病研究江苏省重点实验室，江苏南京（210029) ;2南京医科大学附属口腔医院特约诊疗科，江苏南京(210029); 3南京医科大学附属口腔医院口腔颌面外科，江苏南京(210029) ;4南京医科大学附属口腔医院综合诊疗科，江苏南京(210029)
通f目作者：江飞E-mail:*************** 则成为临床难题<。
对解决临床上大块骨缺损再生的难题，目前已 有多种策略，包括自体骨移植、异体骨移植[5]，以及 基于组织工程原理的骨再生手段[4]。已有研究表 明，血管化骨再生的过程与缺损区域中干细胞的自 樓（autophagy)水平密切相关161。自唾是指细胞内 有“自己吃自己”的现象，通过溶酶体降解长半衰期 蛋白及受损细胞器，将降解产物循环再利用[7]，从 而保持细胞内的能量平衡，抵御缺氧、饥饿、
衰老等 压力及降解有害胞质成分和人侵的细菌病毒等+。自噬作为细胞内物质循环再利用过程的组 成部分，在清除干细胞自我更新、增殖和分化过程产 生的废弃蛋白及细胞器中起到重要作用[12_14:。成 釉细胞瘤是否会影响成骨相关干细胞的自噬水平，如果影响成骨相关干细胞的自噬水平，可能直接关 系到切除病变组织后的骨再生效果。本研究通过收
多功能折叠椅
集成釉细胞瘤患者切除的肿瘤组织，分离成釉细胞 瘤细胞（human ameloblastoma-derived cells, h A M C s)[l5]，收集h A M C s条件培养液与正常人骨髓 间充质干细胞（human bone-marrow mesenchymal stromal cells,h B M S C s)共培养，观察 h B M S C s 自噬水 平和成骨相关表型，进而间接分析成釉细胞瘤影响 骨再生的相关机制，为成釉细胞瘤患者切除病灶术 后的骨再生提供优化策略。
1材料与方法
1.1主要试剂
a-M E M培养液、胎牛血清、胰蛋白酶、丨型胶原 酶、双抗（青霉素/链霉素）（均购自Gihco，美国），C C K-8试剂盒（Dojindo，日本），二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，丨)M S0)(分析纯，Ameresco，美 国），碱性磷酸酶染试剂盒（建成，中国），碱性磷 酸酶活力检测试剂盒（中生，中国），茜素红染液 (Sigma，美国），R1P A蛋白裂解液（碧云天，中国广 州），S D S-P A G E
凝胶试剂盒（凯基，中国），蛋白 Marker(Fermentas，美国），SuperSignal®West P i(.o 化 学发光底物（Thermo，美国），细胞角蛋白l8(Cytok-eratin,C K-18)、波形蛋白（Vimentin)、E 钙黏蛋白 (E-Cadherin)抗体（Bioworld，美国），核心结合蛋白 因子 2 (Runt-related transcription factor2，R U N X2)、减性憐酸酶（Alkaline phosphatase,A L P)、成骨转录 因子（Osterix，O S X)、骨诞蛋白（Bone sialoprotein，BSP)、骨钙素（Osteocalcin，O C N)、骨桥蛋白（〇8-teopontin,O P N)、I型胶原（Type1collagen，Collagen I )、微管相关蛋内 I S B(Mi(T〇tuhle-asso-c i a t e c l protein l i g h t chain 3, L C3b)、自嗤相关蛋白 6 同源物（Autophagy related6 homolog，Beclinl)、自嗤 相关蛋白 5 同源物（Autophagy related 5 homolog，A T G5)抗体（A b r a m，英国），甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, G A P D H)抗体（BioworW，美国），山羊抗兔I g G二抗 (中杉金桥，中国）等。
1.2实验方法
1.2.1 h B M S C s的培养 h B M S C s购自广州赛业生 物科技有限公司，细胞增殖至80%〜90%，使用 0.25%胰蛋白酶消化传代，扩增培养至P3代用于后 续实验。
1.2.2 h A M C s的分离和培养取成釉细胞瘤组织，置于4 T无血清a-M E M培养液（含200 U/m L青霉 素及200|j L g/m L链霉素）中移人超净台。用含有 200 U/m L青霉素及200 |xg/m L链霉素的P B S漂洗
3次，每次3 min。将组织剪成1〜2 m m3大小后移人 含1g/L I型胶原酶的a-M E M培养液中，37 X；孵 箱内消化4 h，每半小时震荡15 s。当组织块呈絮状 时停止消化，丨200 r/m i n离心5 min，去上清液，加 人P B S重悬漂洗3次，细胞计数，以lxl〇6个细胞接 种于细胞培养瓶内，加人含10% F B S的a-M H：M完 全培养基，置于37丈，5%C02饱和湿度的培养箱 内，每2〜3 d换液。细胞增殖至80% ~90%消化传代，P1及P2代细胞用于后续实验。
1.2.3成釉细胞瘤条件培养液（h A M C-C M)制备
待细胞生长融合至70%后，每天换液置换出来的培 养液以3 000 r/m i n离心15 min，收集上清，用孔径 为0.22 i x m的小滤器过滤，加人等童的含10% FBS 的c x-M K M完全培养基制成条件培养液（h A M C-C M)备用。
1.2.4 C C K-8检测制备h B M S C s单细胞悬液以 1 000个/孔接种于96孔板中，细胞贴壁后用无血清 a-M E M培养液饥饿处理24 h后换用c x-M E M完全 培养基及丨i A M C-C M条件培养基培养（每组设5个 复孔），隔天换液，连续培养l、3、5、7、9c l。在每个 时间点，根据C C K-8试剂盒操作步骤检测各组样品的 吸光度值(450 _波长）。3次重复实验后，统计分析。
1.2.5碱性磷酸酶活性检测和染将h B M S C s制 备成单细胞悬液以lx1〇4个/孔接种24孔板中，待 细胞贴壁后更换无血清a-M E M培养液饥饿处理24 h，换完全培养基及h A M C-C M条件培养基 培养（
每组设3个复孔），隔天换液，3、5 d后依据试 剂盒操作说明进行碱性磷酸酶活性检测及染。1.2.6茜素红染将h B M S C s制备成单细胞悬液 以5x|〇4个/孔的细胞密度加在12孔板中待细胞贴 壁后换无血清培养基，饥饿处理24 h后分别加人a-M E M完全培养基和h A M C-C M条件培养基配置的 成骨诱导液（每组设3个复孔），隔天换液，连续培 养2周后按照染试剂盒操作说明进行染。扫描 仪记录染结果后用10%氯化十六烷基吡陡(C P C)溶液溶解染结节，检测各组吸光度值（560 n m波长），记录并作统计分析。
1.2.7 Western检测用R I P A蛋内裂解液及细 胞刮棒收集培养7 d的P0和P2代h A M C s细胞蛋 白，利用Western blot方法检测上皮组织或间充质来 源的细胞特异性标志蛋白C K-18、Vimentin以及E-Cadherin的表达量，用以鉴定不同代数培养的h A M C s的细胞来源。收集在成骨诱导过程中用a-M E M完全培养基和h A M C-C M条件培养基培养7 c l 的h B M S C s细胞蛋白，用Western W o t 方法检测成骨
分化相关蛋白 A L P、R U N X2、O S X、B S P、O P N、O C N 以及Collagen I的表达情况，用以检测条件培养液 对成骨作用的影响。类似的，收集不同培养基培养 7 d的h B M S C s细胞蛋白，用Western blot方法检测 自噬相关蛋白A T G5、Beclinl以及L C3b的表达，用 以分析条件培养液对h B M S C s成骨分化过程中自噬 行为的影响。实验重复3次。Image _!分析各组条 带的灰度值。
1.3统计学方法
采用SPSS 20.0软件进行独立样本f检验、单因 素方差分析^ P<〇.〇5为差异有统计学意义。
2结果
2.1 h A M C s的培养鉴定及扩增
通过组织块结合I型胶原酶消化法获得混合生 长的h A M C s，其中可以观察到能相互共存的呈上皮样生长的细胞体以及呈成纤维细胞样生长的细胞 体，细胞生长状态良好，且随着培养时间的持续，这些细胞体可以持续增殖并融合（图1A)。原代 培养的h A M C s中上皮样细胞（epithelial cell-like h A M C s，E-h A M C s)占据较多的生长空间而通过传代培养后细胞的上皮样体逐渐萎缩，成纤维细胞 样体（丨1丨esenc.hymal cell-like liAMCs,M-h A M C s)逐 渐占据生长优势，但均可发现两种细胞的存在。通 过Western blot实验我们发现P0代和P2代细胞均 可表达上皮和间质细胞的标志蛋白，但在P0代 h A M C s中上皮细胞来源的标志蛋白C K-18和E-Catlherin表达强度强于P2代丨l A M C s，而间充质细胞 来源的标志蛋白Vimentin的表达却弱于P2代 h A M C s(图1B)，这与我们细胞培养过程中观察到的 现象•致。
B
CK-18
Vimentin
E—Cadherin
GAPDH
P0 P2
48 ku
54 ku
120 ku
38 ku
A：原代培养的成釉细胞瘤细胞包括上皮样及成纤维样细胞落；B:P0和P2代成釉细胞瘤细胞的来源鉴定;C:hAMC-CM培养hBMSCs后的细胞形态照片；D:CCK-8检测hBMSCs增殖曲线
图1hAMCs的培养鉴定及条件培养液对hBMSCs形态和增殖的影响
Fig. 1Isolation and culture of hAMCs and the morphology and proliferation of hBMSCs with hAMC-CM
防水牛津布2.2 h A M C-C M对h B M S C s形态及增殖的影响
加人h A M C-C M的h B M S C s细胞形态与常规a-M E M完全培养基培养的h B M S C s细胞形体没有区 别，均呈梭形漩涡状生长且生长状态良好（图1C)。通过C C K-8试剂盒检测发现h A M C-C M及a-M E M 培养的h A M C s在前2 d均增殖稍慢，第3天进人快 速生长期，第7天左右增殖放缓进人平台期，整体生 长曲线近“S”型，各时间点增殖指标无统计学差异 (P>0.05)，说明h A M C-C M对h B M S C s的增殖状态 没有影响（图1D)。
2.3 h A M C s-C M对h B M S C s早期成骨能力的影响
h A M C s-C M及a-M E M培养基配制的成骨诱导液培养hBM S C s 5 t丨后，固定细胞A L P染发现加 人h A M C-C M后h B M S C s的A L P染强度较a-M E M单纯培养组弱（图2A)。而分别培养3、5 d 后，A L P活性检测结果显示单纯培养组明显高于条 件培养液组，且培养5 d的A L P活性高于3 d组，各 组间均有统计学差异（P<0_05)(图2B)。通过 Western blot实验发现成骨早期的转录因子蛋白R U N X2、0S X以及成骨蛋白A L P在力[]人h A M C-C M 后表达均有不同程度的下调，灰度值分析具有统计 学差异（p<0.01)(图2)
。
□ a-MEM ■ hAMC-CM
JL
-3C-
i
BSP
OPN
OCN
Collagen I
成骨相关蛋白
t-MEM hAMC-CM
RUNX255 ku ALP
夹具体57 ku osx
48 ku GAPDH
38 ku
hAM C-CM
BSP OPN OCN Collagen I GAPDH
19 ku 66 ku 12 ku 140 ku 38 ku
A:hAMC-CM 培养hBMSCs 5 d 后的碱性磷酸酶染结果；B:hAMC-CM 培养hBMSCs 3、5 d 后的碱性磷酸酶活性检测结果；C:hAMC-C\1培养 hB M S C s7d 后RUNX2、A L P 及OSX 的表达情况；D ：图C 蛋白条带的灰度值分析；* :/><0.05, ** :/><0.01
图2 hAMC-CM 对hBMSCs 早期成骨分化的影响
3ku
Fig.2 Effects of hAMC-CM on early osteogenic differentiation of hBMSCs
2.4 h A M C -C M 对h B M S C s 晚期成骨能力的影响
两种培养液配置的成骨诱导液培养hBMSCs 14 (丨后进行茜素红染，结果显示a -M E M 培养液组着 程度及范围明显强于h A M C -C M 培养液组（图 3A )，利用10% C P C 溶液溶解经茜素红染后的钙 化结节，然后进行相应的定量检测发现a -M E M 培
养液组钙离子浓度显著高于条件培养液组，差异具 有统计学意义（P <0.01)(图3A )。通过Western blot 实验结果发现成骨晚期的相关蛋白B S P 、0P N 、0C N 以及Collagen 1的表达在加人h A M C -C M 后均有不 同程度的下调，灰度值分析具有统计学差异（P < 0.01 或 P <0.05)(图 3)。
A ：不同培养液培养hBMSCs 14 t l 后的茜素红染结果；
B ：茜素红染结果的钙离子含M 分析；
C ：不同培养液培养hBMSCs 7 d 后BSP.OPN, OCN 及Collagen I 的表达情况；
D ：阁C 蛋白条带的灰度值分析；* :P<0.05, ** :P<0.01
图3 hAMC-CM 对hBMSCs 晚期成骨分化的影响
Fig.3 Effects of hAMC-CM on osteogenic differentiation of hBMSCs in late stage
培养条件
口 ct-MEM
■ hAMC-CM
工
3
5
时间/d
门 a-MLM 1 ■■ hAMC-CM
.rr-■
JJ —
RUNX2 ALP OSX
成骨相关蛋白
5
^D
D簇绒机
v
J
c .
.
f
2.5丨i A M C -C M 对h B M S C s 自噬活性的影响
h A M C -C M 培养 hBMSCs 7 «1 后通过 Western blot 实验发现自噬相关蛋白A T G 5、Beclinl 和L C 3I >
的表达较正常培养组均有明显下调，灰度值分析，差 异具有统计学意义（P <0.01)(图4)。说明加人了 成釉细胞条件培养液后h B M S C s 的自噬活性受到了 抑制。
晚期的特征性实验和相关蛋A 水平的标志物进行验 证[17]。在成骨诱导液中掺人h A M C -C M 后，hBMSCs 的A L P 活性明显受到抑制，成骨早期的标志物转录 因子K U N X 2、0S X 以及胞内A I P 表达显著下降。
R U N X 2和0S X 同为成骨相关的转录因子，表达于
细胞核内，是干细胞成骨分化调控的重要因子，抑制 其表达会直接抑制细胞成骨分化1181。而A L P 是成ATG5w -l.O -i 55 ku ^ 〇_g .^ 0.6-Beclin 1一
52 ku 蝱 0.4-LC3b A
—"
16 ku 裏 0.2-GAPDH
〇.〇■*
38 ku
□ a-MEM
■ hA M C -C M ATG5 Bechlinl LC3b
成骨相关蛋白
A:hAMC-CM 培养 hBM SCs 7 d 后 ATG5、Beclin 丨及 LC3b 的表达情 况;B ：自噬相关蛋白ATG5、Bedinl 及LC3b 的灰度值分析；** :P<
0.01
图4 hAMC-CM 对hBMSCs 自噬活性的影响 Fig.4 Effects of hAMC-CM on autophagy activity
of hBMSCs
3讨论
本研究根据文献所报道的方法[15]分离提取的
分离成釉细胞瘤细胞（h A M C s )呈现两种主要的细 胞形态，即内皮细胞样成釉细胞瘤细胞（epkhelial
cell-like h A M C s , E -h A M C s )和间充质样成釉细胞瘤
细胞(mesenchymal cell-like h A M C s , M -h A M C s )，符 合成釉细胞瘤公认的组织病理结构中存在上皮成分 和纤维成分的特征，通过Western blot 对所提取的
h A M C s 的标志物进行验证，其也与成釉细胞瘤研究
的相关文献中所提取的h A M C s 特征相一致[15M6]。 然而，本研究中所获得的liAMCs 在原代培养传代后 出现增殖缓慢，到P 2代时逐渐呈现停止增殖并凋 亡的趋势。因此本研究中所收集的h A M C s 条件培 养液（h A M C -C M )为生长增殖状态基本正常的P 2代 之前的细胞条件培养液（收集时经过0.22 过
滤）。
为研究h A M C s 对骨再生的影响，本研究选择标 准提取流程所获得的h B M S C s 作为细胞模型进行体 外实验。首先验证丨i A M C -C M 的毒性作用，通过
C C K -8验证h B M S C s 在h A M C -C M 中的增殖情况，结
果显示，细胞的形态和增殖情况与对照组（a -M E M ) 无统计学差异。因此我们可以判定后续用h A M C -
C M 培养的h B M S C s 在成骨表型中的所呈现的与对
照的差异并非来自h A M C -C M 的毒性。我们在实验 中对h B M S C s 进行成骨诱导，并选取成骨诱导早期、
骨细胞表面标志物之•，直接反映成骨细胞的活性
或功能状况119，A L P 表达降低、活性降低都反映出 成骨细胞矿化障碍。经过14 d 的成骨诱导培养，
h A M C -C M 对h B M S C s 成骨分化呈现持续性的抑制， h B M S C s 所形成的矿化结节明显少于对照组。成骨
表型相关的标志物O C N 、B S P 、C 〇Uagen I 117：也都呈 现下调的趋势。肿瘤组织会侵蚀破坏正常颌骨，造 成骨质破坏。而另一方面，由上述实验结果分析可 知，成釉细胞瘤还会对正常的骨髓干细胞的成骨分 化进行抑制，进而使机体失去(4我修复的能力，间接 加重颌骨病变。
已有大量报道发现h B M S C s 的成骨分化过程存 在自噬现象1
为了进一步验证h A M C s 分析对
h B M S C s 成骨抑制的作用机制，我们验证了 h A M C -
C M 是否会抑制h B M S C s 的自噬水平。结果显示 h A M C -C M 显著抑制了丨i B M S C s 中自噬相关标志物 Beclinl 、A T G 5和L C 3b 的表达。Beclin 是自噬过程
中重要的调节分子1221 .Beclinl 主要通过与PI 3K 形 成复合体来调节A T G 蛋白在自噬前体结构中定位， 调节自噬活性123]。A T G 5则是自噬形成的标志，其 表达量可在某种程度上反应细胞自噬活性[24]。L C 3 是自嗤泡膜的通用标记物，主要有两种存在形式：
LC 3a (胞质型）及LC 3b (膜型）[25]。LC 3a 转变为 LC 3b 表示自噬体形成，因此L C 3h 常被作为自噬体
形成的分子标志。结果表明：成釉细胞瘤细胞在抑 制h B M S C s 成骨分化的同时还可以抑制h B M S C s 自 噬，阻碍干细胞的自我循环利用，间接影响骨髓干细 胞对颌骨病损的修复进程。
4
结论
本研究通过分离h A M C s ，所收集h A M C -C M 可 抑制liBMSCs 成骨分化，且这一抑制作用与hBM
S C s 的自噬水平降低密切相关。说明成釉细胞瘤组织侵 蚀正常颌骨组织的同时，间接抑制骨髓间充质干细 胞促进骨再生的能力。这一研究结论的意义在于， 手术切除成釉细胞瘤后，可通过调节缺损处肿瘤微 环境中骨髓干细胞的自噬水平促进机体内源性骨再 生，为成釉细胞瘤术后骨再生提供补充策略，
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