中国热带医学2010年第10卷第9期CHINA TROPICAL MEDICINE Vol.10No.9September2010
［论著］
多嘧啶束结合蛋白相关剪切因子（Polypyrimidine tract-binding protein-associated splicing factor，PSF）是Patton等1993年首先鉴定出来的，由于PSF能与多嘧啶束结合蛋白（Polypyrimidine tract-binding protein，PTB）形成复合体，并参与前mRNA剪切，故被命名为PSF[1]。PSF是一种能与DNA和RNA结合的多功能蛋白，参与多种核内事件，如参与前mRNA 的剪切、DNA的解螺旋、参与双链断裂DNA修复、稳定配对DNA末端、参与转录调节等过程[2]。最近研究发现，PSF是新型核结构域“Paraspeckles”的组成成分[3]。PSF蛋白在核内功能的多样性已吸引学者们对其生物功能进行研究。为此，我们构建PSF基因真核表达载体并在小鼠肝癌细胞（Hepa1-6）内表达，观察PSF胞内定位及内毒素主要成分脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）对其定位的影响，为进一步研究PSF 在基因表达调控中作用及其生物功能提供重要的工具。 1材料和方法
1.1材料Bio-Peofll凝胶图像分析仪（Vilber Lourmat）；PCR 仪（Eppendorf）；IM T-2倒置显微镜（Olympus）；荧光显微镜（Leica）；RNeasy M ini Kit总RNA制备试剂盒、PolyFect脂质体转染试剂（QIAGEN）；ReverTra Ace-α-TM kit、限制性核酸内切酶、Ligation High DNA连接酶、Kod plus DNA
聚合酶（TOYOBO）；LPS、DAPI细胞核染料（Sigma）；鼠源抗血凝素（HA）标签抗体（Cell Signaling）；Alexa-Flour488标记羊抗鼠IgG抗体（M olecular Probes）；引物由上海英俊公司合成。pcDNA3-HA及pcDNA3质粒、Hepa1-6细胞由本室保存。1.2方法
1.2.1pcDNA3-PSF-HA载体的构建
发电机测试系统1.2.1.1小鼠肝脏组织总RNA的提取BALB/c小鼠断头处死后，迅速取出肝组织，液氮速冻下研磨。按QIAGEN总RNA制
PSF真核表达载体的构建及细胞内表达和定位
张秀娟1，王娟2，邓鹏2，姜勇2*
摘要：目的构建小鼠多嘧啶束结合蛋白相关剪切因子（PSF）真核表达载体并在小鼠Hepa1-6肝癌细胞内表达，观察PSF胞内定位及脂多糖（LPS）对其定位的影响。方法提取小鼠肝组织总RNA，RT-PCR扩增小鼠PSF基因的蛋白编码序列；采用基因重组技术将其亚克隆至pcDNA3-HA真核表达载体中，将该载体瞬时转染Hepa1-6细胞，通过细胞免疫荧光方法观察PSF的胞内表达及LPS对其定位的影响。结果酶切和DNA测序证明所构建质粒正确；
细胞免疫荧光可见PSF在Hepa1-6细胞内表达后只分布于细胞核，LPS刺激后PSF分布无明显变化。
结论成功构建PSF真核表达载体，为研究PSF在基因表达调控中作用及其生物功能提供了重要载体；进一步证实PSF为定位于细胞核的核蛋白。
关键词：多嘧啶束结合蛋白相关剪切因子；蛋白表达；蛋白定位
中图分类号：RQ291文献标识码：A文章编号：1009-9727（2010）9-1067-02
Construction of the eukaryotic expression vector of PSF and its expression and location in cells.ZHANG Xiu-juan，WANG Juan，DENG Peng，et al.（1Department of Physiology，Guangdong Medical College，Zhanjiang524023，Guangdong，P.R.China;2Key Laboratory of Functional Proteomics of Guangdong Province，Southern Medical University，Guangzhou510515，Guangdong，P.R.China）
Abstract：Aim To construct the eukaryotic expression vector of mouse polypyrimidine tract-binding protein-associated splicing factor（PSF）gene and express it in murine Hepa1-6hepatoma cell lines，and to observe the location of PSF and the effect of lipopolysaccharide（LPS）on the location.Methods Total RNA was extracted from mouse liver，and the code sequence of PSF gene was amplified by reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）.By gene recombination technique，the code sequence of PSF gene was subcloned into eukaryotic expressio
n vector pcDNA3-HA.The vector was transiently.Results The eukaryotic expression vector of PSF was correctly constructed，which had been proved by restriction enzyme digestion and DNA sequencing.The plasmids of PSF were expressed and located in nucleus in Hepa1-6 cells and the location of PSF had not evidently changed after LPS stimulation.Conclusion A eukaryotic expression vector of PSF gene has been successfully constructed，The plasmids will provide an important toll for the further study on the role of PSF in gene expression regulation and biological function.It is further confirmed that PSF is located in nucleus.
Key words:Polypyrimidine tract-binding protein-associated splicing factor;Protein expression;Protein location.
弹片开关基金项目：国家自然科学基金资助项目（NO.30670828）
作者单位：1.广东医学院生理学教研室，广东湛江524023； 2.南方医科大学广东省功能蛋白质组学重点实验室，广东广州510515.
作者简介：张秀娟（1970~），女，汉族，医学博士，讲师，主要从事细胞信号转导研究。
衣架制作
*通讯作者：E-mail:jiang48231@163
1067
备试剂盒（RNeasy M ini Kit）操作方法提取总RNA。
1.2.1.2RT-PCR扩增小鼠PSF基因蛋白编码序列以提取的总RNA为模板，使用TOYOBO公司ReverTra Ace-α-TM kit 反转录合成cDNA第一条链。取反转录产物2μL，PCR扩增小鼠PSF蛋白编码序列，PCR反应的上游引物：5'-ATAGGTACCATGTCTC GGGATCGGTTCCGGAGT-3'；下游引物：5'-ATACTCGAGAAATCGGGGTTTTTTATTTGGCCCTTC-3'；GGTACC为Kpn I酶切位点，CTCGAG为Xho I酶切位点。PCR反应条件为94℃、30s，55℃、30s，68℃、3min，35个循环。PCR扩增产物行1%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶图像分析系统进行照相。使用U-gene DNA凝胶回收试剂盒切胶回收PSF PCR 产物。
1.2.1.3pcDNA3-PSF-HA载体的构建及鉴定使用Xho I和Kpn I限制性内切酶对PSF RT-PCR扩增产物及pcDNA3-HA 质粒分别进行双酶切，酶切产物切胶回收后用Ligation High DNA连接酶，16℃连接16h；将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细菌，氨苄霉素平板筛选。挑取阳性克隆，摇菌过夜，提取质粒。重组质粒用Xho I和Kpn I限制性内切酶双酶切初步鉴定正确后，测序进一步验证所构建质粒的正确性。所构建的质粒命名为pcDNA3-PSF-HA，该质粒构建过程见图1。
图1pcDNA3-PSF-HA质粒构建示意图
1.2.2细胞培养及质粒转染Hepa1-6细胞株加含10%胎牛血清（FBS）的DM EM（Dulbecco’s modified medium）培养基，置于37℃、5%CO
2
培养箱中培养。将1×104个细胞铺入Petri 小皿中，待细胞长至70%~80%融合时进行转染。转染过程如下：将0.2μg pcDNA3阴性对照质粒或pcDNA3-PSF-HA质粒与23μl无血清OPTI-DM EM混匀后，加入1μl Polyfect转染试剂，混匀后室温孵育10min；孵育期间给细胞换液，然后向含有DNA-脂质体的离心管中加入150μl含10%FBS的DM EM 培养液，混匀后加入Petri小皿中，置于培养箱中培养24h，期间每8~10h给细胞换液或补液。
1.2.3实验分组和实验干预实验分为转染pcDNA3阴性对照组、转染pcDNA3-PSF-HA未加刺激组和转染pcDNA3-PSF-HA加LPS刺激组。上述实验每组设3个复孔。转染后24 h细胞换液，LPS刺激组向培养基内加入终浓度为1μg/mL的
LPS，对照组加入正常培养基，继续培养2h后进行细胞免疫荧光。
1.2.4细胞免疫荧光检测LPS刺激细胞2h后，弃培养基，用PBS漂洗细胞1次；4%多聚甲醛固定细胞15min，PBS漂洗细胞1次；0.1%Triton X-100/PBS室温下孵育5min，PBS缓冲液漂洗细胞3次；1‰硼氢化钠孵育5min；3%BSA/PBS室温封闭细胞1h，0.1%Triton X-100/PBS漂洗细胞1次；加入一抗（鼠抗HA单克隆抗体，1:100稀释），4℃孵育过夜，0.1%Triton X-100/PBS漂洗3次；加入荧光二抗（Alexa-Flour488标记的羊抗鼠IgG抗体，1:1000稀释），室温避光孵育1h，0.1%Triton X-100/PBS漂洗3次；200nmol/L的DAPI/PBS核染10min，0.1%Triton X-100/PBS漂洗2次，加入PBS封片后荧光显微镜下观察并照相。
2结果
2.1pcDNA3-PSF-HA载体的构建及鉴定以小鼠肝组织总RNA为模板RT-PCR扩增PSF，对扩增产物行1%琼脂糖凝胶电泳，在2000bp左右处出现单一条带，与2097bp PSF目的片段大小相符(图2A)。用Kpn I和Xho I对质粒pcDNA3-PSF-HA进行双酶后，1%琼脂糖凝胶电泳，可见约2.1kb和5.4kb大小条带，符合预期结果（图2B）。测序结果与GenBank所提供的小鼠PSF cDNA序列（GI:59709441）完全一致，证明质粒构建成功。
M，DNA marker；1.PSF的PCR扩增产物；2.pcDNA3-HA质粒；3，Xho I和Kpn I酶切后的pcDNA3-PSF-HA质粒。
图2PSF的PCR扩增及pcDNA3-PSF-HA质粒的酶切鉴定
2.2细胞免疫荧光检测PSF细胞内定位为明确PSF蛋白在细胞内表达、定位及LPS刺激对其细胞内定位的影响，分别将pcDNA3、pcDNA3-PSF-HA转染至Hepa1-6细胞，转染24h后，LPS刺激组给予LPS刺激细胞2h，进行细胞免疫荧光检测。结果如图3所示，转染pcDNA3阴性对照组细胞，未检测到绿荧光；转染pcDNA3-PSF-HA组细胞，静息状态下绿荧光只分布于细胞核，且在核膜四周分布较多；LPS刺激后，绿荧光仍分布于细胞核，说明PSF为分布在细胞核的核蛋白，LPS刺激后PSF蛋白胞内定位没有明显改变，无明显PSF的胞浆、胞核穿梭现象（图3）。北斗通信模块
3讨论
PSF是一种能与DNA和RNA结合的多功能核蛋白，PSF 在核内功能的多样性与其分子结构密切相关。Patton等对PSF 蛋白的分子结构研究发现，PSF的羧基末端含两个由80个氨基酸组成的、结构保守的RNA结合域，该结构域对RNA有较高的亲和力[1]，如PSF及其同源类似物p54nrb可与肿瘤坏死因子α（TNFα）mRNA3’非翻译区富含腺嘌呤/尿嘧啶元件（AU-rich elements，AREs）结合，调节TNFαmRNA的稳定及翻译过程[4]；p54nrb/PSF与基质蛋白3（matrin3）（下转第1070页）
A、B为转染pcDNA3阴性对照质粒的Hepa1-6细胞；C~F为转染pcDNA3-PSF-HA实验组质粒的Hepa1-6细胞；C、E为LPS未刺激及刺激后PSF融合蛋白的表达分布图像；
B、D、F分别为A、
C、E的DAPI核染后图像。
图3PSF在Hepa1-6细胞的表达与定位（400×）
组成p54nrb/PSF/matrin3复合体，该复合体组成核支架，参与残损RNA的核滞留[5]。PSF的氨基末端富含脯氨酸及脯氨酸，PSF 可能通过氨基末端实现蛋白与蛋白之间的相互作用，如p54nrb 与PSF常以同源或异源二聚体的形式参与多种核内过程[6]；PSF 与剪切体C的其他组分相互作用，参与前mRN
A剪切过程；PSF能够调节拓扑异构酶的活性，参与DNA的解螺旋、参与双链断裂DNA修复、稳定配对DNA末端。PSF不仅能与RNA结合，而且能与DNA结合，参与一些基因的转录活动，如PSF-NONO-NR5A1/SF-1复合体与CYP17启动子结合，调节CYP17基因基本的或cAM P依赖的转录活动[7]。PSF的羧基末端有一核定位信号肽，参与PSF的核定位。大多研究表明PSF 定位于细胞核，且与核膜有联系[8]；但M aria研究发现在CD3或CD28激活的Jurkat细胞，PSF在胞浆、胞核均有分布，并认为磷酸化的PSF能够将TNF mRNA从胞核运输到胞浆[9]。本实验观察到PSF分布于Hepa1-6细胞细胞核，且在核膜四周分布较多，这可能与该蛋白能与核膜蛋白整合，分布于核内膜有关。
LPS刺激Hepa1-6细胞后PSF分布无明显变化，未见PSF的
胞浆、胞核穿梭现象。目前，学者们已发现PSF是一种参与多种核内事件的多功能蛋白，但对其具体生物功能了解很少，仅Rubin等报道，PSF在斑马鱼的胚胎细胞的生存及分化具有重要作用[10]，因此，有必要对PSF的生物功能进行进一步研究。PSF真核表达载体成功构建和表达，将为进一步研究PSF在基因表达调控中作用及其生物功能提供重要基础和工具。
参考文献：
［1］Patton JG，Porro EB，Galceran J，et al.Cloning and characterization of PSF，a novel pre-mRNA splicing factor［J］.Genes Dev，1993，7（3）：393～406.伴热管线
［2］Shav-Tal Y，Zipori D.PSF and p54（nrb）/NonO--multi-functional nuclear proteins［J］.FEBS Lett，2002，531（2）：109～114.
自动车位锁［3］Bond CS，Fox AH.Paraspeckles:nuclear bodies built on long noncoding RNA［J］.J Cell Biol，2009，186（5）：637～644.
［4］BuxadéM，Parra JL，Rousseau S，et al.The Mnks are novel components in the control of TNF alpha biosynthesis and phosphorylate and regulate hnRNP A1［J］.Immunity，2005，23（2）：
177～189.
［5］Zhang Z，Carmichael GG.The Fate of dsRNA in the Nucleus:A p54nrb-Containing Complex Mediates the Nuclear Retention of Promiscuously A-to-I Edited RNAs［J］.Cell，2001，106（4）：465～475.
［6］Kuwahara S，Ikei A，Taguchi Y，et al.PSPC1，NONO，and PSF are expressed in mouse Sertoli cells and may function as coregulators of androgen receptor-mediated transcription［J］.Biol Reprod，2006，75（3）：352～359.
［7］Sewer MB，Nguyen VQ，Huang CJ，et al.Transcriptional activation of human CYP17in H295R adrenocortical cells depends on complex formation among p54（nrb）/NONO，protein-associated splicing factor，and SF-1，a complex that also participates in repression of transcription［J］.Endocrinology，2002，143（4）：1280～1290.
［8］Dreger M，Bengtsson L，Schneberg T，et al.Nuclear envelope proteomics：novel integral membrane proteins of the inner nuclear membrane［J］.
Proc Natl Acad Sci USA，2001，98（21）：11943～11948.
［9］BuxadéM，Morrice N，Krebs DL，et al.The PSF.p54nrb complex is a novel Mnk substrate that binds the mRNA for tumor necrosis factor alpha［J］.J Biol Chem，2008，283（1）：57～65.
［10］Lowery LA，Rubin J，Sive H.Whitesnake/sfpq is required for cell survival and neuronal development in the zebrafish［J］.Dev Dyn，2007，236（5）：1347～1357.
收稿日期：2010-01-20编辑：符式刚
物，因此采取综合性的防控措施就显得尤为必要。早期发现病例、隔离患儿、把好消毒关、加大健康教育力度四位一体的综合防控措施可以有效的降低本病的发病率，有效控制疫情。
参考文献：
［1］赵娟.儿童手足口病328例流行病学与临床特点分析［J］.实用医院临床杂志，2008，5（5）:49~50.［2］文茂林，杨明，宋俊伟，等.手足口病临床诊断病例157例临床分析［J］.中国医药指南，2008，16（23）:326~328.
［3］郭汝宁，张正敏，杨芬，等.广东省手足口病流行特征和危险因素研究［J］.中华流行病学杂志，2009，30（5）：530~531.
［4］卫生部.手足口病预防控制指南［S］.2008．
［5］刘建明，刘振业.崇礼县手足口病84例流行病学分析［J］.河北医药，2009，31（15）:1997~1999.
收稿日期：2010-02-23编辑：杜中华
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!（上接第1068页）
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议