一、实验目的：
学习酶的提取和纯化方法，并为后续实验提供一定量的蔗糖酶。
二、实验原理：
蔗糖酶（invertase）（β-D-呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的β—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。
本实验提取啤酒酵母中的蔗糖酶。该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶（external yeast invertase）, 其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶（internal yeast invertase），含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。rj45防水接头
三、试剂与器材：
1. 试剂：（1）啤酒酵母（2）二氧化硅（3）甲苯（使用前预冷到0℃以下）（4）去离子水（使用前冷至4℃左右）（5）冰块、食盐（6）1N乙酸（7）95%乙醇（预冷至－20℃）
2. 器材：（1）研钵1个（2）离心管3个（3）滴管3个（4）量筒50mL 1个（5）水浴锅1个（6）恒温水浴（7）烧杯100mL 2个（8）广泛pH试纸（9）高速冷冻离心机
四、操作步骤：
1. 提取
（1）准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中（两组做一个）。
（2）取适量（5－10g）二氧化硅放入研钵中研细。
三脚电感（3）称取5g干啤酒酵母放入研钵中，量取预冷的甲苯20mL缓慢加入酵母中，边加边研磨成糊状，约需30分钟，至酵母细胞大部分研碎。
（4）缓慢加入预冷的40mL去离子水，每次加2mL左右，边加边研磨，至少用30分钟。以便将蔗糖酶充分转入水相。
（5）将混合物转入4个离心管中（每组2个），平衡后，用高速冷冻离心机离心（4℃，12,000rpm，10min）。如果中间白的脂肪层厚，说明研磨效果良好。用滴管吸出上层有机相。
（6）用滴管小心地取出脂肪层下面的水相，转入另一个清洁的离心管中，两组平衡后，4℃，12,000rpm，离心10min。
（7）将清液转入量筒，量出体积（“粗级分I”），取出1.5mL放入小离心管中，冷冻保存，备下次实验测定酶活力及蛋白质含量。其余部分转入另一清洁离心管中。
2. 热处理
（1）预先将恒温水浴调到50℃，
（2）用广泛pH试纸检查清液（“粗级分I”）的pH，用1N乙酸将pH调至5.0。
（3）将盛有粗级分I的离心管稳妥地放入水浴中，50℃下保温30分钟，在保温过程中不断轻摇离心管。
（4）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，平衡后4℃，12,000rpm，离心10min。
（5）将上清液转入量筒，量出体积（称为“热级分II”）。取出1.5mL放入小离心管中，冷冻保存。
3. 乙醇沉淀
将热级分II转入小烧杯中，放入冰浴中，逐滴加入等体积预冷至－20℃的95%乙醇，同时轻轻搅拌，共需30分钟，再在冰盐浴中放置10分钟，以沉淀完全。于4℃，12,000rpm，离心10min，倾去上清，并滴干。用3mL，0.02mol/L，pH4.9乙酸缓冲液将沉淀溶解，平均分成两份（称为“醇级分Ⅲ”），冷冻保存。
一、实验目的：
了解凝胶层析的原理及其应用；初步掌握凝胶层析技术。
二、实验原理：
凝胶层析又称分子排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。它广泛地应用于分离、提纯、脱盐等，而测定蛋白质的分子量也是它的重要应用之一。
凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状颗粒物质。用它来进行物质的分离，主要是根据多孔凝胶对不同半径的分子（近于球形）具有不同的排阻效应实现的。亦即它是根据分子大小这一物
理性质进行分离纯化的。对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走。分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入凝胶中较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。 三、器材与试剂
1. 试剂（1）未知蛋白质样品（2）0.02mol/L，pH4.9乙酸缓冲液（3）蓝葡聚糖-2000
2. 器材（1）玻璃层析柱(16mm×400mm) （2）恒流泵（或下口恒压贮液瓶）（3）自动部分收集器（4）紫外分光光度计（5）250mL烧杯
四、实验操作
（一）凝胶的溶胀
数字重阵称取10g Sephadex G-75 于250mL 烧杯中加入洗脱液100mL，置室温溶胀2～3天，反
复倾泻去掉细颗粒，煮沸（可去除颗粒内部的空气及灭菌）。
（二）装柱
山药去皮机单水合肼取洁净的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。测定凝胶柱总体积（Vt）。在柱中注入洗脱液（约1/3柱床高度），将凝胶浓浆液缓慢倾入柱中，待凝胶沉积约1cm ～2cm 高度后打开出水口，流速一般用3mL～6mL / 10 min。胶面上升到柱顶端约5cm处则装柱完毕，注意
装柱过程中凝胶不能分层。然后关闭出水口，静置片刻，等凝胶完全沉降，则接上恒流泵，用1～2倍床体积的洗脱液平衡柱子，使柱床稳定。
（三）加样和洗脱
淀粉牙签吸去柱上端的洗脱液（切不要搅乱胶面，可覆盖一张滤纸或尼龙网）。打开出水口，使残余液体降至与胶面相切（但不要干胶），关闭出水口。用细滴管吸取1.5 mL醇级分Ⅲ小
心地绕柱壁一圈（距胶面2mm左右）缓慢加入，然后迅速移至柱中央慢慢加入柱中，打开
出水口（开始收集！），等样品溶液渗入胶床后，关闭出水口，用少许洗脱液加入柱中，渗入胶床后，柱上端再用洗脱液充满后用3.0mL/10分钟的速度开始洗脱。洗脱液由部分收集器
收集。用分光光度计逐管测定A
280，以 A
280
为纵坐标，Ve（洗脱体积）为横坐标画出洗脱曲
线。
（四）各管洗脱液酶活力的定性测定
在点滴板上每一孔内，加一滴0.2mol/L pH4.9的乙酸缓冲液，一滴0.5mol/L蔗糖和一滴洗脱液，反应5分钟，在每一孔内同时插入一小条尿糖试纸，10～20min后观察试纸颜的变化。用“+”号的数目，表示颜的深浅，即各管酶活力的大小。合并活性最高的2~3管，量出总体积，倒入10个小试管，用保鲜膜封口，冰冻保存（“柱级分IV”）。
注意：实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次实验使用，严禁将凝胶丢弃或倒入水池中。
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