农业微生物学实验指导
北京农学院食品科学系
授课教师刘一倩
高秀芝
2006年3月
1目的要求
(1)了解普通光学显微镜的构造，各部分的功能和使用方法。
(2)学习并掌握油镜的原理和使用方法，熟悉几种常见微生物的基本形态。
2普通光学显微镜的构造与油镜的工作原理
2.1普通光学显微镜的构造 显微镜的构造可分为机械装置和光学系统两大部分。机械装置包括镜座、
镜筒、镜臂、物镜转换器、载物台、推进器、粗调螺旋、微调螺旋、光圈等部件；光学系统由接目镜、接物镜、聚光器、反光镜等组成(图1-1)。 (1)镜座 镜座是显微镜底座，用以支撑
全镜，呈长方形。其上装有电源开关、照明
光源、保险丝、光源滑动变阻器等。
auts
(2)镜筒 镜筒上连接目镜、下连接转换
器，光线从筒中通过。 安装目镜的镜筒分为
可调式的单筒和固定式的双筒两种。从镜筒
上缘到物镜转换器螺旋口之间的距离称为筒
长。国际上将显微镜的标准筒长定为160mm ，
此数字标在物镜的外壳上。
(3)镜臂 连接镜筒和镜座。有的镜臂是
固定的，有的可向后方倾斜，其作用是支撑
铭牌生产
镜筒、载物台、聚光器和调焦装置等。
(4)物镜转换器 转换器上可安装3～5
个物镜，一般是3个物镜(低倍镜、高倍镜、
油镜)。转动转换器时，可以按需要调换各种
物镜，将之推到使用位置上。
图1-1 光学显微镜构造示意图 (5)载物台 载物台呈长方形，中央有一
进器。
(6)推进器 推进器由一横一纵两个推进
齿轴和齿条构成，转动其上螺旋，可使标本片
向前、后、左、右移动。研究型显微镜的纵横架杆上刻有刻度标尺，构成精密的平面坐标系。如需要重复观察已检查标本的某一物像时，可在第一次检查时记下纵横标尺的数值，下次按数值移动推进器，就可以到原来标本的位置。
1.物镜转换器；
2.物镜；
3.游标卡尺；
4.载物台；
5.聚光器；
6.虹彩光圈；
7.光源；
8.镜座；
9.电源开关；10.光源滑动变阻器；11.粗调螺旋；12.微调螺旋；13.镜臂；14.镜筒；15.目镜；16.标本移动螺旋
光子重构(7)粗调螺旋 粗调螺旋用于粗放调节物镜和标本的距离。老式单目镜显微镜的粗调螺旋向前扭动，镜头下降接近标本。新式双目镜显微镜(如Motic 显微镜)镜检时，双手向后扭动使载物台上升，让标本接近物镜，反之则下降，标本远离物镜。使用显微镜观查标本时，主要使用粗调螺旋调节。
(8)微调螺旋 用粗调螺旋只能粗放地调节焦距，难于观察到清晰的物像，因而需要用微调螺旋做进一步调节。其每转一周，镜筒移动0.1 mm 。新式研究型显微镜粗、微螺旋为共轴式。原则上，微调螺旋每次旋转不超过一周。
(9)光圈 在聚光器下方，可任意开闭，用来调节射入聚光器光线强弱。
(10)接目镜目镜作用是将物镜放大了的实像进行第二次放大，形成虚像并映入眼帘。不同的目镜上刻有5×、10×、15×等字样，以表示该目镜的放大倍数。 普通光学显微镜常用的目镜主要是惠更斯目镜。研究型显微镜配有性能更好的目镜，如补偿目镜(K)、平场目镜(P)和广视场目镜(WF)等。照相时选用照相目镜(NFK)。
(11)接物镜物镜安装于转换器上，入射光线通过物镜时使被检物像形成第一次放大的实像。普通显微镜装有低倍镜(10×)、高倍镜(40×)和油镜(100×)三种消差物镜，外壳上标有“Ach”字样，通常与惠更斯目镜配合便用。使用低倍镜和高倍镜时，物镜与标本间的介质是空气，称之为干燥系物镜。；而使用油镜时，物镜与标本间的介质是香柏油，称之为油浸系物镜。油镜标有HI或Oil字样及镜头下缘刻有白环或红环。检查细菌标本要用油镜。研究型显微镜配有性能更好的物镜，如复消差物镜(Apo)、平场物镜(Plan)、平场消差物镜(Plan Ach)、平场复消差物镜(Plan Apo)等。
(12)聚光器由聚光透镜、升降螺旋和能调节开孔大小的虹彩光圈组成，装在载物台下面，可通过升降
螺旋而起落。其作用是将光线聚光于标本之上，增强照明度。普通光学显微镜配置的都是明视场聚光器，分为阿贝聚光器、齐明聚光器和摇出聚光器三种。研究型显微镜(如Motic BA400显微镜)配有性能更好的消差摇出式聚光器，能将聚光器上透镜从光路中摇出，满足低倍物镜(4×)大视场照明的需要。齐明聚光器虽质量最好，但不适于4倍以下的物镜。
(13)反光镜早期普通光学显微镜常用自然光检视标本，在镜座上装有反光镜，由平凹两面镜子组成。光线较强时用平面镜，光弱时用凹面镜，可自由旋转方向，以将最佳光线反射入聚光器。新式研究型显微镜镜座上装有光源，并由电流调节螺旋来调节光照强度。
2.2油镜使用的工作原理在显微镜的光学系统中，物镜的性能直接影响显微镜的分辨率。与其他物镜相比，油镜的放大倍数最大，使用也比较特殊，需在载玻片与镜头之间滴加香柏油，这主要有如下二方面的原因：
(1)增加照明亮度油镜的放大倍数虽然可达100×，但因焦距很短，镜头直径很小，进入镜头中的光线亦较少，故所需要的光照强度最大(图1-2)。当油镜头和标本玻片之间的介质为空气时，因空气折射率(n=1.00)与玻璃的折射率(n=1.55)不同，会有一部分光线被折射而不能进入镜头内，使视野更暗，物像显现不清。若在镜头与标本玻片之间滴上与玻璃的折射率相仿的油类，如香柏油(n=1.52)等，则光线不发生折射，从而增加了视野的照明亮度(图1-3)。
图1-2 物镜的焦距、工作距离和虹彩光圈的关系
图1-3 干燥系物镜A与油浸系物镜B的光线通路
(2)增加显微镜的分辨力显微镜的分辨力或分辨率是指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力。它与物镜的数值口径成正比，与光波长度成反比。因此，当光波波长一定时，物镜的数值口径愈大，则显微镜的分辩力愈大，被检物体的细微结构也愈清晰地区别出来。分辨力可由下列公式表示：
分辨力(最大可分辨距离)=λ/2NA
式中λ为光波波长(0.4～0.7 µm)；NA为物镜的数值口径值。它是光线投射到物镜上的最大角度(称为镜口角)的一半正弦，与介质的折射率之乘积，即NA=n·sinα。式中α为光线最大入射角的半数，它取决于物镜的直径和焦距。在实际应用中光线入射角最大只能达到120º，其半数的正弦为Sin60º=0.87。以空气为介质时，NA=1×0.87=0.87；而以香柏油为介质时，NA=1.52×0.87=1.32，故以香柏油为介质的油镜要比用空气为介质的高倍镜分辩力高，因而细菌用油镜才可观察到。
然而，显微镜的放大倍数越高，并不等于其分辨力越高。假如采用放大率为40×的高倍镜(NA=0.65)和放大率为24×的目镜，虽然总放大率为960×，但其分辩力只有0.42µm；若采用放大率为90×的油镜(NA=1.25)和放大率为9×的目镜，虽然总放大率为810×，但却能分辨出0.22µm之间的距离，因而显微镜的总放大倍数越高并不是其分辨力越高。
3实验材料
3.1菌种细菌三型、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)等染玻片标本。
3.2溶液或试剂香柏油、二甲苯。
3.3仪器与其他用具显微镜、擦镜纸等。
4普通光学显微镜的使用流程
安置→调光源→调目镜→调聚光器→镜检(低倍镜→高倍镜→油镜) →擦物镜头→复原
5操作步骤
5.1观察前的准备
5.1.1显微镜的安置 置显微镜于平整的实验台上，镜座距实验台边缘约10cm。镜检时姿势要端正。一般用左眼观察，右眼绘图或记录，两眼同时睁开，以减少眼睛疲劳。
5.1.2光源调节安装在镜座内的光源灯可通过调节电压以获得适当的照明亮度。反光镜采集自然光或灯光作为照明光源时，较强的自然光源用平面镜，较弱的照明光源用凹面镜，并调节其角度，使视野内
的亮度适宜、均匀。凡检查染标本时，光线应强；检查未染标本时，光线不宜太强，可通过光圈、聚光器、反光镜调节适宜的光线。
5.1.3双筒显微镜的目镜调节根据使用者的个人情况，双筒显微镜的目镜间距可以适当调节，而左目镜上一般还配有屈光度调节环，可以适应眼距不同或两眼视力有差异的不同观察者。诱捕黄鳝
5.1.4聚光器数值孔径值的调节正确使用聚光镜才能提高镜检效果。聚光镜的主要参数是
数值孔径，它有一定的可变范围，一般聚光镜边框上的数字是代表它的最大数值孔径，通过调节聚光镜下面可变光阑的开放程度，可以得到各种不同的数值孔径，以适应不同物镜的需要。
5.2 显微镜观察 一般情况下，特别是初学者，进行显微镜观察时，应遵守从低倍镜到高倍镜，再到油镜的观察程序。因为低倍数物镜视野相对较大，易发现目标和确定检查的位置。5.2.1低倍镜观察将标本片置于载物台上，用弹簧夹固定，移动推进器，使观察对象处于物镜正下方。旋动粗调螺旋，使物镜与标本片距离约lcm(单镜筒显微镜)或0.5cm(双镜筒显微镜)，再以粗螺旋调节，使镜头缓慢升起(单镜筒)，或使载物台缓慢下降(双镜筒)，直到物像出现后再用微螺旋调节使物像清晰。然后移动标本玻片，将观察目标移至视野中心后，仔细观察与绘图。
5.2.2高倍镜观察由低倍镜直接转换成高倍镜至正下方。转换时，需用眼睛于侧面观察，避免镜头与玻
片相撞。调节聚光器和光圈使视野亮度适宜，而后微调细螺旋使物像清晰。利用推进器移动标本到需要观察的部位，并移至视野中心仔细观察或准备用油镜观察。
5.2.3油镜观察先将光圈开至最大，集光器升至最高位，调节好光源，使照明亮度最强。在高倍镜或低倍镜下到要观察的样品区域后，用粗调节螺旋将镜筒远离载物台，然后在标本上滴加香柏油(切勿过多，否则视野模糊)，转换油镜头，从侧面注视，小心将之浸入油滴中，使其几乎与标本片相接触为度(注意：切不可将油镜镜头压到标本，否则不仅压碎玻片，还会损坏镜头)。用粗螺旋缓慢升起镜筒(单镜筒)或下降载物台(双镜筒)，至物像出现后，再以细螺旋调至物像清晰。如果油镜已离开油面而仍未见物像，可再将镜头浸入油中，重复以上操作至物像清晰为止。
5.3显微镜用后的处理观察完毕，台起镜头，立即用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸取少许二甲苯(香柏油溶于二甲苯)或乙醚乙醇混合液擦去镜头上的残留油迹，最后再用擦镜纸擦去残留的二甲苯。严禁用手或其他纸擦镜头，以免损坏镜头。用绸布清洁显微镜的金属部件。
将各部分还原，将物镜转成“八”字形，再将载物台下降至最低，降下聚光器，以免与物镜相撞，反光镜垂直于镜座。套上镜套，放回柜内或镜箱中。
6实验结果与报告
(1)分别绘出用油镜观察到的细菌的形态图。注意观察它们的个体形态、大小、排列方式。有芽孢的细菌，观察其菌体两端情况及芽孢着生位置。
7思考题
(1)观察细菌时为何使用油镜？它与干燥系物镜使用方法有何不同？使用时注意哪些问题?
(2)普通光学显微镜的目镜与物镜的常用放大倍数有几种？显微镜的放大倍数越高，分辩力越高吗?为什么？举例说明。
(3)试列表比较低倍镜、高倍镜及油镜各方面的差异。为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节螺旋的误操作？
(4)根据实验体会，谈谈应如何根据所观察微生物的大小，选择不同的物镜进行有效的观察。
碗形垫片
实验2 细菌的革兰氏染及其形态观察
1目的要求
(1)了解革兰氏染法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
(2)学习掌握革兰氏染技术，进一步熟练光学显微镜油镜的使用技术。
2基本原理
革兰氏染法是细菌学中最重要的鉴别染法。根据细菌细胞壁的结构和化学组成的不同，经革兰氏染后，呈现不同的染反应，可将所有细菌区分为两大类，即革兰氏阳性菌(用G+表示)和革兰氏阴性菌(用G-表示)。当细菌用结晶紫初染后，像简单染法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫—碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。染关键在于脱剂的脱作用。当用乙醇(或丙酮)处理时，两类细菌的脱效果是不同的。G+细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量较低，用乙醇(或丙酮)脱时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱和复染后仍保留初染剂的蓝紫。G-细菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量较高，所以当脱处理时，类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁通透性增大，使结晶紫—碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红。
3实验材料
3.1菌种大肠杆菌（Escherichia coli）约24h营养琼脂斜面培养物，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)约18～20h营养琼脂斜面培养物。
3.2染剂草酸铵结晶紫染液、尔氏碘液、95％乙醇、0.5%番红(沙黄)染液。3.3仪器与其他用具显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、双层瓶(内装香柏油和二甲苯，因二甲苯有毒及容易损坏镜头，可用乙醚乙醇混合液替代二甲苯)、生理盐水、擦镜头纸、吸水滤纸、纱布、火柴、玻璃铅笔、玻片夹或镊子等。
4实验流程
涂片→干燥→固定→草酸铵结晶紫初染(1min)→水洗→碘液媒染(1min)→水洗→95%乙醇脱(30s)→水洗→沙黄复染(1min)→水洗→滤纸吸干→镜检
5操作步骤
5.1制片取菌种培养物按简单染法中的常规涂片、干燥、固定进行制片。注意要用活跃生长期的幼龄培养物做革兰氏染。
5.2初染在涂片菌膜处滴加草酸铵结晶紫适量(以刚好将菌膜覆盖为宜)，染1～2min，倾去染液，细水冲洗至洗出液为无。
5.3媒染滴加碘液于涂片上，作用1min，水洗。
5.4脱用滤纸吸去玻片上的残水，滴加95％酒精于涂片上，轻轻摆动玻片，直至乙醇脱刚好不出现紫为止，一般30s(如牛乳培养物用60s)后立即水洗，终止脱。
5.5 复染 沙黄复染1～2min，水洗。
5.6镜检用滤纸吸干或自然干燥，油镜检查。G+菌呈蓝紫，G-菌呈红。
革兰氏染的注意事项：①涂片不宜过厚，勿使细菌密集重叠，影响脱效果，否则脱不完全造成假阳性。镜检时应以视野内分散细胞的染反应为标准。②火焰固定不宜过热，以玻片不烫手为宜，否则菌体细胞变形。③滴加染液与酒精时一定要覆盖整个菌膜，否则部分菌膜未受处理，亦可造成假象。④乙醇脱是革兰氏染操作的关键环节。如脱过度，则G+菌被误染成G-菌；而脱不足，G-菌被误染成G+菌。在染方法正确无误前提下，如菌龄过长，死亡或细胞壁受损伤的G+菌也会呈阴性反应，故革兰氏染要用活跃生长期的幼龄培养物。
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