《生理学实验指导》讲义
【实验目的】
掌握制备具有正常兴奋收缩功能的蛙类坐骨神经-腓肠肌标本的基本操作技术，掌握蛙类手术器械的使用方法。 【实验原理】防爆voc在线监测系统
蛙或两栖类动物的一些基本生命活动及生理功能与温血动物近似，而且其离体组织需要的生活条件非常简单，易于控制和掌握。因此在生理学实验中，坐骨神经-腓肠肌标本是研究神经肌肉生理最常用的对象，经常用来研究神经肌肉的兴奋性、刺激与反应的规律、肌肉收缩的特点、兴奋性的周期性变化等。双面电路板
【实验器材和药品】
蛙类手术器械一套（金属探针1根，粗剪刀、眼科剪刀各1把，圆头镊子、眼科镊子各1
把，玻璃分针2根），蛙板和玻璃板各1块，培养皿，滴管，废物缸、锌铜弓，丝线，棉花；任氏液。
【实验对象】
蟾蜍。
【实验方法和步骤】
1．破坏脑和脊髓（常用的有三种方法）
(1) 俯式捣毁法：是最常用的方法。以左手持蟾蜍，将其腹面朝向手心，前肢夹在食指和中指之间固定，后肢夹在无名指和小指之间固定，并用拇指按压蟾蜍头部使之下俯30~40度角；然后右手持金属探针沿蟾蜍头部的中线下划，可触及一凹陷处即为枕骨大孔。将探针从枕骨大孔垂直刺入1~1.5mm，再向前刺入颅腔，左右搅动（可感觉到探针与颅骨壁的碰击），破坏脑组织；再将探针退回至进针处，但不拔出而是转向后方刺入椎管，破坏脊髓。
(2) 仰式捣毁法：将蟾蜍仰卧于蛙板上，拉开下颌，右手持探针在颅底两眼之间向前下刺入颅腔，用探针在颅腔内向四周捣毁脑组织，然后将探针退至粘膜下，针尖向后平行刺入椎管内以破坏脊髓。
(3) 横断脊柱后捣毁法：左手持蟾蜍，右手持粗剪刀，在两腋窝稍下横断脊柱，然后在脊柱呈白的脊髓断面处，向上插入探针破坏脑，再向下插入探针破坏脊髓。
以上方法破坏脑和脊髓成功后，蟾蜍出现四肢（尤其是后肢）瘫软，并常有尿失禁现象。
2．剪去躯干上部及内脏 用粗剪刀在两侧腋部稍下（或在骶髂关节以上1.5 ~ 2cm处）剪断脊柱，用左手握住蟾蜍后肢，拇指按压骶骨，使蟾蜍头部及内脏自然下垂；避开腰骶神经丛后，右手用粗剪刀沿脊柱两侧剪开腹壁，在耻骨联合处将躯干上部及内脏剪掉，弃入废物缸内。
3．剥皮 左手持大镊子夹住脊柱断端 (小心勿伤神经)，右手捏住脊柱断端的皮肤边缘，逐步向下剥去全部后肢皮肤。将剥好的标本放置在盛有任氏液的培养皿中，或置于洁净的玻璃板上，滴加任氏液备用。然后洗手并清洗用过的手术器械。
4．分离左右腿 用圆头镊子夹住脊柱并提起，避开坐骨神经，用粗剪刀剪去向上突出的骶骨，沿脊柱正中线将脊柱从上向下分成两半，再从耻骨联合中央剪开（注意：剪开时应避免剪刀走“S”形，以保证坐骨神经的完整），将已分离的两腿浸入任氏液备用。亦可在游离大腿部位的坐骨神经后再分离两腿。
5．游离坐骨神经 取蟾蜍腿一条，用玻璃分针在大腿背面内侧沿坐骨神经沟（股二头肌与半膜肌之间）分离肌肉，暴露坐骨神经。向上将梨状肌及其附近的结缔组织剪断，然后用玻璃分针沿脊柱自上而下轻柔游离坐骨神经腹腔部（坐骨神经呈亮白束状），用眼科剪刀剪断神经的所有分支，在近脊柱处穿线结扎，从脊柱根部将坐骨神经剪断。也可以不结扎、不剪断神经，而保留一小块与神经相连的脊柱（约0.5cm×0.5cm左右），供握持神经用。
6．游离股骨 将游离的坐骨神经轻轻搭在腓肠肌上，切断膝关节周围的大腿部肌肉，把股骨刮干净，然后剪去股骨小头并保留余下的股骨（约1~1.5cm），以便在固定神经肌肉标本时使用。
7．完成标本 用眼科镊子（或小剪刀）在跟健下方穿一洞，向上游离腓肠肌至膝关节处。
穿线结扎腓肠肌跟健，左手提线，在结扎线远端剪断跟健。将膝关节以下的小腿其余部分全部剪去。以上过程应注意避免损伤神经，并随时滴加任氏液。至此即完成一个坐骨神经-腓肠肌标本的制备。
8．检查标本的兴奋性：用被任氏液浸湿的锌铜弓接触坐骨神经，如腓肠肌迅速收缩，则表示标本的兴奋性良好，可供有关神经肌肉生理实验用。
烟道蝶阀【实验要求与注意事项】
1．熟悉蟾蜍手术器械的使用方法，了解蟾蜍腿部的局部解剖及坐骨神经的走行。
2．避免损伤蟾蜍背部的腺体（尤其是眼后的大腺体），防止其分泌物溅入眼内或污染标本。
3．勿剪破蟾蜍内脏，并及时清洗手及用过的器械；已剥去皮肤的组织应避免接触蟾蜍皮肤或其他不洁物；以防标本被污染。
4．游离神经、肌肉时不可过度牵拉，应避免用手指、金属器械接触或夹持标本的神经肌肉部分，更不能用自来水冲洗标本。
5．制备过程中应经常向标本上滴任氏液，防止神经因干燥而失去正常兴奋性。标本制成后须放在任氏液中浸泡数分钟，使标本兴奋性稳定。
6．移动制备好的标本时，先将游离的神经搭在腓肠肌上，再用双手分别提拿跟键和股骨断端，防止神经受力过重。
【分析与思考】
1．通过制备坐骨神经-腓肠肌标本，你对生理学实验有何感想?
2．损毁脑和脊髓后的蟾蜍有何表现？若破坏脊髓不彻底，蟾蜍的四肢会有什么表现？为什么？
3．为什么在本实验中应经常给标本滴加任氏液？
4．锌铜弓为何能用来检查标本的兴奋性？若无锌铜弓，能否用其他方法来检查标本的兴奋性？
实验二 神经干动作电位和传导速度的测定
【实验目的】
熟悉电生理仪器的使用方法。了解测定蟾蜍坐骨神经干动作电位的基本原理和方法。了解测定动作电位传导速度的基本原理和方法。
【实验原理】
神经组织是可兴奋组织，受刺激时可产生动作电位。动作电位可沿神经纤维传导。将两个引导电极分别置于正常完整的神经干表面，神经干一端兴奋时，兴奋向另一端传播并依次通过两个记录电极，可记录到两个方向相反的电位偏转波形，称为双相动作电位。若两个引导电极之间的神经组织有损伤，动作电位只能到达第一个引导电极，而不能传导至第二个引导电极，此时只能记录到一个方向的电位偏转波形，称为单相动作电位。
神经纤维的生理特性之一是具有高度的传导性。不同类型的神经纤维传导速度不同，其传导速度主要受神经纤维的粗细、内阻及有无髓鞘的影响。如测得神经冲动在神经干上传导的距离与时间，可根据距离(s)、时间(t)、速度(v)三者之间的关系式求出神经冲动传导速度，即v=s/t。
【实验器材和药品】
RM6240多通道生理信号采集处理系统，神经标本屏蔽盒，蛙类手术器械一套，蛙板，玻璃板，废物缸，培养皿，滴管，棉花，线；任氏液。
【实验对象】
蟾蜍。
【实验方法和步骤】
1．制备坐骨神经干标本 标本制备的前几步同坐骨神经-腓肠肌标本的制备（破坏蟾蜍的脑和脊髓、剪除躯干上部及内脏、剥皮、分离左右腿、游离坐骨神经）。坐骨神经在腘窝上方分为两支：胫神经走行表浅，位于腓肠肌内侧；而腓神经走行较深，位于腓肠肌外侧。若仅分离胫神经，则称为坐骨神经胫神经标本；若仅分离腓神经，则称为坐骨神经腓神经标本；若两者均分离，则称为坐骨神经胫神经腓神经标本。标本制备好后，浸入任氏液中10~15分钟备用。
2．连接实验装置 将RM6240多通道生理信号采集处理系统和神经标本屏蔽盒连接好。将标本置于神经标本屏蔽盒内的电极上，盖好盒盖。
3．仪器调试碱性脱漆剂 打开计算机，进入RM6240多通道生理信号采集处理系统操作界面，点击实验项目→肌肉神经实验→神经干动作电位的引导→设置各项参数→确定。
4．观察项目
(1) 在显示屏上得到一稳定的双相动作电位，观察其波形。
(2) 在A、B两引导电极之间用小镊子夹伤神经干（注意不可夹断），在其他条件不变的情况下，观察动作电位的波形有无变化，是否由双相变为单相？
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(3) 将刺激强度调零，然后逐渐增加强度，观察动作电位的幅值与刺激强度之间的关系，同时注意刺激伪迹与刺激强度之间的关系，并注意动作电位的波形有什么变化。
5. 再次进入进入RM6240多通道生理信号采集处理系统操作界面，点击实验项目→肌肉神经实验→神经干兴奋传导速度测定→设置各项参数→确定。
6．观察项目
(1) 测定传导速度：用两个通道同时记录时，可较准确的测定动作电位传导的速度。
(2) 通过相应的按键完成测量、存盘、打印等操作。
【实验要求与注意事项】
1．制备标本时应仔细去除附着在神经干上的结缔组织和血管，不可过度牵拉。
2．不可向神经标本屏蔽盒内直接滴加任氏液，电极间不可有任氏液存在，以防短路。可将湿的滤纸置于盒底，以防盒内干燥。
3．应将神经拉直后搭在电极上，不可折叠，也不可碰到屏蔽盒的壁上。
4．神经标本屏蔽盒用毕应清洗擦干，防止电极生锈。
【分析与思考】
1． 神经干复合动作电位的形状与细胞内记录的神经纤维的动作电位有何区别与联系?
2． 通常记录到的双相动作电位的第一相和第二相为何在波形、幅值上不对称？在什么情况下可记录到对称的双相动作电位？在什么情况下可记录到单相动作电位？
3．在一定范围内，神经干动作电位的幅度为何随刺激强度的增大而增大？这与动作电位的“全或无”规律是否矛盾？
4．何为刺激伪迹？在实验中如何辨别刺激伪迹与动作电位？用什么方法可减小刺激伪迹?
5．能否设计一个实验，来验证神经纤维兴奋传导的双向性、相对不疲劳性和生理完整性？
6．若坐骨神经标本足够长，增大刺激电极与引导电极之间的距离，动作电位的波形将有何变化？为什么？
7．仅用一对引导电极能否测定传导速度，应注意什么？
实验三 不同刺激强度和刺激频率对骨骼肌收缩的影响
【实验目的】
容器景何
学习神经—肌肉实验的电刺激方法及肌肉收缩的记录方法。观察不同频率的阈上刺激引起肌肉收缩形式的改变，分析刺激强度与肌肉收缩反应的关系。
【实验原理】
肌肉组织具有兴奋性，受到刺激后会发生反应，表现为肌肉收缩。当刺激坐骨神经-腓肠肌标本时，在一定范围内，随着刺激强度的增大，参与兴奋的神经纤维和骨骼肌纤维的数目随之增多，骨骼肌的收缩力量也随之增强。改变刺激频率，肌肉可出现不同形式的收缩反应。肌肉受到一次刺激，爆发一次动作电位，引起一次收缩，称为单收缩。其全过程可分为潜伏期、缩短期和舒张期三个时期。单收缩是骨骼肌其他收缩形式的基础。当给予骨骼肌两个以上相继有效的刺激时，肌肉将出现连续的收缩。改变刺激频率，即可使肌肉出现不同形式的收缩反应。如果刺激频率较低，刺激间隔时间大于肌肉单收缩的持续时间，肌肉的反应表现为一连串的单收缩；若逐渐增加刺激频率，使刺激间隔时间逐步缩短，使后一次的收缩反应落在前一收缩的舒张期内，则引起锯齿状的不完全强直收缩；若继续增加刺激频率，使后一次收缩反应落在前一收缩的缩短期内，则出现收缩曲线呈平滑的完全强直收缩。这种肌肉收缩波形的部分或全部重合，又称为复合收缩。所以，有效刺激的频率决定了肌肉收缩的形式。在正常机体内骨骼肌的收缩几乎全是强直收缩。
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