203
2021, 37 (3)
中国人兽共患病学报
Chinese Journal of Zoonoses
DOI ：10.3969/j.issn.1002-2694 2021.00.027
-论著.
曹纹侨】，李 错1，喻 云】，谭青青】，陆 合张 静12
摘要：目的 本研究旨在了解弓形虫感染小鼠肺组织转录组的变化.方法 取感染和未感染弓形虫的小鼠肺组织提
取总RNA 并制备c DNA 文库，采用BGISEQ -500测序平台对文库进行高通量转录组测序.从测序结果中筛选差异表达基因 (differentially expressed genes, DEGs)，并随机筛选 10 个差异表达基因利用实时荧光定量 PCR (quantitative real time PCR , q-PCR )对其表达量进行验证.对总的差异表达基因进行Gene On to logy (GO )富集分析、Kyoto Enc y c l opedia of Genes and Ge-
nomcs(KEGG )富集分析和关键驱动基因(Key driver gene analysis , KDA )分析.结果 总共筛选到286个差异表达基因，其
中上调基因231个，下调基因52个.随机筛选的10个差异表达基因的q-PCR 结果与测序结果的变化趋势一致，说明转录组
测序结果可靠.GO 分析结果显示差异表达基因主要与免疫和细胞因子相关.KEGG 富集分析结果显示与细胞因子相关的
通路：细胞因子与细胞因子受体互作和趋化因子信号通路被显著富集，分别为Top1和Top1.对两条通路中显著富集的21
个差异表达基因进行KDA 分析，共筛选到10个关键驱动基因:Tnf 、Cx c 110、Il 10、C c 12、fng 、Cx c 19.Cx c r 2、C c r 5、C c 4和C c 17。
结论 在弓形虫感染小鼠的肺组织中,Tnf 、Cxcll0、I110、Ccl2、ing 、Cxcl9、Cxcr2、Cr5、Ccl1、Cc
l7可能发挥了重要作用.
关键词：刚地弓形虫；肺；关键驱动基因；RNA-scq ； q-PCR
中图分类号汨382.5 文献标识码:A 文章编号：1002-2694(2021)03 —0203 —09
Transcriptomic analysis of mouse lungs ofter acute
infection with Toxoplasma gondii
CAO Wen-qiao 】,LI Kai 1 ,YU Yun 1 ,TAN Qing-qing 1 , LU He 1'2 ,ZHANG Jing 12
(1 .Molecular Medicine and Cancer Research Center of Chongqing Medical University , Chongqing 100016, China ;
2.Department of pathogenic biology of basic medicine college Chongqing medical university , Chongqing 100016,C/ia )
Abstract ； The purpose of this study was to investigate the transcriptomic changes in mouse lungs infected with Toxoplas-
magondi .TotalRNA wasextractedfrominfectedanduninfected mouselungsamples ,andacDNAlbrary wasconstructed fromthemRNA ,andthensubjectedtohighthroughputRNAsequencing (RNA-seq )wththeBGISEQ-500platform.Tendf- ferentia l yexpressedgenes (DEGs )wererandomlyselectedforverfcatonwthquanttatvereal-tmePCR (q-PCR ).GeneOn-
tology (GO) enrichment analysis , Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) enrichment analysis and key driver
gene analysis (KDA) were performed on the sequencing data. A total of 286 DEGs were identified , among which 231 were up-
regulatedand52weredown-regulated.Q-PCRexperimentsshowedconsistenttrendswiththeRNA-seqresults ,indicatngthat theRNA-seqdatawererelable.MostoftheGOtermswereassociatedwithimmuntyandcytokines ;KEGGenrichmentanaly-
sisshowedthatthetermscytokine-cytokinereceptorinteractonandchemokinesignalngpathway weresignfcantlyenriched ,
< 'Top 1 and Top1 , respectively. KDA analysis was performed on the 21 DEGs that were significantly enriched in cytokine re
传送侦测怎么做ceptor interaction and chcmokine signaling pathway , and ten key driver genes were identified from the 21 DEGs ： Tnf Cxcll0,
1110, Ccl2 , Ifng , Cxcl9, Cxcr2 , Ccr5 , Ccl1 , and Ccl7. Collectively , our research revealed ten key driver genes that may play
重庆市科学技术委员会资助(No.cstc2015jcyjA10017)；重庆市教委
资助(No.KJ 1400210)
通讯作者：张 静 ‘Email ： ********************；
ORCID ： 0000-0002-0947-6895
作者单位：1.重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心，重庆
400016；
2.重庆医科大学基础医学院病原生物学教研室，重庆
400016
an important role in mouse lungs after acute Toxoplasma
gondi infection.
Keywords : Toxoplasma gondii ; lung; key driver gene ; RNA-seq ;q-PCR
Supportedbythe Chongqing Scienceand Technology Com- mission ( No. cstc201 5jcyj A 10017.) ； the Chongqing Education
Commission (No. KJ 1100210)
204中国人兽共患病学报2021,37(3) Corresponding author：Zhang Jing,Email：********************
刚地弓形虫是一种专性细胞内寄生的机会性致病原虫，可感染几乎所有恒温动物［1］，全球约1/3的人口感染弓形虫机体的免疫状态和弓形虫感染的结局密切相关.免疫力正常的人中，弓形虫感染多为隐性感染.但是免疫力低下或免疫力受损患者的弓形虫隐性感染可以被激活，从而引起严重的弓形虫病
（toxoplasmosis）。由于弓形虫在全世界范围内的高感染率以及近年来艾滋病等的流行，使弓形虫病严重威胁到特殊人的健康.
肺部为弓形虫病最常累及的器官之一弓形虫肺炎（Toxoplasma pneumonia）是由刚地弓形虫引起的肺部感染，是一种非典型肺炎.1963年Ludldam等报道了9例肺部感染病例，其中6例为弓形虫性肺炎.弓形虫肺炎的病理表现有间质性肺炎、坏死性肺炎、肺实变和胸腔积液⑴.由于该病发展迅速，病情严重，病死率高，临床无特异表现，所以常常被误诊和漏诊，从而使患者失去有效的.
已知细胞因子和细胞因子受体在宿主抗弓形虫免疫当中发挥重要作用，如IFN-、II-8［7］、CCL2［］、CCR5皿等.但是弓形虫感染肺组织后，哪些细胞因子发生了变化并影响了肺炎的发生发展目前还不明确.本研究利用高通量转录组测序和生物信息学分析，比较了感染弓形虫前后小鼠肺组织转录组的变化.通过分析筛选到两条与细胞因子相关的通路:Cytokine-cytokine receptor interaction和Chemokine singnaling pathway信号通路.从这两条通路中显著富集的24个基因中筛选得到10个关键驱动基因，它们均是胞因子或细胞因子受体。这些关键驱动基因有望为弓形虫肺炎的诊断和提供新的靶标.
1材料与方法
1.1材料
1.1.1刚地弓形虫和小鼠刚地弓形虫RH株为本实验室连续传代培养，纯化收集并保存在液氮中。BALB/c小鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，合格证号:SCXK（湘）2019-0004.
1.1.2主要试剂和仪器TRIZOL，美国-gen公司生产.，异戊醇，异丙醇，中国西陇化工生产.DNA提取试剂盒，中国天根生化科技（北京）有限公司生产.荧光定量PCR试剂盒，中国宝生物工程（大连）有限公司生产.BGISEQ-500平台，中国华大基因生产.Bio Rad CFX96Real-time PCR Detection system，美国伯乐公司生产.
1.2方法
1.2.1急性弓形虫感染小鼠模型的构建及肺组织样本采集BALB/c小鼠6只，雌性,8周，随机分为两组，每组3只.按腹腔注射弓形虫速殖子的方法构建急性弓形虫感染小鼠模型.实验组每只小鼠接种含800个速殖子的弓形虫悬液0.2mL，对照组注射生理盐水0.2mL.当小鼠出现典型弓形虫感染症状时，处死小鼠.在无尽可能外源性RNA酶和DNA酶条件下，迅速取出小鼠肺组织，在生理盐水中快速洗去血液，将组织剪成黄豆大小，立即放进液氮中冻存备用.取实验组和对照组小鼠肺组织提取DNA，根据文献［0］获得弓形虫B1基因引物序歹U,F：5，-TCTTTAAAGCGTTCGTGGTC-3,,R：5，-GGAACTGCATCCGTTCATGAG-3,，从小鼠肺组织DNA中扩增长度为194bp的弓形虫B1基因片段，验证弓形虫感染小鼠模型是否构建成功.
1.2.2总RNA提取取实验组和对照组小鼠肺组织，每份样品约50mg，在液氮保护下将肺组织研磨成粉末，采用TRIZOL-Reagent按照说明书操作提取小鼠肺组织总RNA.采用Fragment,analyzer检测总RNA浓度和RNA的完整性指标：28s/18s和RNA质量指数（RNA quality number,RQN）.
1.2.3mRNA纯化分离及cDNA文库构建取消化的总RNA样品，适温变性打开其二级结构，使用oligo（dT）磁珠富集mRNA。在mRNA中加入打断试剂，将mRNA片段化.以片段化后的mRNA 为模板，依次合成第一链cDNA和二链cDNA.配制反应体系，修复双链cDNA末端，并在3'末端加上A碱基，配制接头连接反应体系，使接头与cDNA连接.配制PCR反应体系，对连接产物进行扩增，并回收产物.将PCR产物变性为单链，配制环化反应体系，得到单链环形产物，消化掉未被环化的线性DNA分子，得到最终的文库.
1.2.4文库质检和高通量测序使用Agilent.2100 Bioanalyzer检测cDNA文库的片段大小及浓度。质检合格后，单链环状DNA分子通过滚环复制，形成一个包含200多个拷贝的DNA纳米球（DNB）将得到的DNBs采用高密度DNA纳米芯片技术，加到芯片上的网状小孔内.采用BGISEQ-500测序平台，通过联合探针锚定聚合技术（cPAS）进行测序，得到150bp的测序读长.
1.2.5差异表达基因的筛选和功能分析为保证
3期曹纹侨，等：弓形虫急性感染小鼠肺组织的转录组分析205
结果的可靠性，在数据分析之前，使用SOAP2[11]将Raw reads过滤得到Clean reads。Clean reads的低质量碱基序列不超过20%，接头污染序列不超过5%，未知N含量过高序列不超过5%.使用HI-SAT2(v2.0.4)⑵将Clean reads比对到小鼠参考基因组(nm10).使用Bowt.ie2(v2.2.5)[13]将Clean reads比对到参考编码基因集，使用RSEM(v1. 212)4计算基因的表达水平。使用DESeq2(v1.4.
5)[15]，以Log2fold changel$3,Q value(adjustedp value)<0.01的标准筛选差异表达基因。使用Heat map builder[6绘制差异基因表达量聚类热图。对差异表达基因进行GO富集分析、KEGG富集分析和KDA分析，差异显著性阈值设定为Q value<0.05。
1.2.6差异表达基因实时荧光定量PCR验证取步骤1.2.2提取的小鼠肺组织总RNA，将其逆转录为cDNA，以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR，引物见表1.实时荧光定量PCR反应体系构成：TB Green Premix Ex Taq H(2X)12.5“L、上下游引物各1“L(终浓度为0.4“mol/L)、cDNA模板2“L、去离子水&5“L.扩增循环参数：预变性95C30s；变性95C5s，退火60C30s，共39个循环；95C10s，熔解曲线：从65C到95C每次增加0.5 C.以2仏计算基因的相对表达量.采用SPSS19.0统计分析数据，两独立样本t检验,P< 0.05为差异有统计学意义.
2结果
2.1成功构建弓形虫急性肺部感染小鼠模型实验组小鼠在接种弓形虫后第5d出现典型的弓形虫感染症状：
颤抖，竖毛，弓背，活动量减少.实验组小鼠腹部隆起，取出的腹水中观察到大量弓形虫速殖子.弓形虫B1基因扩增的目的片段长度为194 bp，实验组小鼠肺组织均检测到弓形虫B1基因片段(图1).
2.2测序结果所有样本RQN均>8,28s/18s 均大于1.4，所有样本浓度均大于120ng/“L(表2). BGISEQ-500测序平台一共检测了6个样本，平均每个样本产出Clean reads数为45.51G，总共检测到17828个基因.Clean reads比对到小鼠参考基因组的平均比对率为94.39%，唯一比对到小鼠参考基因组的平均比对率为85.70%.Clean reads Q20在96.86%〜97.34%,Clean reads Q30在88.57%〜89.94%，分别代表碱基正确识别率在90%和99.9%的碱基占总体碱基的百分比(表3).
表1qPCR验证基因引物
Tab.l Primers used for qPCR validation
Primer
name
Primer sequence5to3‘）
Length of qPCR
prodiicts/bp Zbp1F AGAACTC：CAGTGCX：CAGC：CTAG108
Zbp1R CTGTCGTCATTCCCAGAGCCTTG
Mmp8F TTGAGAAAGCTTTTCACGTCTG97 Mmp8R CTTGAGACGAAAGCAATGTTGA
Cxcll0f C：CGCT'GCAACT'GCAT'C：CAT'A103
C xc110r GATCTCAACACGTGGGCAGG
metal dome
Ccr5F ACTGCTGCCTAAACCCTGTC173
Ccr5R ATGTTCTCCTGTGGATCGGG
Igtp F AGTGCATCAGCAATAAGGCG150
电弧发生器Igtp R GTGACCCATCATCCACACCA
Ngp F AGTGTACTTCCACCCAGGAGA73
Ngp R GTGCAATTTCTCTCCTCCCCA
Gbp2F AGCTGCACTATGTGACGGAG81
Gbp2R TAGCGGAATCGTCTACCCCA
Ifi-17F GGATGCTTCCATTGAGCTAAAG133
Ifi-17R CTGTTCTTGTTCAGGCAAATCA
Slc38a5F GCTGCTCTTTCCAAGCAAGG98
Slc38a5R TTGGCACACAGATGACGAGG
Esml F CCTGGAGAAACCTGCTACCG142 Esml R CGAAGGTGCCATAGGGACAG
Gapdh F GGTTGTCTCCTGCGACTTCA183 Gapdh R TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC
M RH1RH2RH3Con1Con2Con3
M:Maker；RH_1.RH_2.RH_3为实验组,C（）n_1、C（）n_2、C（）n_3为对照组。
图1小鼠肺组织弓形虫B1基因检测
Fig.l Detection of dii Bl gene in lungs of mice
206
中国人兽共患病学报
2021,37(3)
表2总RNA 质量检测
Tab.2 Examination of total RNA quality
Sample name Concentration
(ng/“L)Amount
(卩g)
RQN 28s/18s
Quality
cvalution RH_1
255.
5.1049.1 1.5qulified RH_22/19. 4.988
8.
1.5qulified RH_3
305.9
6.1 188.6 1.qulified Con_1120.
2.04
8.
1.8
向心关节轴承散件加工qulified Con_1326. 6.5268.6 1.6qulified Con_1
162.
3216
8.9
1.5
qulified
表3高通量测序数据质量
Tab.3 High throughput RNA-seq data quality
Sample name Clean reads
Total mapping genome ratio/ %
Uniquely mapping genomeratio /%
Q20/%Q30/%RH_1
44 717 38494.0484.7997.0789.26
RH_24 6 959 77093.8384.2297.34
89.94RH_3
4 6 074 38494.08
84.83
97.1389.39Con_14 4 750 4 4 694.8486.5
97.0289.06
Con_24 6 071 83894.80
87.0196.868857Con_3
4 4 483 720
94.75
86.91
96.97
88.88
2.3 差异表达基因 筛选 和 功 能 分析 根 据设 定 的 筛选条件(|Log2FC|>3,Q value<0.01)总共挖掘
到286个差异表达基因，其中上调基因234个，下调
基因52个.从差异基因表达量聚类热图(图2)可
以看出大部分基因和免疫系统、信号分子相互作用 以及信号转导有关.说明与免疫相关的基因在宿主 抵抗弓形虫感染时发挥了重要作用.
KEGG Pathway Term Level2
■ Folding, sorting and degradation ■ Cellular community - eukaryotes
■ Metabolism of other amino acids Biosynthesis of other secondary metabolites Global and overview maps ■ Cell motility Nervous system
■ Cell growth and death
pigi■ Amino acid metabolism ■ Xenobiotics biodegradation and metabolism ■ Nucleotide metabolism
■ Environmental adaptation
|~| Signal transduction
■ Metabolism of cofactors and vitamins
■ Signaling molecules and interaction ■ Circulatory system
■ Transport and catabolism
■ Membrane transport
■ Glycan biosynthesis and metabolism ■ Development ■ Aging跟刀架
匚 Lipid metabolism
■ Sensory system
■ Immune system
Translation | | Endocrine system
■ Digestive system
Carbohydrate metabolism
图2总差异表达基因的表达量聚类热图Fig.2 Cluster analysis heat map of all
DEGs
3期曹纹侨，等：弓形虫急性感染小鼠肺组织的转录组分析207
差异表达基因的GO注释分为生物过程(Biological process,BP)、细胞组分(Cellular component.,CC)和分子功能(Molecular function,MF)，每个分类下的Top20GO术语见图3。在每个分类的TOP20术语中，CC下显著富集的术语有15个, MF和BP下的TOP20术语全部显著富集，(Q val-ue<0.05即视为显著富
集).从分析结果可知,BP 下的术语大多数和免疫相关如：免疫应答(immune response)、免疫系统过程(immune system process)、防御应答(defense response)、固有免疫应答(innate immune response)A炎症应答(infleimma-tory response)等。而MF下的术语大多数和细胞因子以及GTP酶相关，如：细胞因子活性(cytokine activity)、趋化因子活性(chemokine activity)、趋化因子受体活性(chemokine receptor activity)、CX-CR3趋化因子受体结合(CXCR3chemokine receptor binding)、CCR趋化因子受体结合(CCR chemokine receptor binding)、C-C趋化因子结合(C-C chemokine binding)、C-C趋化因子受体活性(C-C chemokine receptor activity)、GTP酶活性(GTPase activity)、GTP结合(GTP binding)。
差异表达基因的KEGG富集分析结果(图4)显示，在TOP20KEGG信号通路中显著富集的通路有13条°在小鼠肺组织中，弓形虫感染影响最显著的通路为细胞因子-细胞因子受体相互作用通路(Cytokine-cytokine receptor interaction)°综合GO和KEGG富集分析的结果，我们发现大多数改变的KEGG通路和GO条目都和免疫相关，其中特别是细胞因子和趋化因子所占比重较大°大量研究表明细胞因子和弓形虫感染存在密切的关系，同时趋化因子是细胞因子成员之一，因此我们选择了Cytokine-cytokine receptor interaction和Chemokine signaling pathway中显著富集的24个差异表达基因进行KDA分析°
24个差异表达基因可以分为3个聚类：显著升高、升高和降低，表达量聚类热图见图5°其中绝大多数差异表达基因被上调，而表达降低的细胞因子只有4个，分别是Gng8、Adcy1、Gdfl0和Ackr4°接下来，
对这24个差异表达基因进行KDA分析(图6)，用以在复杂的关系网络里出起关键作用的基因，通过分析最终筛选出10个关键驱动基因，分别是Tnf、Cxcll0、Ill0、Ccl2、Ifng、Cxcl9、Ccr5、Ccl4、Cxcr2和Ccl7，且都上调表达°
2.4实时荧光定量PCR验证差异表达基因从286个差异表达基因中随机选择10个基因用于qPCR验证，其中8个为上调基因，2个为下调基因°qPCR数据经统计学分析P值均小于0.05实验组和对照组基因的相对表达量差异具有统计学意义°结果表明qPCR和RNA-seq结果具有一致性，说明转录组测序结果可靠(图7)°
3讨论
细胞因子是可溶性的细胞外蛋白或糖蛋白，它们通过与目标细胞表面的特定受体结合从而发挥作用，参与先天性和适应性炎症免疫应答、细胞生长、分化、死亡等过程°本研究将细胞因子与细胞因子受体互作和趋化因子信号通路下共24个差异表达基因进行了KDA分析，筛选得到10个关键驱动基因:Tnf(Tnfa)、Cxcll0、1110、Ccl2、Ifng、Cxcl9、Ccr5、Ccl4、Cxcr2和Ccl7，它们在弓形虫感染小鼠的肺组中均上调表达°
弓形虫感染引起Th1型免疫应答，并伴随大量促炎性细胞因子的释放，如：TNFa和IFN-y[17]°在本研究中TNFa和IFN-7均上调表达，同时还是关键驱动基因°在急性弓形虫感染时，TNFa可以协同IFN-7发
挥抗弓形虫作用,IFN-7也可以诱导TNFa的释放°IFN-7是抵抗弓形虫感染的主要的介导者[6]°在小鼠,IFN-7可以诱导GTPases家族的IRGs和GBPs合成，IRGs和GBPs可以破坏弓形虫纳虫泡膜(PVM)[1820]，使弓形虫暴露于宿主免疫系统并将其杀死°小鼠GBPs家族含有11个成员,Gbp1-Gbp11，在本实验中除Gbp9、Gbp11夕卜，其他基因均显著上调，而IRGs家族成员则全部显著上调°在感染弓形虫的小鼠肺组织中,IFN-7诱导表达的GBPs和IRGs家族成员发生了显著上调，由此说明弓形虫RH株感染的小鼠肺组织中,GBPs 和IRGs可能是IFN-7诱导的主要抗弓形虫效应分子°
在本研究中，显著差异表达的趋化因子和趋化因子受体主要来自于CXC亚家族、CC亚家族以及其对应的受体家族°其中，Cxcl9、Cxcll0属于CXC 亚家族,Ccl2、Ccl4和Ccl7属于CC亚家族，Cxcr2 属于CXC亚家族受体，Ccr5属于CC亚家族受体。Cxcl9和Cxcll0可在IFN-y的诱导下大量表达，两者的受体都是Cxcr3°在GO富集分析的MF板块，Cxcr3受体结合(Cxcr3chemokine receptor binding)被显著富集到°在弓形虫慢性感染的小鼠脑组织中,Cxcl9和Cxcll0的水平显著升高[21],Cx-cl9可以募集T细胞到感染灶，从而阻断慢性感染被激活[22]°在小鼠弓形虫眼病模型中Cxcll0是维
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