生物化学实验报告
姓名：余振洋学号：200900140156 系年级：09级生科3班
同组者：张刚刚时间：2011/5/5
一、【实验目的】
1．了解柱层析的分类，掌握各种柱层析的原理。
2．熟练掌握吸附层析的原理和操作技术。
二、【试验原理】
叶绿体素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要由叶绿素a, 叶绿素b，胡萝卜素和叶黄素组成。利用叶绿体素能溶于有机溶剂的特性，可用丙酮、甲醇、乙醇等提取。
分离素的方法有很多，可以用纸层析、薄膜层析、柱层析等。层析分为固定相和流动相两部分，当流动相从固定相上流过时，由于混合物中各成分在两相间具有不同的分配系数，它们的移动速度不同，使
样品中的混合物得到分离。
分离提纯是研究化学物质的前提，而层析是一种很好的分离提纯方法。层析的原理是混合物在层析系统中的分配系数不同而达到分离提纯的目的。本实验采用的是比较简单的柱层析，柱层析法分离的素顺序应该为素下移顺序：黄（胡萝卜素）——蓝绿（叶绿素a）——黄绿（叶黄素）——绿（叶绿素b）。直接接地箱
三、【试验器材】
层析拄（1×30cm），研钵，蒸馏装置，脱脂棉，天平，漏斗，三角瓶，分液漏斗，烧杯等。
四、【实验试剂】
1．无水乙醇5．碱性Al2O3
2．石英砂6．饱和氯化钠溶液
3．丙酮7．无水硫酸钠
4．石油醚（60-90℃）8．洗脱掖：丙酮：石油醚＝1：9
五、【实验操作】
1．层析拄的制备：
取12g碱性三氧化二铝加入30ml石油醚搅拌，浸泡10min.。在层析拄内加入一团棉花在底部，再加入石英砂0.5cm以上，然后用石油醚半充满柱子，再将浸泡好的三氧化二铝倒入柱内，倒时应该缓慢，重复使用下面的石油醚，直到装完。用石油醚洗柱内壁，顶部加一小团棉花，然后再填入石英砂0.5厘米高。2．素的提取： 取20g菠菜，加少许石英砂，再加30ml无水乙醇研磨成浆，用脱脂棉过滤，保存滤液，滤渣再用无水乙醇提取一次，合并滤液，滤渣再加入30毫升石油醚提取一次，过滤，合并滤液，转移至分液漏斗中，再加入40ml饱和氯化钠溶液振荡，弃去下层溶液，再分别加入20毫升水震荡洗涤几次，直至下层无，保
ca173留上层溶液，转移至三角瓶中，加入无水硫酸钠干燥5分钟，备用。
3．样品的浓缩：
将提取液放入蒸馏烧瓶中，蒸除多余的石油醚，至剩余液体5-8ml左右，以备加样使用。
TJA11004．样品的分离层析：吸附层析分离素
打开层析柱下部开关，向柱内加入2ml浓缩液，至液体没入砂内，再加入石油醚冲洗柱壁，液体浸入砂内，加洗脱液开始层析，可以看到不同带被分离出来，直至洗脱完毕，在柱下面用试管分别接收不同带的洗脱液，其颜分别为深黄—暗绿—黄绿—绿
连体滑雪服六、【注意事项】
1．在进行层析柱的制备时，整个操作过程中溶剂都要保持高于三氧化二铝表面，同手，整个装置要保持水品，以免样品倾斜，最终导致分离素时各处的起点不一致。
2．在分离素时，要控制流速，以每分钟60-80滴为宜。流速过快，则吸附时间过短，素分离不开，一般只能分离出3种带（深黄—黄绿—深绿）；流速过慢，则作用时间过长，素洗脱很慢，浪费时间。
3．加样量不要过大，过大，分离条带过宽，如果层析拄不够长，各组分不易分开，易同时洗脱下来；加样量过少，带不是很清楚，不易观察，效果不好。4．在研磨菠菜叶时，不要研磨得太细，否则会透过脱脂棉，造成堵塞。
牧一征
5．素提取过程中，分液漏斗震荡不能太激烈，防止生成小油滴。
6．蒸馏时，在溶液剩下10多毫升时，就应该停止加热，而利用余热将溶液蒸至所需的量。
7．往层析柱内加样时，要沿着柱壁转圈加，使得四周的浸润速度和高度尽可能保持一致，这样可使样品下降与胶面相切。
七、【实验结果】
图一黄（胡萝卜素）带开始分离图二提取出的黄胡萝卜素
八、【结果分析及讨论】
分析：
从实验结果可以看出，黄（胡萝卜素）带并不是一条平稳的带，而是呈现波浪线的状态。造成这种现象的原因可能是：1、操作过程中，整个装置未保持水平；2、往柱内加样时，四周浸润的程度和高度不同，造成样品起点不同，最终他的下降与胶面不相切，造成不再同一水平线上；3、在石英砂里存在气泡，造成四周下降速度不一致；4、分离素时流速过快，使得黄素环的变形更为严重。
讨论：
为什么实验只需接受胡萝卜素？
答：首先从原理上看，柱层析是因为叶绿体素中各素在两相之间具有不同的分配系数，造成其被吸附剂吸附的程度不同，同时它们被溶剂溶解的能力也不同，所以在层析柱中向下移动的距离和速度不同，最后得到分离。
而在叶绿体内的所有素中，胡萝卜素分子最小，极性最小，且是单纯的碳氢化合物，溶解度最大，
石灰投加系统所以扩散速度最快。而其他素中除了叶黄素扩散速度仅次于胡萝卜素外，剩余的素扩散都很慢。考虑到实验时间及实验目的，即重点为掌握原理和操作方法而非结果等因素，故只需分理出胡萝卜素。
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