朱丹;李强强;逄秀梅;刘悦;王雪;贾曼;陈刚
【摘 要】电化学阻抗谱(EIS)由于免标记,测定简便,灵敏度高等优点受到关注,逐渐成为电化学生物传感器中的研究热点.文中简要概述了EIS技术的相关概念、原理,以及在酶、免疫、DNA、细胞、离子通道传感器等生物传感器中的应用进展.
【期刊名称】《化学传感器》
【年(卷),期】2016(036)001
【总页数】6页(P42-47)
【关键词】电化学阻抗谱;生物传感器;研究进展
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【作 者】朱丹;李强强;逄秀梅;刘悦;王雪;贾曼;陈刚
【作者单位】中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所,北京100081;中国农业科学院
农业质量标准与检测技术研究所,北京100081;中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所,北京100081;中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所,北京100081;中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所,北京100081;中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所,北京100081;中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所,北京100081
【正文语种】中 文
生物传感技术是集化学、生物学、物理学和信息学等多学科的分析技术［1］，它以生物活性材料，如酶、抗原、抗体和细胞等为感知元件，通过信号转换器，如电化学、热、压电和表面声波等，得到可定量识别的数字信号。电化学生物传感器由于其灵敏度高、检测范围广及可操作性强等优点，近些年来得到广泛的关注。尤其是基于电化学的葡萄糖生物传感器，在疾病和病原体的诊断和检测中，发挥着重要的作用。近期的调查研究发现，生物传感器有关的文章中有近一半涉及到了电化学方法，包括电位型，电流型，电容型和电导性四种形式，并且相关的比较文献综述也有发表。其中，电化学阻抗传感器（Electrochemical Impedance Spectroscopy，EIS），因为其高灵敏度和稳定性，逐渐成为研究热点［2］。
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电化学阻抗谱具有良好的界面表征作用，多用来检测修饰有生物分子的电极界面的生物学反应特性，如载体表面电容或电子传递电阻等。20世纪60年代初，荷兰物理化学家Sluyters首次在实验中实现了电化学中交流阻抗谱方法的应用［2］。此后，随着仪器的发展，阻抗谱方法在电化学传感器中的研究得到迅速发展，如酶传感器，免疫传感器，DNA传感器，离子通道传感器，细胞和微生物传感器等［3］。EIS分析法测量电极和生物敏感膜的小信号阻抗的频率响应，微小振幅正弦电流或电压不会对生物大分子的测定造成干扰，因此该方法敏感性高，可测量到极微的信号。当电极处于平衡电位时测定EIS，对电极表面生物分子膜的影响较小，能够真实地反映膜本身的电化学性质。
通常电阻Z值是通过测量在微小振幅变化的扰动电压作用下产生的电流信号得到的，是电压V（t）和电流I（t）的比值，可由公式（1）表示［4］。其中，V0和I0分别是初始的电压和电流值，f是频率，t是时间，Ф是电压-时间函数和电流-时间函数之间的相位角，Y是导纳，与阻抗互为倒数关系。
电阻是一个复杂的值，因为交流电势与电流信号的比值（系统的阻抗）不仅随正弦波频率
镀镍铜带（f）变化，另外阻抗的相位角（Ф）也会随（f0）变化。因此，阻抗值既可以用模拟系数（|Z|）和相位角（Ф）表示，也可以用阻抗的实部（ZR）和虚部（ZI）表示。鉴于此，阻抗的测定可以有两种方式：①波特图（Bode plot），包括两条曲线，横坐标是平率的对数，纵坐标分别是阻抗模拟值的对数（log|Z|）和阻抗的相位角 （Ф）；② 奈奎斯特图（Nyquist plot），以阻抗的实部（ZR）为横轴，以阻抗的虚部的负数（-ZI）为纵轴，图中的每个点分别代表不同的频率，其中左侧的频率高，为高频区，右侧的频率低，为低频区。
一般是将测量得到的电化学过程用等效电路进行模拟后进行计算得到。进行电化学阻抗测定时，对于工作电极需要控制以下三个条件：①在开路电位（OCP）下测量，根据溶液成分来确定平衡电位，在测定过程中保持稳定，常在二电极系统中使用；②固定工作电极的直流电压，保证氧化还原等过程的发生，常用于三电极系统中；③确定工作电极的通过电流，一般用于三电极系统中的恒电流模式［4］。等效电路的有效元件包括电解质溶液电阻（Rs），界面发生氧化还原反应时产生的电子转移阻抗（Ret），电解质中离子运动产生的阻抗Zw（Warburg阻抗）等效电感（L），界面区间电荷产生的电双层电容（CPE）等。电极反应的等效电路一般可以用上述有效元件的串联、并联电路等进行模拟，常用的
阻抗图谱为Nyquist plot（图1A），现代阻抗图谱分析包括数据分析和电路模拟等软件，可以根据文献中的或者软件中已有的模型确定，一般用图1B中的等效电路进行拟合（拟合曲线如图1A中的实线所示），计算出实验需要的Ret值以及帮助判断生物膜形成和生物学反应的动力学过程和机制。
阻抗谱通常分为法拉第阻抗谱和非法拉第阻抗谱［5］。法拉第阻抗谱中，在溶液中引入氧化还原探针测定异相电子转移阻抗（Ret），电极附近的带电表面会产生引力或斥力，进而影响Ret值的测定，表面电荷主要受pH、温度等因素的影响。另外，Ret值也受免疫传感器中探针与目标物结合引起的膜厚度变化或者分子构象厚度的变化影响，多用于分析生物学反应过程。非法拉第阻抗谱主要用由有效元件模拟得到的等效电路确定，通常用电容的变化来测定溶液中目标物的浓度。一般的等效电路包含三种电容，分别是自组装膜本身、探针层和双电层，多用于分析生物敏感膜形成过程。
2.1 电化学阻抗谱分析法在酶传感器中的应用
酶传感器是以测量在电极上修饰酶以及在酶催化作用下发生的氧化还原反应或者产物的形成等过程中产生的电阻变化为基础，进行物质的定性和定量分析。其中，酶的固定是研究
的前沿热点，通过固载酶技术，将酶固定或者束缚在特定的区域范围内，进行其特定的催化反应，并且可以进行一定程度的重复利用和回收，稳定性好，效率高［6］。常见的酶传感器有脲酶，葡萄糖氧化酶，辣根过氧化物酶，醇氧化酶，乙酰胆碱酯酶等。常用的固载材料包括石墨烯，碳纳米管，胶体金等。有关酶传感器已多有报道［7］，Lu等［8］将金刚烷胺修饰的辣根过氧化物酶（HRP-ADA）固定在环糊精修饰的石墨烯（CD-GR）上，用交流阻抗谱法分别研究了组装过程和固定酶的催化活性，传感器对双氧水（H2O2）的检测限可以达到0.1 μmol/L，并且在0.7～35 μmol/L范围内有良好的线性关系。郭明等［6］建立了基于碳纳米管的乙酰胆碱酯酶（CNT-AChE）的电化学生物传感器，通过优化不同的电极修饰方法，构建了等效电路模型，成功实现了对农药异丙威的检测。Barsan等［9］将葡萄糖氧化酶（GOx）和氮掺杂石墨烯（NG）分散在带正电荷的壳聚糖聚合物上，通过层层自组装技术修饰金电极，构建了新型葡萄糖氧化酶传感器，检测限为64 μmol/L，线性关系良好。
绝缘软母排2.2 电化学阻抗谱分析法在免疫传感器中的应用
在免疫传感器的研究中，电化学阻抗谱检测目标物的方法由于其高灵敏度、高特异性、检
测速度快、免标记等优势已经引起了极大的关注，在食品安全，疾病诊断等方面得到了广泛的研究和应用，实现了小分子痕量及细菌检测［10-13］。在电化学免疫传感器的构建中，一般是将抗体或抗原固定在导电的材料上，进而修饰电极，因此，抗原或抗体的固定是构建的关键步骤。Jia等［14］比较了二抗（羊抗人）（anti-hIgG）分别在裸金电极、碳纳米管/金电极（MWCNT/Au）、戊二醛/邻氨基苯硫醇/金电极（GA/4AT/Au）、胶体金/邻氨基苯硫醇/金电极（nanoAu/4AT/Au）等的吸附力和与人抗体hIgG的结合力，结果表明胶体金修饰的电极由于大的比表面积及共价结合等优势效果最好；Yan等［15］将克伦特罗抗体共价连接在羧基化修饰的石墨烯上，结合二抗的信号放大作用，检测限可以达到6.57 pg/mL，线性范围为0.01 ng/mL 到10 ng/mL。Maalouf等［16］通过生物-亲和素方法将大肠杆菌抗体结合在金电极表面的自组装膜上，用EIS的检测方法，成功实现了对大肠杆菌的检测；Li等［17］将嗜肺军团菌的抗体共价结合在金芯片上，构建了一次性免疫芯片系统，结合EIS的方法实现了对嗜肺军团菌的检测，可以进一步应用在临床和环境样品的检测中。EIS方法检测灵敏度好，特异性强，在免疫传感器中有广阔的应用前景。
2.3 电化学阻抗谱分析法在DNA传感器中的应用
DNA生物传感器是近年来发展迅速，较为新颖的一类传感器，是研究热点之一，具有较大的研究价值和应用前景。DNA是一种带负电荷的生物分子，当单链DNA或双链DNA附着于电极表面时，电极表面会出现负电荷层。在氧化还原电极的作用下，电极表面的负电荷层会对氧化还原电极产生静电排斥作用，这种作用会表现为在EIS中实部阻抗的增加，因此滴汞电极、金电极、玻碳电极等可被用作辨别单链DNA、双链DNA以及合成的多聚核苷酸的传感器材料。但是由于DNA分子较小，其能量变化（如生化特性、反应特性）也相对较弱，相应地应用于DNA传感器的传感技术要比其他生物大分子传感器更灵敏，因此需要开发灵敏度更高的生物传感器。近年来，一些新的电极替代材料相继被应用到DNA生物传感器的研究中，比如硅，量子点（如硫化镉，CdS等）。另外，传统电极经过不同的材料（如金属离子［18］或氧化物［19-20］，纳米材料［21-22］，聚合物［23-25］，磁性微球［26］等）修饰后也会极大地提高传感器的灵敏度。Manesse等［27］用金/无定型硅（Au/SiOx）复核膜结合DNA，用EIS方法进行检测，并用表面等离子共振 （SPR）的方法进行了结果确证。Li等［18］用不同的金属离子Mg2+、Zn2+、Ni2+和Co2+与DNA-肽核酸（PNA）膜结合修饰金电极，并用阻抗谱法比较了其不同的修饰效果，得出Ni2+与DNA-PNA膜结合效果最好，阻抗值最小，并且可以用来检测C-T错配。
采用电活性小分子作为杂交指示或者将纳米材料引入以及电活性小分子和纳米材料配合使用，提高电化学DNA生物传感器的灵敏度和特异性，最终目的是将其进行生产应用，如进行食品中残留农兽药的测定，临床上病源基因、微生物等的检测。Istamboulié等［28］设计了一种新型DNA传感器，将用六乙二醇修饰的含21个碱基的寡核苷酸通过碳二亚胺法固定在重氮化活化的碳丝网印刷电极上，并用循环伏安法和阻抗法进行表征，成功用于牛奶中黄曲霉毒素（AFM1）的检测，检测范围为2～150 ng/L，检测限是1.15 ng/L。在Huang等［29］的研究中，报道了可以用于检测人乳头瘤病毒（HPV）的DNA传感器，将捕获探针固定在石墨烯/纳米金/聚硫堇修饰的玻碳电极上（G/Au NR/PT-GCE），并用［Ru（phen）3］2+作为氧化还原指示剂和信号放大剂，成功实现HPV 的DNA测定，检测范围为1.0×10-13到1.0×10-10mol/L，检测限是4.03×10-14mol/L，另外有望用于人血浆样品中HPV DNA的测定，进而用于临床研究中。
2.4 电化学阻抗谱分析法在细胞传感器中的应用倒挂器
细胞作为组成有机体形态和功能的基本单位，对其结构和活动等的研究在生命科学研究中有着重要的基础作用。因此，以电化学为基础的细胞传感器的设计和构建，成为目前生物
传感器研究领域的一大热点。目前，已有文献报道的电化学细胞传感器主要是用来检测细胞的类别、活性、浓度，帮助揭示细胞结构功能关系或者外源分子对细胞功能的影响［30-33］。由于电化学阻抗谱无需标记物，制备简单且灵敏度高，因此基于电化学阻抗谱分析法的细胞传感器已逐步应用于细胞的检测，如张茜等［34］以聚苯胺纳米纤维-胶体金复合膜（PANI-NF/AuNPs）构建传感器界面，并修饰上转铁蛋白（Tf），利用Tf与人宫颈癌细胞（HeLa）表面转铁蛋白受体（TfR）间的特异性识别作用，捕获细胞到传感器界面，进而利用电化学阻抗谱研究姜黄素对HeLa细胞的抑制作用，灵敏度高，特异性好。2.5 电化学阻抗谱分析法在离子通道传感器中的应用
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