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深圳华⼤⽣命科2021年07⽉02⽇，Nature communications在线发表了复旦⼤学（中⼭医院）肝癌研究所樊嘉院⼠、杨欣荣教授团队
樊嘉院⼠、杨欣荣教授团队与深圳华⼤⽣命科学研究院合作的最新成果Dissecting spatial heterogeneity and the immuneevasion mechanism of CTCs by single-cell RNA-seq in 学研究院
hepatocellular carcinoma。论⽂通过单细胞测序解析肝癌循环肿瘤细胞的时空异质性和免疫逃逸新机制。
ftd vs ks解析肝癌循环肿瘤细胞的时空异质性和免疫逃逸新机制。
此项研究的测序数据已存储于国家基因库⽣命⼤数据平台（CNGBdb），项⽬编号为：
已存储于国家基因库⽣命⼤数据平台（CNGBdb），项⽬编号为：CNP0000095。
此项研究的测序数据
研究背景
肿瘤转移是⼀个多步骤、多环节的复杂过程，众多学者认为循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell，CTC）作为肿瘤转移复发的“种⼦”细胞，在这⼀过程中扮演极其重要的⾓⾊。CTC 定义为源⾃肿瘤原发灶或转移灶、存在于⾎液循环中的肿瘤细胞，在正常⼈体内⼏乎不存在。CTC 在循环系统内的播散过程是⼀个时间和空间上的动态过程。这样推测CTC在其转移路径上存在着表型和分⼦上的差别（即时空异质性）。因此，仅针对外周⾎CTC的研究可能只是管中窥豹，露出的仅仅是在特定时间、特定部位CTC 的冰⼭⼀⾓，并不能全⾯反映CTC的时空特征。
研究内容
为了全⾯剖析CTC在整个循环播散时空过程中的特征变化及其背后的分⼦机制，作者决定对体内不同⾎管部位的CTC进⾏单细胞层⾯的深⼊研究。肝癌细胞从肝内原发灶脱落⾸先会经过肝静脉（hepatic vein, HV）释放进⼊下腔静脉，然后随⾎流进⼊⼼脏，再通过肺循环以后，CTC进⼊外周动脉（Peripheral artery, PA），经过外周⽑细⾎管⽹，CTC流⼊外周静脉（Peripheral vein, PV），门静脉（Portal vein, PoV）则收集来⾃消化系统的静脉⾎再次流⼊肝脏。本研究共⼊组10例原发性肝癌⾏根治性切除⼿术的病⼈，在切除肿瘤之前，采集CTC从原发灶播散开始沿着循环路径上的这四个关键⾎管部位的⾎液，即肝静脉（HV）、外周动脉（PA）、外周静脉（PV）和门静脉（PoV）。将CTC
阴性富集后，再通过单细胞操控机器⼈把单个未固定的CTC挑选出来，共成功分离295个CTC单细胞，进⾏单细胞全长转录组测序，完成转录组测序后（scRNA-seq）共获得113个质控合格的CTC单细胞转录组数据进⾏下游⽣物信息分析（图1）。
结核杆菌蛋白芯片
蚕丝被加工设备图1
⾸先，通过与配对原发肿瘤表达谱结果进⾏⽐对，分析发现CTC表达上调的基因涉及细胞迁移侵袭和免疫应答、细胞周期、细胞凋亡等信号通路。针对不同⾎管部位内的CTC异质性分析，⾸次观察到HV CTC的异质性最⾼，流⼊外周动脉以后CTC异质性显著降低，在外周静脉和门静脉内CTC的异质性再次升⾼。这⼀结果提⽰：① CTC是由原发灶不同克隆所释放的肿瘤细胞所构成，因此在肝脏流出道HV内的CTC存在很⾼的转录组异质性；② 在肺循环的⽑细⾎管⽹滤过和动脉系统⾼剪切⼒的影响下，可能只有个头较⼩、细胞变形能⼒强以及抵抗流体剪切⼒强的CTC能⽣存下来，因⽽在PA中的CTC已经过筛选，异质性显著降低；③ 在外周静脉和门静脉内检测到的CTC由于在循环系统内“游荡”了很久，受循环中各种理化因素和⽣物因素的影响，如⾎流剪切⼒、失巢凋亡、低氧状态、细胞因⼦及免疫细胞等，CTC为了适应这些外在压⼒可能会主动激活不同的信号通路。因此，CTC在单细胞转录组⽔平表现为异质性也逐渐增加。
随后团队分别对相邻两个关键⾎管部位的CTC 表达谱进⾏差异基因分析，发现不同循环部位之间的 CTC 呈现出转录组的时空动态变化特征。从HV 到 PA 的过程中，CTC 的整体转录活性降低；从 PA 到 PV 的过程中，CTC 的转录活性⼜逐渐增加。从 HV 到 PA 阶段，下调的基因富集在细胞⽣长和增殖等信号通路，包括 Myc 靶基因、G2/M 检查点相关基因、mTORC1 通路基因等；⽽上调的基因主要涉及上⽪间质转化（EMT）、趋化因⼦、⾎⼩板激活等信号通路，这些信号通路的活化将赋予CTC
抵抗免疫系统识别和攻击的能⼒，对于CTC的成功定植具有关键意义。当 CTC 从PA⾏⾄ PV 区域， Myc 靶基因的表达⼜开始上升，由于缺氧和 ROS 影响，糖酵解和氧化应激的通路开始激活。上述结果⾸次从单细胞⽔平揭⽰CTC可以通过主动调控其转录组活化或关闭相关信号通路来适应循环过程中所⾯临的各种环境压⼒，以达到“适者⽣存”进⽽成功实施转移的终极⽬标。
斗拱模型
在CTC循环过程中所⾯临的各种环境压⼒中，免疫系统被认为是抑制 CTC 体内⽣存的关键“守门⼈”。原发肿瘤内存在⼤量浸润的免疫抑制细胞，如调节性 T 细胞（regulatory T cell, Treg）、⾻髓来源的抑制性细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等，可抑制局部抗肿瘤免疫细胞的杀伤功能，如⾃然杀伤细胞和CD8+ T 细胞等，形成有利于肿瘤细胞⽣存和发展的免疫抑制微环境。当肿瘤细胞离开原发灶进⼊⾎液循环后，肿瘤细胞便直接暴露在功能正常的免疫系统监视之下。与原发灶的免疫抑制微环境相⽐，⾎液循环内 NK 和 CD8+ T 细胞抗肿瘤功能处于激活状态，可有效识别和杀伤进⼊循环中的肿瘤细胞。因此，CTC如何逃避免疫系统的监视和攻击是其成功实施转移复发的关键“限速步骤”。
为了探寻肝癌CTC免疫逃逸的关键基因，团队⾸先分析了肿瘤免疫逃逸相关基因和所有细胞因⼦基因在CTC和肝癌原发灶之间的差异表达，结果显⽰细胞因⼦CCL5变化幅度在CTC上调基因中位列第⼀，并且CTC从HV⾄PA、PV和PoV的过程中CCL5表达呈持续上调状态，结合既往研究中证实的CCL5具有招募Treg进⽽抑制抗肿瘤免疫的作⽤，推测CCL5可能是肝癌CTC实施免疫逃逸的关键基因；针对癌旁肝组织微⾎管内的CTC进⾏多⾊免疫荧光分析也证实了CCL5+ CTC的存在，以及它们与
CCR5+ Treg的空间相邻关系，进⽽通过独⽴临床队列证实外周⾎CCL5+ CTC与CCR5+ Treg呈正相关；作者还对两个已发表的肝癌数据集进⾏分析，结果也证实 CCL5 表达与肝癌瘤内和门静癌栓（PVTT）中的FOXP3（Treg标志物）表达呈正相关；进⼀步探索了CCL5+CTC 与循环Treg之间平衡的临床相关性，结果表明Treghigh / CCL5+ CTChigh
肝癌病⼈术后预后最差。因此，作者推测CTC可能通过分泌CCL5来招募Treg实现对杀伤细胞的免疫抑制，进⽽逃避免疫杀伤，促进因此，作者推测CTC可能通过分泌CCL5来招募Treg实现对杀伤细胞的免疫抑制，进⽽逃避免疫杀伤，促进CTC播散和转移。随后系统的体、内外实验表明⾼转移肝癌细胞系（MHCC97H）中 CCL5 蛋⽩表达⽔平显著⾼于低转移肝癌细胞系
CTC播散和转移。
（HepG2，Huh7 和 MHCC97L），同时MHCC97H上清招募 Treg的能⼒也显著强于Huh7上清，并且这种迁移活性可被CCL5中和抗体所抑制；⼩⿏转移模型也证实，CCL5敲减后Hepa1-6在体内清除速度较对照细胞显著增快，同时Treg 耗竭的⼩⿏清除Hepa1-6的能⼒也较对照⼩⿏更强，作者还发现CCL5敲减后Hepa1-6的肺转移能⼒显著降低；⼩⿏转移模型还证实敲减Hepa1-6的CCL5表达可以抑制Treg 募集，同时还可促进肝转移瘤中活化CD8+ T细胞的浸润。体内和体外模型结果表明：CTC可通过主动分泌CCL5来募集Tregs，从⽽抑制杀伤性CD8+ T细胞的功能，在转移定植过程中建⽴有利于其⽣存的局部微环境。
最后，团队探索了调控CTC CCL5表达的分⼦机制。为鉴定诱导CCL5表达的关键转录因⼦，我们分析了CTC内所有转录因⼦表达与 CCL5表达的相关性，结果显⽰正相关程度最⾼的转录因⼦是MYC-associated factor X（MAX）。GeneHancer预测结果提⽰MAX是能够与 CCL5 基因增强⼦结合的 TF之⼀；对CTC上调的基因集进⾏KEGG分析后发现p38 MAPK通路显著富集；同时，p38 MAPK信号通路中的多个关键基因，包括TAOK1，TAOK2，MAP2K3，PLA2G4A和 MAX 在CTC中均显著上调，提⽰CTC中的p38 MAPK通路呈激活状态；进⼀步的体内、外实验证实p38-MAX通路是调控CTC CCL5表达的关键信号通路，抑制p38-MAX通路可显著降低CTC的免疫逃逸和转移能⼒。
数卡器研究意义
⾸次从单细胞转录组层⾯证实了CTC在体内循环过程中的时空异质性；系统揭⽰综上所述，本项发表在Nature Communications的研究，⾸次从单细胞转录组层⾯证实了CTC在体内循环过程中的时空异质性；系统揭⽰了CTC动态调控相关信号通路以适应循环过程中所⾯临的各种环境压⼒；阐明了CTC通过活化p38-MAX信号通路诱导CCL5表达，进⽽招募Treg实现免疫逃逸的相关分⼦机制（图2）。本研究结果为进⼀步探索靶向CTC的抗肿瘤复发转移策略提供了新思路。
⽽招募Treg实现免疫逃逸的相关分⼦机制
图2
复旦⼤学附属中⼭医院樊嘉院⼠、杨欣荣主任医师、深圳华⼤⽣命科学研究院侯勇研究员为本⽂共同通讯作者，孙云帆主治医师、吴靓博⼠、刘⽯
平研究员、江苗苗博⼠、胡博主治医师为本⽂共同第⼀作者。
⾸发公号：国家基因库⼤数据平台
参考⽂献
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