框计算
摘要:羧肽酶(Carboxypeptidase)是一类可水解肽链C末端氨基酸残基的蛋白酶,广泛存在于高等植物、动物组织及真菌中,主要分为丝氨酸羧肽酶、金属羧肽酶和半胱氨酸羧肽酶3个亚类。本文综述了羧肽酶的研究进展,主要包括羧肽酶的应用、性质、来源分布、克隆表达及研究意义,并对其研究前景进行了展望。 关键词:羧肽酶;应用;来源分布;性质
羧肽酶是一种专一性地从肽链的C端逐个降解、释放游离氨基酸的一类肽链外切酶。在动物、植物的组织器官中,羧肽酶发挥着重要的生理功能,如胰腺羧肽酶A和B可用于消化食物,羧肽酶M(CPM)选择性地参与肽类激素的加工,羧肽酶D(CPD)和羧肽酶N(CP N)参与肽和蛋白质加工等。如表1所示,羧肽酶广泛应用于医药、食品等工业领域。在医药领域,由于羧肽酶广泛参与机体的生化反应,可通过体内羧肽酶的检测达到诊断和疾病的目的;此外,在医药上还可用于体内不良物质(毒素等)的降解。在食品工业,可用于制备高F值寡肽、食品和饲料中赭曲霉素的去除、用作脱苦味剂等。在生物技术领域,羧肽酶可用于多肽的合成及多肽氨基酸序列测定,也可作为模式酶,对其他酶的研究提供帮助。动物来源的羧肽酶主要存在于猪、牛等
的胰脏中,如羧肽酶A/B,其数量非常有限、价格昂贵、导致其应用受到限制;微生物来源的羧肽酶存在于酵母、曲霉等真菌的液泡中,具有广阔的应用前景。因此,借助基因工程策略采用微生物为宿主大量生产重组羧肽酶,有望克服羧肽酶生产过程所遇到的动植物原料来源限制等限制,进一步降低生产成本、提高产品质量、深化酶学性质研究、扩展应用范围。本文综述了羧肽酶的种类、特点以及羧肽酶基因工程表达策略,主要包括羧肽酶的性质、来源分布、克隆表达,并对其研究前景和热点进行了展望。 关键字:羧肽酶;应用;来源分布;性质
羧肽酶的种类及其特点
单向离合器轴承
根据羧肽酶活性中心含有丝氨酸残基、金属离子和半胱氨酸残基的不同,将羧肽酶分,将羧肽酶分为丝氨酸羧肽酶(EC3.4.16.-)、金属羧肽酶(EC3.4.17.-)和半胱氨酸羧肽酶(EC3.4.18.-)。 1.1丝氨酸羧肽酶
丝氨酸羧肽酶又称酸性羧肽酶,是一类真核生物蛋白水解酶,亚基相对分子质量4000 0-7500
0,广泛存在于真菌、高等植物和动物组织中。在酸性环境,丝氨酸羧肽酶具有末端蛋白水解酶、酯酶和脱酰胺酶的活性,可同时参与多肽和蛋白质的加工、修饰与降解。由于位切点不同,丝氨酸羧肽酶又分溶酶体Pro-Xaa羧肽酶(EC3.4.1 6.2-lysosomal Pro-Xaa carboxypeptidase)、丝氨酸D-Ala-DAla羧肽酶(EC3.4.16.4-serine-type D-Ala-DAlacarboxypeptidase)、羧肽酶C(EC3.4.1 6.5-carboxypeptidase C)、羧肽酶D(EC3.4.16.6 -carboxypeptidase D)。其中,羧肽酶C因可水解所有具有羧基末端的氨基酸(羟脯氨酸除外),已成为蛋白质多肽链C末端分析中常用工具酶;此外羧肽酶C 还可通过转肽反应将其它氨基酸衍生物或亲核物质以取代肽链末端的氨基酸残基从而形成新肽。在所有丝氨酸羧肽酶的活性位点中,含有1个由Ser、Asp、His按独特顺序构成的具有催化功能的结构单元,其中Ser是亲核位点、Asp是亲电子体、His是基底。这一结构单元可被异氟磷(DFP)、甲苯磺酰丙氨酸和酮苯丙氨酸抑制[10]。此外,丝氨酸羧肽酶活性被Cu2+、Fe2+、Fe3+、Hg2+等金属离子抑制,Mg2+
则促进羧肽酶活性[11]。 氨气压缩机
1.2金属羧肽酶
金属羧肽酶是一类存在于细胞外,帮助蛋白质消化,在中性或弱碱性条件下具有极大活性的羧肽酶,包括:羧肽酶A、B、赖氨酸羧肽酶、甘氨酸羧肽酶和谷氨酸羧肽酶等。其中,羧肽酶A能释放C末端氨基酸(除脯氨酸、羟脯氨酸、精氨酸和赖氨酸),对具有芳香族侧链和大脂肪侧链的羧基端氨基酸具有很强水解能力。相比较而言,羧肽酶A释放非极性氨基酸、组氨酸、苏氨酸、高丝氨酸等的速度比较快,但对天冬氨酸、丝氨酸、蛋氨酸以及赖氨酸等的释放速度则比较缓慢,但随着pH值的增加,对天冬氨酸、丝氨酸和蛋氨酸的作用速度也不断加快。羧肽酶A的催化需要锌离子参与,它是第一个被发现的金属酶和锌酶,正是因为如此,羧肽酶A是动力学、结构和光谱方法等方面研究最为清楚的水解酶,为其他锌酶的研究奠定了坚实的基础。羧肽酶B仅水解以碱性氨基酸(如精氨酸和赖氨酸)为C末端残基的肽键,大部分特性与羧肽酶A很相似,唯一不同点在于羧肽酶B对C-末端是精氨酸和赖氨酸残基的肽键具有很高的水解活性,有时也能切断其它疏水性氨基酸残基。PH8时羧肽酶B 活性达到最大值,偏酸性和偏碱性的条件都会降低酶活,当pH≥12时,活性则完全丧失。赖氨酸羧肽酶能降解蛋白末端的基本氨基酸,因对赖氨酸具有很强的活性而被命名为赖氨酸羧肽酶,通常用于调节乙型肝炎病毒核心启动子表达活性的研究。甘氨酸羧肽酶又名羧肽酶S,能降解倒数第二个为甘氨酸的肽,如Z-Gly-Leu。羧肽酶E、羧肽酶M、羧肽酶U和羧肽酶B类似,主要降C-末端为精
氨酸和赖氨酸的肽。谷氨酸羧肽酶又名羧肽酶G,能作用于含N-酰化底物的C-末端,释放谷氨酸,用于甲氨蝶呤的解毒及抗体导向酶-前药疗法。Cd2+、Mn2+、Zn2+、Ni2+、Co2+都能不同程度地提高金属羧肽酶的活性,但Cu2+、Hg2+、EDTA、3-Phenylpropionic acid、土豆羧肽酶抑制剂等则抑制金属羧肽酶活性。
1.3半胱氨酸羧肽酶
半胱氨酸羧肽酶又称组织蛋白酶X、组织蛋白酶Z、酸性羧肽酶,是一类由Cys84、H is233和Asn254组成活性中心,催化功能结构域中包含半胱氨酸(Cys)的羧肽酶。存在于牛)、鲤鱼(Cyprinus carpio)、人(Homo sapie ns)、小家鼠(Mus musculus)、褐牙鲆(Paralichthys ol ivaceus)等动物的消化道、脑、眼、心脏、肝等组织的细胞液中[16],对C-末端氨基酸具有广谱活性,但对C-末端Pro无活性作用,内切酶活性很弱[17]。二、羧肽酶的来源及其分布
根据来源分类,羧肽酶可分为动物羧肽酶、植物羧肽酶和微生物羧肽酶。在哺乳动物的不同组织中含有一系列的金属羧肽酶,以执行相应的生理功能。如胰腺羧肽酶A和B主要帮助消化食物、羧肽酶E选择性地加工生物活性肽、羧肽酶M选择性地参与肽类激素的加工、羧肽酶D(高尔基体中)和羧肽酶N(血浆中)参与肽和蛋白质的加工。对动物源羧肽酶的研究,主要
集中于人、猪、牛、小家鼠等。其中对人源羧肽酶的研究是为了解析羧肽酶在人体内的作用机制,以进行疾病的诊断、;而对小家鼠羧肽酶的研究则是作为研究模型,以解析人源羧肽酶生理机制。动物源羧肽酶的另一主要研究领域是应用于胰岛素、多肽的工业化生产中。目前,已从大麦、小麦、拟南芥、水稻,番茄、绿豆等多种植物中分离到丝氨酸羧肽酶(SCP)及丝氨酸羧肽酶类蛋白(SCPL)的基因和蛋白,除参与催化蛋白水解反应、植物损伤应答反应外,还在油菜素内酯、芥子酰基苹果酸等化合物的合成中发挥积极的作用。微生物羧肽酶包括微生物自身生产的羧肽酶及以微生物为宿主过量表达的羧肽酶。已有研究表明,酵母、假单胞杆菌(Pseudomonas)、曲霉等是微生物羧肽酶的主要来源,所生产的羧肽酶主要是丝氨酸羧肽酶,具有广泛的底物特异性。源于酵母细胞的羧肽酶Y是使用范围最为广泛的羧肽酶,用于将猪胰岛素B链末端的丙氨酞胺残基以苏氨酸残基取代,
暖气炉
以半合成人胰岛素(通过羧肽酶的转肽作用)、蛋白序列的测定等;而源于假单胞杆菌的羧肽酶G可用于甲氨蝶呤解毒、ADEPT。此外,研究发现存在于米曲霉、构巢曲霉、黑曲霉等真核微生物液泡中的羧肽酶,可用于多肽脱苦、生物活性多肽的延长或特异性修饰等。
三、羧肽酶的基因表达策略
目前,商业应用的羧肽酶主要来源于猪胰腺,价格比较昂贵,且存在一定浓度的蛋白酶。因此,研究人员将关注点转移到利用基因工程策略或方法在微生物宿主中异源表达和生产羧肽酶,展现了良好的应用前景。采用基因工程策略过量表达动物源羧肽酶主要用于进行基因测序、机理研究。测序结果(GenBank:CAA47732.1)表明,CPA含41 9个氨基酸,1-16位为信号肽,17-110位为前肽,111-419位为成熟肽, Zn2+结合位点为第114、117、248
粉底的原料
位,其催化位点及抑制剂结合位点均已测出。CPA为单一的多肽链,在体内首先合成出来的是无活性
的羧肽酶A(procarboxypeptidase A),以亚基双聚体或三聚体形式存在。经分辨率为0.2nm的X射线结构测定,羧肽酶分子呈椭圆球形,大小为5.0 nm×4.2nm×3.8nm。羧肽酶H又称羧肽酶E是由476个氨基酸组成,前25个氨基酸为信号肽(NCBI Reference Sequence:NP_0018 64.1),向斌等人已构建人羧基肽酶H(CPH)的原核表达系统,获得其重组蛋白,并初步应用于人CPH自身抗体(CPH-Ab)的检测[21]。人肥大细胞羧肽酶基因(NP_001861.2)编码417个氨基酸,与胰腺来源的羧肽酶同源性仅为36.2 4%。大鼠羧肽酶B基因(GenBank:AAA40872.1)序列大小为1245 bp,编码415个氨基酸,与人羧肽酶B(NM_001871.2)氨基酸序列的同源性为
75.78%。尽管已有多种植物源羧肽酶基因被测序,如拟南芥(GenBank: AED93104.1)、豌豆(GenBank:CAA92216.1)、莱茵衣藻(G enBank:EDP07567.1)等。然而,将植物源羧肽酶基因进行克隆表达并进行深入研究的案例很少。大量微生物源的羧肽酶基因已被测序,Yoshida等成功克隆并测定了编码串珠镰孢菌羧肽酶基因的全长cDNA长标蛋白氨基端融合了FLAG-t ag(6肽)标签,易于表达产物的检测。
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