【实验目的】
2.初步掌握小白鼠睾丸细胞染体的玻片标本制作方法。 3.观察动物细胞染体的数目和形态。
【实验原理】
染体是遗传物质的载体，它具有种属特异性，通常不同物种以不同亚种的核型是不同的。通过对各种动物染体核型的研究可以丰富物种的信息系统，对了解物种的遗传变异进化以及物种的分类均有一定的意义。
真核细胞染体的数目和结构是重要的遗传指标之一。制备染体标本是细胞遗传学最基本的技术，优良的染体制片是进行染体显带、组型分析、原位杂交等的先决条件。
染体的制备在原则上可以从所有发生有丝分裂的组织和细胞悬浮液中得到。最常用的途径是从骨髓细胞、血淋巴细胞和组织培养的细胞中制备染体。小型动物的染体制片最好最有效的材料就是骨髓组织。
骨髓细胞中，有丝分裂指数相当高，因此可以直接得到中期细胞而不必象淋巴细胞或、其它组织那样要经过体外培养；对大型动物通常采用对骨骼、脊或胸骨穿刺术吸取红骨髓，小型动物多采用剥离术取股骨以获得骨髓细胞。
对于小鼠精巢染体标本的制作，一般包括以下几个要点:
1. 用一定剂量的秋水仙素破坏纺锤丝的形成，使细胞分裂停滞在中期, 使中期染体停留在赤道面处;
2. 用低渗法使将细胞膨胀, 以至于在滴片时细胞被胀破, 使细胞的染体铺展到载玻片上;
3. 空气干燥法可使使细胞的染体在载片上展平, 经Giemsa染后便可观察到染体的显微图象。
制作染体标本的先决条件
1.细胞具有旺盛的分裂能力
选择活跃的组织：胸腺，骨髓，睾丸，小肠
施加药物使细胞分裂：PHA
2.设法得到大量的中期细胞：秋水仙素
A．PHA：粗细胞分裂，使淋巴细胞返幼，变为淋巴母细胞
B．折叠耳机秋水仙素：破坏微管装配，使纺锤体不能形成，使大量细胞停止在分裂中期。
C．低渗作用：水进入细胞内，细胞内容空间变大，染体间的距离拉大，易于染体展开
D．空气干燥：使细胞和染体展开
E．固定：用甲醇：冰醋酸=3:1作用使蛋白质变性，对染体内的组蛋白讲，变性后硬度增加，保持了染体的“及时形态”，对细胞膜蛋白讲，变性使细胞膜硬度增强，形成屏障作用，防止了细胞内物质外溢和丢失。
染体组型又名核型，是指根据染体的长度、形态和着丝粒的位置将中期染体依照所规定的标准顺序和组次予以系统排列而成的模式图，它代表了一个个体或物种的染体特征。进行染体组型主要依据有以下几个参数: 1. 相对长度(relative length): 指单个染体的长度与包括X染体在内的单倍体染体总长度之比，相对长度=单条染体的长度/(单倍体常染体+X染体)的总长度×100%。
2. 臂指数(arm index): 指染体长臂与短臂的比率，臂指数=长臂/短臂。
3. 着丝粒指数(centromere index): 指短臂占整个染体长度的比率，着丝粒指数=短臂/整个染体长度×100%, 该比率决定了着丝粒在染体中的相对位置。
4. 染体的臂数: 对于端部着丝粒染体，臂数为1，其它为2。根据Levan(1964)所制定的人类染体标准，臂指数在1.0~1.7之间的染体为中央着丝粒染体，在1.7~3.0之间为亚中央着丝粒染体，在3.0~7.0间为亚端部着丝粒染体，大于7.0为端部着丝粒染体；着丝粒指数在50.0~37.5之间的染体为中央着丝粒染体，在37.5~25.0之间为亚中央着丝粒染体，在25.0~12.5之间为亚端部着丝粒染体，小于12.5为端部着丝粒染体。
【肖秀丹实验材料】
1.材料：小白鼠。
2.试剂：秋水仙素、0.3%KCl溶液、甲醇、冰醋酸、吉姆萨原液。
3.器械：手术刀、手术剪、镊子、试管架、解剖盘、注射器、针头、吸管、离心管、离心机、玻片(冰片)、天平、试镜纸、吸水纸、、烧杯、水浴锅。
【实验步骤】
1.取雄性小鼠以每克体重4ug注射秋水仙素，经14-16小时后，断头法杀死小鼠，取出睾丸，用生理盐水（0.9%的NaCl）吸去血污。
2.放入装有1ml 0.3% KCl 液的小烧杯中剪碎（呈乳白）。
3.用铜网过滤到刻度离心管中，再加0.3% KCl 液至4ml。
4.37℃ 静置30分钟，进行低渗处理。
5.以800-1000转/分 离心8分钟。
6.弃上清液，加入2ml甲醇、冰醋酸固定液（3:1），并用吸管吹气，轻轻打散细胞，固定8min。
7.再以800-1000转/分，离心8min。
8.弃上清液，加1ml固定液，制成细胞悬液，固定5min。
9.取洁净的低温预冷载玻片，距10-15cm高度滴下2-3滴细胞悬液，从一边轻轻吹气，并随时轻轻敲打，以使细胞均匀分布和促使染体展开。
10.用滤纸擦去载玻片上多余液体，空气干燥或文火干燥，染。
【实验结果】
第一张标本观察结果如下：
图一 染体制片一观察（10 x40）
第二张标本观察如下：
图二 染体制片二观察（10 x40）
一张标本的普遍染体没有展开，中期的较少，实验未到恰好处于中期的染体，由于细胞间期时间长，中期时间短，所以多为近中期细胞染体；并且视野中都是细胞碎片，
染体大多聚集在一起，说明没有“摔”好，染体还没有分开。
第二张图片应靠近中期，基本完全展开。
【实验结果分析与注意事项】
镜检的结果为：所观察到的染体条数为40条。
1.在实验中造成染体标本制作不佳的原因有：
秋水仙素用量太多或处理时间过长，会导致染体的过分凝缩或着丝点裂解，最终会引起染体形态不正常，甚至被破坏或溶解；低渗处理不好。低渗液的量、处理时间均与细胞的数量有关。低渗过度，细胞会破裂；低渗不足则染体在一起，分散不开；离心速度或离心时间的影响。离心速度过大或离心时间过长，则会引起细胞破裂；反之，离心速度过小或离心时间过短，则细胞沉降不下来，则会引起大量细胞的丢失quantumas；固定液要随用随配，固定彻底后再打散细胞团块，否则细胞容易破碎，染体分散亦受到影响；载玻片有油脂或冷却不够，则会影响染体的附着和铺展；用吸管吹散细胞时用力必须尽量轻柔，用力过大则会造成细胞破裂，而染体也会弥散在溶液中，在随后的离心中将会丢失；滴片时
的高度很重要，高度过低细胞不会破裂；过高则染体过于分散甚至丢失，无法辨别出染体的准确数量。
压铸机料筒的设计2.本实验中，对由小鼠精巢而来的染体标本进行镜检时, 发现染体数有的为40条，而有的则为20条，为什么？拥有20条染体的单倍体细胞会是什么细胞？
有40条染体的可能是小鼠的体细胞、精原细胞。有20条染体的可能是已完成第一次减数分裂的精细胞或精子。之所以同时出现40条和20条染体，是因为精巢里存在大量正在进行有丝分裂和减数分裂的细胞，用秋水仙素处理后，所有细胞均停止分裂。
【注意事项】
1.有足够量的细胞，在处理小鼠的睾丸时，尽量不要留下较大的组织块，那样会使单个细胞较少，不利于观察
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2.滴片时注意，保持一定高度，准确滴在玻片上，不能重叠，用嘴向一个方向吹气（避免用力，否则会被吹到一端），有助于染进一步伸展。
3.自来水冲洗要掌握时间，避免标本褪。
4、低渗与离心等步骤的操作要轻。
太阳能沼气池5.染的时间可稍微长一些，防止染不充分
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