1、以无菌操作用1mＬ灭菌吸管吸取1∶1０稀释液1ｍL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其她稀释液得试管内，振摇试管混匀,做成1∶１00得稀释液． ２、另取１mL灭菌吸管，按上条操作依次做1０倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支１mL灭菌吸管。
3、根据食品卫生标准要求或对检样污染情况得估计,选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。
二、基本原理
平板菌落计数法就是根据微生物
在固体培养基上所形成得一个菌落就是由一个单细胞
繁殖而成得现象进行得，也就就是说一个菌落即代表一个单细胞
。计数时,先将待测样品作一系列稀释,再取一定量得稀释菌液接种到培养皿中,使其均匀分布于平皿中得培养基内,经培养后,由单个细胞
生长繁殖形成菌落，统计菌落数目,即可换算出样品中得含菌数． 这种计数法得优点就是能测出样品中得活菌数。
三、器材
大肠杆菌悬液,牛肉膏蛋白胨培养基, １ml无菌吸管,无菌平皿,盛有９ml无菌水得试管，试管架与记号笔等。
四、操作步骤
1、编号:
取无菌平皿 9套,分别用记号笔标明10—6、1０-7各2套。另取7支盛有9mｌ无菌水得试管,排列于试管架上,依次标明10—1、1０－2、１0-3、10—4、10—5、10—6、1０-7。
２、稀释
用１ml无菌吸管精确地吸取１ml大肠杆菌悬液放入10－1得试管中,注意吸管尖端不要碰到液面，另取1支吸管将管内悬液来回吸吹三次,吸时伸入管底,吹时离开水面,使其混合均匀。
换一支吸管自1０—1试管吸1ml放入1０-2试管中,吸吹三次,……其余依次类推。整个稀释过程如图Ⅷ－3。
３、取样220v稳压器
用３支1ｍl无菌吸管分别精确地吸取1０—6、10-７得稀释菌液0.1mｌ，对号放入编好号得培养皿中。
４、计数
培养２4小时后,取出培养皿,算出同一稀释度三个平皿上得菌落平均数,并按下列公式进行计算:
每毫升中总活菌数＝同一稀释度三次重复得菌落平均数×稀释倍数×1０
一般选择每个平板上长有3０—300个菌落得稀释度计算每毫升得菌数最为合适。同一稀释度得三个重复得菌数不能相差很悬殊。由１0—6、１0—7两个稀释度计算出得每毫升菌液中总活菌数也不能相差悬殊,如相差较大,表示试验不精确。
平板菌落计数法,所选择倒平板得稀释度就是很重要得,一般以三个稀释度中得第二稀释度倒平板所出现得平均菌落数在50个左右为最好．
平板菌落计数法得操作就是先将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基溶化后倒平板,待凝固后编号,并于 3７℃温室中烘烤30分钟左右,使其干燥,然后用无菌吸管吸取 0、1ml菌液对号接种于不同稀释度编号得培养皿中得培养基上,再用无菌玻璃刮棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于实验台上20—30分钟,使菌液渗透入培养基内,然后再倒置于37℃得温室中培养.
五、无菌操作得基本要求
１、试验开始前,应以湿式方法清洁台面与打扫室内地面,然后以紫外线或其她方法对实验室内空气进行消毒;
2、实验人员应穿戴工作服、口罩、帽子;进行无菌检验时,需经风淋后进入实验室,然后，正确穿戴好无菌隔离衣、帽与口罩;
３、每吸取一次不同样液应更换无菌吸管，接种环(针）需在火焰上烧灼灭菌后,才可再次使用;涂改液
后视镜套4、要求无菌得试剂,如蒸馏水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、培养基、牛血清白蛋白、标准硬水、中与剂等,均需灭菌或过滤除菌；
5、无菌器材与试剂,使用前须检查容器或包装就是否完整,有破损者不得使用;
６、正在使用得无菌器材与试剂不得长时间暴露于空气中;
7、移液或接种时，应将试管口与琼脂平板靠近火焰，防止污染；
８、所有用过得污染器材,应立即放入盛有消毒液得容器中,以防止对周围环境与清洁物品造成污染;
9、若不慎发生微生物培养物摔碎或其她试验微生物泄漏事故时,不论就是否具有致病性,均应立即对污染及可能波及得区域进行消毒处理;
10、全部试验结束后,应按常规对室内空气与环境表面进行消毒处理。
六、活菌培养计数技术
1、适用范围
测定细菌悬液、菌片、采样液等样本中含有活菌得数量。
２、试验器材
(1)刻度吸管(1、0ml、10、0ml)。
(２)稀释液:
(3)营养琼脂培养基:
３、操作程序
本规范要求在杀菌试验中得活菌培养计数统一使用倾注法.其操作程序如下。
(1）对菌悬液可直接进行培养计数。对菌片、采样棉拭与小型固体样本等,应将其上得细菌洗下成为菌悬液后进行培养计数。洗菌时,一般以稀释液为洗液。具体方法如下： 取含 5、０mｌ 稀释液无菌试管,对菌片或小型固体样本直接投入即可，对棉拭则将其采样端剪入管内，每管一份样本.而后,用电动混合器混合20ｓ（或在手掌上用力振敲中开泵节能 8０ 次),将菌洗下形成菌悬液．以上操作应严格按无菌要求进行。
（2)将试管按需要数量分组排列于试管架上, 每管加入机械发条 4、5ｍl 稀释液.各组由左向右,逐管标上 10—1、１0-2、10—3virtualrouter、、、、、、等。
（3)将菌悬液样本在用电动混合器混合20ｓ(或在手掌上用力振敲 ８０次）,随即吸取 0、５ml加至 １0-1 管内.
（4)将 10－１ 管依前法用电动混合器混合2０s(或在手掌上用力振敲 80次),混匀,再吸取出０、５ml加入10—2 管内。如此类推，直至最后一管.必要时,还可作某稀释度得1：1或1:4稀释。
(５)选择适宜稀释度试管(以预计生长菌落数每平板为 １5ｃｆu~300cfu 者为宜)，吸取其中混合均匀得悬液 1、０ml 加于无菌平皿内。每一稀释度接种 3个平皿。一般需接种2个~３个不同稀释度。平皿加样前,应先按组编号,以免弄混。
(6)将冷至40℃~45℃得熔化营养琼脂培养基,倾注于已加入样液得平皿中，每平皿1５ml~20ｍl。
（7)将平皿盖好,即刻轻轻摇动混匀，平放于台上。待琼脂凝固后,翻转平皿,使底向上,置3７℃温箱内培养。
(８）每日观察细菌生长情况。培养至规定时间(细菌繁殖体为 48h,白念珠菌与细菌芽孢为 ７2h),计数最终结果得菌落数.
（9)对菌片与采样棉拭洗液得活菌培养计数，先按各试验要求处理(如去除残留消毒剂等）,而后取其最终样液按上法进行培养计数。
(10)计数菌落时，一般以肉眼观察,必要时用放大镜检查。以菌落数在15cｆu~300ｃfu得平板为准,每个稀释度 ３ 个平板生长菌落数全合乎上述标准,则以该3个平板得菌落平均值作为结果;若有2个符合上述标准，则以该合格得两个平板菌落得平均值为结果。对估计菌量极少得样本（如消毒处理后样本）,在培养计数时可不作稀释,即使平板菌落数未达15时，亦可用其计算最终结果.
将求得得平均菌落值,再乘以稀释倍数,即得每毫升原样液中得菌量.菌量单位为cｆu。
４、注意事项
(1）严格无菌操作,防止污染。
(2)认真检查试验器材有无破损(要特别注意试管底得裂痕与破洞),以防丢失样本与污染环境。
(3)注意菌液得均匀分散。
(4)稀释或取液时要准确,尽量减少吸管使用中产生得误差.
(5)每吸取一个稀释度样液，必须更换一支吸管,以减少误差。
（6)样液接种于平皿后应尽快倾注营养琼脂培养基，避免样液干燥于平皿上，影响结果得准确性.
（7)倾注时琼脂培养基温度不得超过45℃,以防损伤细菌或真菌。倾注与摇动时，动作应尽量平稳，以利细菌分散均匀，便于计数菌落。勿使培养基外溢，以免影响结果得准确性与造成环境得污染。
(８)为提高试验成功率,最好先用浊度计对原菌液含菌量做出估计,尽可能在首次试验时所取
得有限稀释范围内（2个～3个 稀释度)即有长菌在 15ｃfu～３０0cｆu 之间得平板。
(9)结果计算时，必须弄清稀释倍数,以免计算错误.
菌落数计算参考
1.计数时应选取菌落数在30~300之间得平板（ＳＮ标准要求为２５~250个菌落),若有二个稀释度均在30~3００之间时，按国家标准方法要求应以二者比值决定,比值小于或等于２取平均数,比值大于2则其较小数字(有得规定不考虑其比值大小，均以平均数报告)。
2.若所有稀释度均不在计数区间。如均大于3０0，则取最高稀释度得平均菌落数乘以稀释倍数报告之．如均小于30，则以最低稀释度得平均菌落数乘稀释倍数报告之。如菌落数有得大于30０，有得又小于30,但均不在30~３0０之间,则应以最接近3０0或30得平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如所有稀释度均无菌落生长,则应按小于1乘以最低稀释倍数报告之。有得规定对上述几种情况计算出得菌落数按估算值报告。
3。不同稀释度得菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度得二个平板得菌落数应基本接近）,即稀释倍数愈高菌落数愈少,稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象,则应视为检
验中得差错(有得食品有时可能出现逆反现象,如酸性饮料等）,不应作为检样计数报告得依据。
4。当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长得菌落之间无任何明显界限,则应作为一个菌落计,如存在有几条不同来源得链,则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长得每一个菌落分开计数。如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不到平板一半,而另一半又分布均匀,则可以半个平板得菌落数乘2代表全平板得菌落数．
5．当计数平板内得菌落数过多（即所有稀释度均大于３00时),但分布很均匀,可取平板得一半或1/4计数。再乘以相应稀释倍数作为该平板得菌落数。
6.菌落数得报告,按国家标准方法规定菌落数在1~100时,按实有数字报告,如大于1０0时,则报告前面两位有效数字,第三位数按四舍五入计算。固体检样以克（ｇ)为单位报告,液体检样以毫升（ｍl)为单位报告,表面涂擦则以平方厘米(cｍ2)报告。
兽药典得活菌计数法
取菌液或疫苗(如果为冻干苗,则先加原装量5~10倍量稀释液作放大稀释)进行稀释,在一定条件下培养，所得细菌菌落数乘以稀释倍数,即为其活菌数。按下列方法测定。
１、表面培养测定法
每个样品取１、0ｍl，用各制品适宜得稀释液做１０倍系列稀释，每个稀释度换1支吸管。具体方法就是:准确吸取菌液1、0ml,放入盛有稀释液9、０ml得第1支试管中(不接触液面)，另取1支吸管将第1管液体混合均匀后，吸取1、0mｌ放入第2管中，依次稀释至最后一管，根据对样品含菌数得估计,选择适宜稀释度，吸取最终稀释度得菌液接种适宜得培养基平板3个,每个平板0、1ｍl,使菌液散开，置３7℃晾干后,翻转平板，培养２4~4８小时(亦可适当延长)。
２、混合培养测定法
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