（1）学习并掌握物理诱变育种基本技术。
（2）观察紫外线对枯草芽孢杆菌产生淀粉酶的诱变效应。
二、实训原理
物理诱变因子中以紫外线辐射的使用最为普通，其他物理诱变因子则受设备条件的限制，难以普及。一般用于诱变育种的物理因子有快中子、60Co、γ-射线和高能电子流β-射线等。紫外线作为物理诱变因子用于工业微生物菌种的诱变处理具有悠久的历史，尽管几十年来各种新的诱变剂不断出现和被应用于诱变育种，但到目前为止，对于经诱变处理后得到的高单位抗生素产生菌种中，有80%左右是通过紫外线诱变后经筛选而获得的。因此，对于微生物菌种选育工作者来说，紫外线作为诱变因子还是应该首先考虑的。
紫外线的波长在200～380 nm 之间，但对诱变最有效的波长仅仅是在253～265 nm，一般紫外线杀菌灯所发射的紫外线大约有80%是254 nm。紫外线诱变的主要生物学效应是由于DNA 变化而造成的，DNA 对紫外线有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。紫外线引起DNA 结构变化的形式很多，如DNA 链的断裂、碱基破坏。但其最主要的作用是使同链DNA 的相邻嘧啶间形成胸腺嘧啶二
聚体，阻碍碱基间的正常配对，从而引起微生物突变或死亡。经紫外线损伤的DNA，能被可见光复活，因此，经诱变处理后的微生物菌种要避免长波紫外线和可见光的照射，故经紫外线照射后样品需用黑纸或黑布包裹。 紫外线诱变一般采用15W或30W紫外线杀菌灯，照射距离为20～30cm，照射时间依菌种而异，一般为1～3min，死亡率控制在50％～80％为宜。被照射处理的细胞，必须呈均匀分散的单细胞悬浮液状态，以利于均匀接触诱变剂，并可减少不纯种的出现。同时，对于细菌细胞的生理状态则要求培养至对数期为最好。
本实验以紫外线处理产淀粉酶的枯草杆菌BF7658。首先筛选出抗药性(抗氨苄青霉素)变异株，再进一步用琼脂块透明圈法初筛，选择淀粉酶活力有明显提高的生产菌株。
三、实验材料
(一) 菌种
枯草芽孢杆菌BF7658。
肉膏蛋白胨固体培养基、淀粉培养基。
(三) 主要药品
牛肉膏、蛋白胨、NaCl、可溶性淀粉、碘液。
(四) 主要器皿
试管、移液管、锥形瓶、量筒、烧杯、20 W 紫外灯、磁力搅拌器、离心机等。
四、实验内容
(一) 诱变
1. 菌悬液的制备
取已培养20 h 的活化枯草芽孢杆菌斜面一支，用10 mL 生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的锥形瓶中，强烈振荡10 min，以打碎菌块，离心(3000 r/min)15min，弃上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2 次，最后制成菌悬液，用血球计数板在显微镜下直接计数。调整细胞浓度为108/mL。
2. 平板制作
石墨冷凝器将淀粉琼脂培养基熔化后，冷至45℃左右倒平板。
旋转连接器
3. 诱变处理
(1) 预热正式照射前开启紫外灯预热10 min。
(2) 搅拌取制备好的菌悬液4 mL 移入6 cm 的无菌培养皿中，放入无菌磁力搅拌捧，置磁力搅拌器上，20 W 紫外灯下30 cm 处。
(3) 照射然后打开皿盖边搅拌边照射，剂量分别为1min，2min，3min。可以累积照射，也可分别照射不同时间。所有操作必须在红灯下进行。
4. 稀释涂平板
在红灯下分别取未照射的菌悬液(作为对照)和照射过的菌悬液各mL 进行不同程度的稀释。取最后3 个稀释度的稀释液涂于淀粉培养基平板上，每个稀释度涂3 个平板，每个平板加稀释液mL，用无菌玻璃刮棒涂匀，37℃培养48 h(用黑布包好平板)。注意在每个平板背后要标明处理时间、稀释度、组别、座位号。
(二) 计篡存活率及致死率
1. 存活率
将培养48 h 后的平板取出进行细胞计数。根据平板上菌落数，计算出对照样品1 mL 菌液中的活菌数。
同样计算用紫外线处理1、2、3min 后的存活细胞数及致死率。
三）观察诱变效应
在平板菌类计数后，分别向菌落数在5~6 个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈，分别测量透明圈直径与菌落直径并计算比值(HC 值)，与对照平板进行比较.
根据结果说明紫外线对枯草芽孢杆菌产淀粉酶诱变的效果，选取HC 比值大的菌落移接到新鲜牛肉膏斜面上培养。此斜面可作复筛用。
五、实验报告内容喷射混凝土用速凝剂
（一）将实验结果按表要求如实填入，并分别算出存活率，致死率。
表1 紫外线处理后枯草芽孢杆菌的存活率及致死率
(二) 测量经UV 处理后的枯草芽孢杆菌菌落周围的透明圈直径与菌落直径并计算比值(HC)与对照菌株进行比较
附录
肉膏蛋白胨培养基
牛肉膏g电位器旋钮
蛋白胨g
NaCl g
水100 mL垄玥菲
pH
100 Pa 灭菌20min。
如配制固体培养基需加琼脂%~2%；如配制半固体培养基则加琼脂%~%。
淀粉培养基
蛋白胨 1 g
NaCl g
牛肉膏g
可溶性淀粉g
琼脂~2 g
蒸馏水100 mL
pH
配制时，应先把淀粉用少量蒸馏水调成糊状，再加入到融化好的培养基中。100Pa 灭菌20 min。单水合肼
碘液
碘 1 g
碘化钾 2 g
蒸馏水 300 mL
配制时，先将碘化钾溶于5~10 mL 水中，再加入碘1 g，使其溶解后，加水至300 mL。
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微生物工程实验一淀粉酶产生菌的紫外线诱变育种
实验目的要求
1.掌握紫外线诱变育种的原理和方法步骤
2.了解淀粉酶活力测定方法
实验原理
紫外线是一种常用的物理诱变剂，它能引起DNA双链之间或同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶形成二聚体，从而导致基因突变。由于存在光复活作用，故辐照和处理后的培养应在红光下操作。
淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。枯草杆菌产生的主要是α-淀粉酶，能够随机切开淀粉链的α-1，4-糖苷键，将淀粉水解为葡萄糖、寡糖和糊精。
实验材料
菌株: 枯草杆菌
培养基及试剂：生理盐水，
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