3-氨基苯硼酸联合EDTA碳青霉烯酶抑制剂增强试验检测CRE碳青霉烯酶的研究 中国人民武装警察部队广西壮族自治区总队医院检验与病理科 广西 南宁530003
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广西壮族自治区人民医院检验科 广西 南宁 530016
【摘要】目的了解3-氨基苯硼酸（APB）联合乙二胺四乙酸（EDTA）碳青霉烯酶抑制剂增强试验（APB-EDTA 法）用于检测碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌（CRE）产碳青霉烯酶的检测结果。方法 使用APB-EDTA 法测定58株CRE的碳青霉烯酶，并与金标准PCR及DNA测序检测结果的符合率比较。结果 58株CRE用APB-EDTA法均检出碳青霉烯酶，其中，产KPC酶24株（41.4%），产金属酶30株（51.7%），产D类OXA-48型酶2株（3.4%），同时产KPC和金属酶2株（3.4%），其检测结果与分子生物学检测结果的符合率为100%。结论 APB-EDTA法可以检测肠杆菌目细菌产生的A类碳青霉烯酶、B类金属酶和D类OXA-48型碳青霉烯酶，操作方法简单易行，便于临床微生物实验室开展肠杆菌目细菌产生的碳青霉烯酶的检测，为临床精准抗感染以及耐药菌的感染控制提供依据。
【关键词】碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌；碳青霉烯酶；碳青霉烯酶抑制剂增强试验
【中国图书分类号】 R446.5
近年来，随着碳青霉烯类药物在临床上的广泛应用，耐碳青霉烯类肠杆菌目细菌（carbapenem-resistant Enterobacteriales，CRE）的检出率呈快速上升趋势，已成为全球密切关注的耐药菌之一。因药物选择有限，CRE严重威胁着患者的健康和医疗安全，给感染性疾病的带来了严峻挑战[1]。CRE是指对亚胺培南、美罗培南、厄他培南或多利培南任一耐药者或产生碳青霉烯酶的肠杆菌目细菌[2]。研究表明，产碳青霉烯酶是肠杆目细菌对碳青霉烯类药物耐药的最主要机制[3]。碳青霉烯酶包括Ambler A类、B类和D类，A类丝氨酸碳青霉烯酶最常见，以KPC为主；B类金属酶以NDM、IMP、VIM型为主；D类为OXA-48型丝氨酸碳青霉烯酶[4]。本文旨在用3-氨基苯硼酸（APB）联合乙二胺四乙酸（EDTA）碳青霉烯酶抑制剂增强试验（APB-EDTA 法）检测CRE 菌株的产酶情况，并与分子生物学符合率进行比较，现将研究结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 菌株来源 研究的58株待试菌均为某院2020年经 PCR及DNA测序明确为产碳青霉烯酶的非重复CRE菌株。质控菌株为大肠埃希菌 ATCC25922（阴性对照）、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705（产KPC酶阳性对照）。
漏水探测器1.2 主要试剂和抗菌药物纸片 亚胺培南、美罗培南、厄他培南药敏纸片与MH 培养基（英国OXIOD公司），空白药敏纸片（湖南比克曼生物公司），二甲亚砜（天津科密欧公司），3-氨基苯硼酸（APB）（上海麦克林公司），乙二胺四乙酸（EDTA）（天津致远化学试剂公司）。
1.3 A类碳青霉烯酶和B类金属酶检测 采用APB-EDTA法进行检测。参照喻华等[4] 2020年描述的APB-EDTA法操作步骤进行：将待测菌调制成0.5麦氏浊度菌悬液，均匀涂布于MH琼脂平板上。随后贴4张相同的碳青霉烯类抗菌药物纸片（亚胺培南/美罗培南/厄他培南）于琼脂表面，1张纸片不加任何液体，1张纸片滴加APB溶液10μL，1张纸片滴加EDTA溶液10μL，最后1张纸片同时滴加APB溶液和EDTA溶液各10μL，过夜培养后量取纸片抑菌圈直径。结果判读如下：①添加APB溶液的碳青霉烯类纸片抑菌圈直径与单药纸片相差≥5mm，即可判断待测菌产A类碳青霉烯酶；②添加EDTA溶液的碳青霉烯类纸片抑菌圈直
径与单药纸片相差≥5mm，即可判断待测菌产B类碳青霉烯酶；③如仅同时添加APB和EDTA的碳青霉烯类纸片抑菌圈直径与单药纸片相差≥5mm，可判断该待测菌同时产A类和B类碳青霉烯酶；④如含酶抑制剂的碳青霉烯类纸片抑菌圈直径与单药相差均＜5mm，可判断该菌不产A类或B类碳青霉烯酶。
1.4 D类OXA-48型碳青霉烯酶检测 对不产A类或B类碳青霉烯酶的菌株同样采用APB-EDTA法检测酶型，实验步骤参照Tsakris 等[5]进行：将大肠埃希菌ATCC 25922调制成0.5麦氏浊度菌悬液，均匀涂布于MH琼脂平板上。将1张亚胺培南纸片贴于琼脂表面，取2张无菌空白纸片，每张纸片取经18~24小时培养的待测菌菌落3～4个，在亚胺培南左右各贴上1张已取待测菌的空白药敏纸片。然后在亚胺培南纸片左边的空白纸片加EDTA溶液10μL，在亚胺培南纸片右边的空白纸片同时加EDTA溶液和APB溶液各10μL。过夜孵育后判读结果：①含EDTA或APB空白纸片均出现细菌矢状生长者，提示该菌产OXA-48型碳青霉烯酶；②含EDTA或APB空白纸片均未出现细菌矢状生长者，提示该菌产B类碳青霉烯酶；③仅含EDTA空白纸片出现细菌矢状生长者，提示该菌产A类碳青霉烯酶。
2 结 果
2.1 菌株分布 58株CRE包括肺炎克雷伯菌33株（56.9%）、大肠埃希菌21株（36.2%）、阴沟肠杆菌2株（3.4%）、产气克雷伯菌2株（3.4%）。
2.4 碳青霉烯酶表型与分子生物学检测结果比较 58株CRE菌株经APB-EDTA法检测碳青霉烯酶100%阳性，其中，产KPC酶24株（41.4%），产金属酶30株（51.7%），产D类OXA-48型酶2株（3.4%），同时产KPC和B类金属酶2株（3.4%），其检测结果与PCR及测序检测结果的符合率为100%（表1）。
表1APB-EDTA法与PCR法检测结果比较
细菌种类 | APB-EDTA法（株） | | PCR及测序（株） |
A类 | B类 | D类 | A类+B类 | | KPC | NDM-1 | VIM | OXA-48 | KPC+NDM-1 |
大肠埃希菌（n=21） | 2 | 19 | 0 | 0 | | 2 | 18 | 1 | 0 | 0 |
肺炎克雷伯菌（n=33） | 22 | 7 | 2 | 2 | | 22 | 5 荸荠去皮机 | 2 | 2 | 2 |
阴沟肠杆菌（n=2） 引向器 | 0 | 2 | 0 | 0 | | 0 | 2 | 烤花炉0 | 三相马达0 | 0 |
产气克雷伯菌（n=2） | 0 | 2 | 0 | 0 | | 0 | 2 | 0 | 0 | 0 |
合计 | 24 | 30 | 2 | 2 | | 24 | 27 | 水控系统3 | 2 | 2 |
| | | | | | | | | | |
3 讨 论
目前关于碳青霉烯酶表型检测方法很多，CLSI、商品化的检测试剂以及文献均有相关报道和推荐。一些碳青霉烯酶表型检测的方法因操作过程中存在各种弊端，故使用并不广泛。PCR 是检测碳青霉烯酶的金标准，但目前在基层微生物实验室普及开展尚有一定困难。本研究对58株已知产碳青霉烯酶基因型的CRE菌株采用APB-EDTA法检测碳青霉烯酶并进行酶型分类，欲获取与原分子生物学方法检出结果的符合率，为基层临床微生物实验室使用提供参考。
临床微生物实验室及时进行CRE酶型检测，并在检验报告单中提示CRE耐药机制，将有助于临床CRE精准，降低病死率，提高治愈率。Cointe等[6]报道，实验室如延迟对耐药菌株诸如产碳青霉烯酶型的诊断报告，将导致患者死亡率上升。本研究采用APB-EDTA 法进行碳青霉烯酶表型检测，其检测KPC型、金属酶和OXA-48型碳青霉烯酶结果与PCR方法检测结果相符率为100%。值得注意的是，本研究用APB-EDTA检测OXA-48型酶时，多次采用亚胺培南纸片检测为阳性，而用美罗培南和厄他培南纸片检测时均为阴性，其原因需进一步研究。周银娣等[7]报道，APB-EDTA法不能检出D组OXA酶，该法对产 KPC 酶菌
株的符合率为99.2%，对产金属酶菌株、KPC+金属酶复合酶的符合率均为100%，其检测结果与分子生物学检测结果总体符合率为87.3%。
总体而言，APB-EDTA法简单易行，可同时检测A类、B类碳青霉烯酶和D类OXA型酶，便于基层微生物实验室使用和开展CRE碳青霉烯酶检测，为临床精准抗感染提供实验室依据。
【参考文献】
[1]Li F, Ye K, Li X, et al. Genetic characterization of Carbapenem-Resistant Escherichia coli from China, 2015-2017[J]. BMC Microbiol，2021，21(1):248.
[2]Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Facility guidance for control of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae (CRE)[EB/OL]. [2020-07-01]. v/hai/pdfs/cre/cre-guidance-508.pdf.
[3]Tilahun M, Kassa Y, Gedefie A, etal. Emerging Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Infection, Its Epidemiology and Novel Treatment Options: A Review[J]
. Infect Drug Resist，2021，14:4363-4374.
[4]喻华，徐雪松，李敏，等.肠杆菌目细菌碳青霉烯酶的实验室检测和临床报告规范专家共识[J].中国感染与化疗杂志，2020，20（06）：671-680.
[5]Tsakris A, Poulou A, Bogaerts P, et al. Evaluation of a new phenotypic OXA-48 disk test for differentiation of OXA-48 carbapenemase-producing Enterobacteriaceae clinical isolates[J]. J Clin Microbiol,2015,53(4):1245-1251.
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