10+单细胞生信文章，探索肿瘤微环境在免疫前后及不同疗效之间的差异，可扩展推广到自己的研究中！ 影响因子：12.3
研究概述：
肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，非小细胞肺癌（NSCLC）约占肺癌病例的85%。通过免疫检查点阻断（ICB）进行癌症免疫是没有已识别的驱动基因突变的高级NSCLC的一线，但大多数患者对免疫疗法或获得耐药性，其潜在机制仍有待探索。作者进行了3名前和12名后非小细胞肺癌（NSCLC）患者的约92,000个单细胞的转录组，这些患者接受了新辅助PD-1阻断和化疗，后样本根据病理反应分为两组：主要病理反应（MPR；n = 4）和非MPR（NMPR；n = 8）。作者发现独特的诱导的癌细胞转录组与临床反应有关，揭示了免疫期间中性粒细胞的异质性，并确定MPR患者中老年CCL3+中性粒细胞子集有所减少。预计老化的CCL3+中性粒细胞会通过正反馈回路与SPP1+ TAM相互作用，导致反应不佳。新辅助PD-1阻断与化疗相结合，导致与反应相关的不同NSCLC肿瘤微环境转录组。尽管受联合的患者样本量受到限制，但这项研究提供了新的 生物标志物来预测反应，并提出了克服免疫耐药性的潜在策略。
本文本质上是分析不同组别的肿瘤微环境（疾病微环境）的差别。对应到我们自己的研究中，可用于疾病vs正常，处理组vs对照组等等。值得借鉴！需要做类似的生信分析可以咨询小编！
研究结果：
一、PD1阻断期间NSCLC结合化疗的scRNA-seq分析
1.从15名患者的单细胞测序中收集了15个肿瘤样本，从21名患者中收集了21个前肿瘤样本，用于普通转录组测序（图1A）。所有细胞降维聚类确定了26个聚类（图1B），在不同患者没有观察到明显的批次效应。根据相应的典型标记基因的表达，将26个簇注释成T细胞、NK细胞、B细胞、骨髓细胞、中性粒细胞、浆细胞、浆细胞质细胞DC（pDC）、肥大细胞、基质细胞（纤维细胞/内皮细胞）和上皮细胞（图1B）。
2.作者计算了TN（Treatment-naïve）、MPR和NMPR患者中不同细胞类型的分数（图1C，D）。MPR患者的T细胞、NK细胞和B细胞的比例有所增加，由于样本量有限，没有
获得阳性P值（图1D）。作者在10个后手术肿瘤组织（3个MPR和7个NMPR，对应scRNA-seq样本）和另外5个未的手术肿瘤组织中进行了免疫组织化学（IHC）染。IHC染验证了MPR样本中T（CD3+）和B（CD20+）细胞丰度的增加，但NK（CD56+）细胞除外（图1E、F）。这与之前的报告一致，即T和B细胞扩张与对ICB的更好反应有关。TME的髓细胞富集，但在TN、MPR和NMPR患者之间没有明显差异（图1D）。
二、联合后pCR患者正常肺上皮细胞的增加和残留癌细胞的检测
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1.首先将上皮细胞重新聚类为10个种，并根据拷贝数变化（CNVs）分离恶性和正常细胞（图2A、B）。集E0_DST、E3_PCNA、E4_TOP2A、E7_SERPINB9和E1_KRT17的亚的CNV评分高于其他集，并被推断为恶性细胞（图2B）。正常簇被注释为肺泡细胞，纤毛细胞，基于传统标记的基底上皮细胞（图2A，B）。后，特别是MPR患者中，肺泡细胞（E5_SFTPA2）、球杆细胞（E8_SCGB1A1）和纤毛细胞（E9_TPPP3）的分数增加。这表明，联合在消除恶性细胞后促进了正常上皮细胞的扩张。正常的上皮细胞可能有助于重建前一个肿瘤床的正常肺结构。
运动地垫三、恶性细胞的独特分子特征区分了MPR和NMPR
1.在TN、MPR和NMPR患者中进行了差异表达分析。MPR患者的恶性细胞高度表达了CX3CL1、CD74和主要组织相容性复合物II类（MHC-II）基因（图2C）。Aldo-Keto还原酶家族（AKR1B1/10和AKR1C1-3）中的酶在NMPR患者的癌细胞中高度表达（图2D）。基因集变异分析（GSVA）显示，在联合后，NMPR患者的恶性细胞中雌激素反应途径被上调（图2E）。数据表明，后NMPR患者的雌激素代谢可能异常高。
2.使用非靶向代谢组学来检测基线（新辅助前）、（第一或第二周期，每周期3周，共2-4周期）和后（最后一次给药后4周，手术前收集血液样本）中10名MPR（30%女性）和14名NMPR（7%女性）患者（图2F）。与期间的基线相比，NMPR患者的β-雌二醇水平显著升高（图2G）。当将患者从scRNA-seq队列中移除时，结果相似。血清中雌激素水平升高可能反映了对免疫反应不佳。
3.作者探索了NSCLC细胞系的数据，发现NMPR特征与17-AAG（一种HSP90的抑制剂）的IC50（最大抑制浓度的一半）呈负相关（图2H），表明NMPR患者的癌细胞可能对17-AAG敏感。据报道，17-AAG通过破坏HSP90来抑制雌激素信号传导。
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四、联合后抑制性Tregs的细胞毒性T/NK细胞扩张和减少的程度与病理反应呈正相关
1.由于T细胞是TME中肿瘤浸润最丰富的淋巴细胞，作者重新聚集了T/NK细胞，并确定了14个集（图3A、B）。后，细胞毒性和耗竭细胞特征都显著增加（图3C，D）。这相当于后所有CD8+ T簇的派系增加（图3E）。相对于TN患者，后样本中Tem（CD8_GZMK）和Trm（CD8_GZMB）以及循环效应T细胞（CD8_STMN1）的分数增加，在MPR患者中增加更明显（图3E）。
2.集NK_FCGR3A是细胞毒性细胞最具代表性的细胞，通过FCGR3A（CD16a）、FGFBP2和CX3CR1的表达与NK_KLRD1细胞区分开来（图3B）.鉴于CX3CL1在MPR患者癌细胞中的表达（图2C），NK_FCGR3A细胞可能被CX3CL1招募到TME中。细胞-细胞相互作用分析显示，癌细胞和NK_FCGR3A细胞之间的CX3CL1-CX3CR1相互作用在MPR患者中显著丰富（图3F）。
3.与TN患者相比，MPR和NMPR患者的原始Tregs（Treg_SELL，表示SELL和LEF1）的比例都有所下降（图3E）。MPR患者始终显示Treg耗竭的特征低于NMPR患者（图3G）。
太阳能安全帽五、促进记忆T细胞分化为效应表型
1.联合后，记忆CD8+ T细胞（CD8_IL7R）减少，而效应T细胞增加（图3E）。这表明，可能会直接诱导记忆T细胞激活成细胞毒性表型。作者进行了轨迹分析，从Tem（CD8_GZMK）到Trm（CD8_GZMB）到Tex细胞监测到一个过渡路径（CD8_HAVCR2；图3H）。
2.划定CD8_IL7R细胞的分布时，作者注意到CD8_IL7R细胞可以分为2个阶段（图3I）。CD8_IL7R细胞在静止阶段高度表达NR4A1-3，而细胞毒性相关基因（GZMA、NKG7和CCL5）和MHC-II基因（CD74和HLA-DRA）在激活阶段被上调，后激活细胞的比例增加，MPR中激活的CD8_IL7R细胞比NMPR样本多（图3I）。
六、FCRL4+FCRL5+记忆B细胞预测对ICB的反应，并通过激活CD4+ T细胞来促进免疫
1.作者将B细胞重新聚类为7个亚（图4A）。记忆B细胞在联合后普遍减少，但FCRL4+FCRL5+ B细胞（B4_FCRL4），定义为“非典型记忆B细胞”，在MPR患者中表现出略有增加的趋势（图4B）。免疫荧光染表明，FCRL4+FCRL5+细胞的MPR比NMPR样本更丰富，CD20+ B单元格聚合在TLS和FCRL4+FCRL5+ B单元格中，位于TLS的中心
（图4D）。
2.在ICB联合化疗之前，MPR患者的标记得分明显更高（图4E）。对两个独立的黑素瘤队列的已发布数据集进行了类似的分析。B4_FCRL4特征在预测免疫反应方面也表现良好。在两个队列中，在前后，B4_FCRL4的标记（完全反应或部分反应）高于非反应者（稳定疾病或进行性疾病）（图4F）。较高的B4_FCRL4特征与之前发表的“黑素瘤队列2”的生存率提高有关（图4G）。
3.作者预测了驱动靶细胞转录组变化的配体。FCRL4+ FCRL5+ B细胞可以通过配体-受体对与Tfhs相互作用：CXCL13-CXCR5、CD40-CD40LG和CD28-CD86.Tfhs和CD8+ T细胞之间的IL21-IL21R相互作用显著丰富（图4H）。
七、CX3CL1招募了单核细胞，并预测免疫反应
1.TME中的髓样成分表现出显著的异质性，因此根据典型标记基因被分为11个簇，包括2个单核细胞亚型、6个巨噬细胞亚型和3个DC亚型（图5A）。Mono_CX3CR1高表达单核细胞标记（FCN1、VCAN、S100A8和S100A9）、原始标记（SELL）和较低的MHC-II分子
（图5B，C），代表“原始”的状态。Mono_VEGFA的单核细胞标记表达较低，巨噬细胞标记（MRC1、CD163和MSR1）和MCH-II分子的表达较低，这表明存在“前巨噬细胞”状态（图5B，C）。轨迹分析证实，Mono_VEGFA是原始单核细胞和巨噬细胞之间的中间表型（图5D）。Mono_VEGFA高度表达的VEGFA，一种促血管生成因子，反映了免疫抑制表型（图5B，C）。MPR患者的Mono_VEGFA细胞减少（图5E），VEGFA的表达在MPR患者中受到下调。烧镁砖
2.Mono_CX3CR1细胞在MPR患者中的丰度增加（图5E）。Mono_CX3CR1细胞也表达了高CFP（图5C）。CFP的表达与TCGA-LUAD患者的凋亡特征显著相关，MPR患者的Mono_CX3CR1细胞的CFP表达明显高于TN和NMPR患者（图5F，G）。
3.使用普通转录组测序数据预测ICB反应。在验证队列中的MPR患者和两个独立黑素瘤队列的响应者中观察到更高的Mono_CX3CR1特征（图5H，I）。较高的Mono_CX3CR1特征与黑素瘤数据集2的存活率提高有关（图5J）。细胞-细胞相互作用分析显示，CX3CL1-CX3CR1对在Mono_CX3CR1细胞和MPR患者的癌细胞之间显著富集（图5K）.mirna靶基因分析
七、联合扩大了组织常驻巨噬细胞，将TAM重新编程为M0表型，并抑制了MPR患者
的免疫抑制功能
1.Macro_FABP4细胞是组织常驻肺泡巨噬细胞（AM），具有典型AM标记（FABP4、MCEMP1和MARCO；图5B）。与其组织修复功能一致，Macro_FABP4 AM尽管在MPR患者中程度更高，后患者中也显著升高（图6A）。
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