DOJINDO操作说明
1.在96孔板中接种细胞悬液(100 ml /孔)。将培养板放在培养箱预培养(在37℃，5% CO2的条件下)。 2.向每孔加入10 ml的CCK- 8溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响O.D值的读数)。
3.将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
5.如果暂时不测定O.D值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10 ml 0.1 M HCl溶液或者1% w/vSDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24小时内吸光度不会发生变化。
细胞增殖-毒性检测
1. 在96 孔板中配制 100 ml的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养 24小时 ( 在37℃， 5% CO2的条件下 )。
2. 向培养板加入10 ml不同浓度的待测物质。
3. 将培养板在培养箱孵育一段适当的时间 (例如: 6,12, 24 或48小时 )。
4. 向每孔加入10 ml CCK-8 溶液 (注意不要在孔中生成气泡，它们会影响 O.D值的读数) 。
5. 将培养板在培养箱内孵育 1-4小时。
6. 用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。
7. 如果暂时不测定O.D值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入 10 ml 0.1 M HCl溶液或者1% w/vSDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在 24小时内吸光度不会发生变化。注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加 CCK-8之前更换新鲜培养基，去掉药物的影响。当然药物影响比较小的情况可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。 制作标准曲线
1. 先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。
2. 按比例 ( 例如：1/2比例 ) 依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做 3-5个细胞浓度梯度，每组3-6个复孔。
3. 接种后培养2-4 小时使细胞贴壁，然后加 CCK-8试剂培养一定时间后测定O.D值，制作出一条以细胞数量为横坐标 (X轴) ，O.D值为纵坐标(Y轴) 的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量 (使用此标准曲线的前提条件是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入 CCK-8后的培养时间)。
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DOJINDO检测步骤
CCK-8 检测步骤
1. 向各孔中加入100 μl细胞悬液。a)
2. 在37℃下预孵育培养板。b)
3. 向各孔中加入各浓度的待测溶液c)10 μl。
4. 37℃下孵育。角蜡蚧
5. 向各孔中加入10μl的CCK-8溶液d)。
6. 37℃下孵育1-4小时。e)
7. 测定450 nm处的OD值。
a) 使用适当的培养基制备50,000-100,000个/ml的细胞悬液。
b) 建议使用CO2培养箱过夜预培养。
c) 使用培养基或P B S来制备溶液。
d) 如果待测溶液有还原性，测定不含细胞，但含有CCK-8的待测溶液在450 nm 处的空白吸光度。如果该吸光度很小，则可以直接加入CCK-8 ，如果吸光度相对较大，则需要除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的100 μl 培养基和10μl CCK-8进行检测。
e) 白细胞可能需要培养较长时间。
活力计算
细胞活力*（％）=[A(加药)-A（空白）]/[A（0加药）-A（空白）] ×100
A（加药）：具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度
A（空白）：具有培养基和C CK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度
A（0加药）：具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度
*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力
问答：
1.一个孔中应接种多少个细胞？
当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000 个/孔(100 μl 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500 个/孔(100 μl 培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。
2.能否用384孔板进行试验？
可以。向各孔中加入培养基体积10%的CCK-8溶液，如果加入的CC K-8体积太少，可以先将CCK-8溶液稀释1倍，然后加入培养基体积20%的量。
3.能否用24孔板进行试验？
可以。向各孔中加入培养基体积10%的CCK-8溶液。
4.酚红会影响检测吗？
不会。培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。
5.CCK-8与胸苷结合检测之间是否有相关性？
有。然而，请注意由于CC K-8使用的检测原理与胸苷检测的不同，因此结果可能不同。
6.CCK-8能否检测细菌细胞？
可以检测E.coli，但不能检测酵母细胞。向100 μli培养液中加入10μl CCK-8溶液，并培养1-4个小时或过夜。
7.CCK-8稳定吗？
CCK-8在0-5℃下能够保存至少6个月，在-20℃下避光可以保存1年。如果需要长期保存，我们推荐-20℃的储藏条件。
8.如果没有450 nm的滤光片，还可以使用哪些其他滤光片？
还可使用450 nm到490nm之间的滤光片。
9.如何减少由于C CK-8试剂在头上或孔壁上的残留所带来的误差？
可以在加样前用培养基稀释C CK-8试剂并混匀后加样。
10.CCK-8是什么颜？
应该是粉红。若颜不一样，有可能会影响测定。
11.CCK8能否对活细胞进行染？
不能。因为CCK8的主要成分是一种水溶性的四唑盐(WST8)，并通过电子载体1Metho xy PMS 将活细胞中的电子交换到培养基中的WST8上。由于生成的甲ā也是高度水溶性的，因此CCK8不能对细胞进行染。
12.CCK8检测溶液对细胞是否有毒？
CCK8溶液自身因为高浓度的1Meth oxy PMS的存在而具有一点毒性。但是，加到培养基中的CCK8是没有毒性的，因为被稀释了10倍。因此，长时间的培养，如过夜或者培养数天是可
以的。同一个细胞培养液在CCK8检测后还可以用于其他细胞增殖检测，如结晶紫检测，中性红检测或者DNA荧光检测等。由于每种细胞对于CCK8的耐受力都不同，因此在需要进行长时间培养时，先检测一下细胞在加入CCK8培养后的活力。
13.在做加药实验时，药物对测定是否有影响？如何解决？
有时会有影响。如果药物具有还原性，会和CCK8发生显反应，增加吸光度。解决办法：首先要确认药物是否有吸收，在含有药物的培养基中加入C CK8，测定450 nm的吸光度，如果它的吸光度比不含药物的培养基(加CCK8)的吸光度高，则证明药物有影响，可在加CCK8之前更换培养基，去掉药物的影响。
14.每次测定的数值不一样，是什么原因？如何解决？
可能会有以下几个原因：1. 当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。2. 有可能会因为C CK8沾在壁上而产生误差，建议在加入CC K8后，轻轻敲击培养板以帮助混匀。
3. 每孔的细胞数量过多或过少。请预先在1,000100,000个/孔范围内摸索条件。
15.如何设定空白对照？
在不含细胞的培养基中加入C CK8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验(细胞毒性实验)时，还应考虑药物的吸收，可在不含细胞，加入药物的培养基中加入CC K8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度作为空白对照。
人造石板16.哪些物质会影响CCK8的测定？
当有还原性物质存在时会影响CCK8的测定，例如含有维生素C的Gluc ose等(一般培养基中的量不多，酚红或血清不影响测定)。在有酚红存在的情况下，会增加空白吸收，但不影响测定，扣除空白吸收即可。
17.在实验中吸光度值太高，如果不能减少细胞数量，如何解决？对等网线
可以缩短加入C CK8后的培养时间。例如：可以把加入CC K8试剂后的培养时间由2小时缩短为1小时。
18.设定参比波长的目的是什么？必须设定吗？
不一定要设定。CCK-8试剂在参比波长没有吸光度。设定参比波长的目的是为了取出由于样品混浊所带来的吸收。
19.说明书上仅写了96孔板的测定方法，如果使用24孔板货12孔板，应该加多少量C CK-8试剂？…
一般情况下建议加入CCK-8试剂的量是培养基体积的1/10。
20.在CCK-8显过程中，如何终止反应？
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有一下几种方法（96孔板）：1、在显反应后，将培养板放置4℃冰箱内。2、每孔加10 μl 0.1 M HCL溶液。3、每孔加10 μl 1%（w/v）的SDS（十二烷基硫酸钠）溶液。注意：反应停止后，应在24小时之内测定。
21.必须预培养细胞吗？
不一定。如果要向保持细胞的最好状态，建议预培养细胞。如果不做细胞预培养，细胞内的脱氢酶可能会不稳定。也有人不做细胞预培养，但在做标准曲线和检测时需要统一检测条件。
22.如果加入的药物中含有金属，是否会有影响？
金属对CCK-8显有影响。当终浓度为1Mm的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显反应，使灵敏度降级。如果终浓度是10 Mm的话，将会100%抑制。
23.CCK-8试剂的保存条件？
在避光条件下C CK-8试剂在4℃可保存一年。如果需要保存较长时间的话，推荐在-20℃下保存。但是CCK-8若反复解冻和冰冻将会增加空白吸收，从而影响检测结果，若经常使用可将试剂存放在4℃冰箱内保存。
24.预培养后，更换培养基需要细胞计数吗？
一般情况下用胰蛋白酶处理对数增长期的细胞，用血球计数盘计数，制备成一定浓度的细胞悬液即可。如果想要精密计数细胞的话，可以预培养后取培养基用血球计数盘进行计数。
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25.CCK-8对于不同的细胞，灵敏度是否一样？
不一样，悬浮细胞与贴壁细胞相比较难染。对于贴壁细胞，一般加入CCK-8培养1-4小时吸光度已经很高，但对于悬浮细胞则可能吸光度较低，可以通过延长C CK-8的加入时间或增加细胞数量来解决。
26.悬浮细胞和贴壁细胞在数量上有何区别？
悬浮细胞由于染比较困那，一般需要增加细胞数量和延长培养时间。贴壁细胞染比较容易，若细胞数量过大，有时吸光度会超过酶标仪的读数。
27.应该每次做标准曲线吗？
建议每次做。虽然细胞是一样的，但是细胞的状态不一定一样，对于状态不一样的细胞，建议每次做标准曲线。如果试剂的批号不一样，灵敏度可能会有轻微的差异，对于不同的批号建议分别做标准曲线。
28.有时在药物作用情况下，细胞已经死亡，但是脱氢酶的活性还在，是否能计算细胞数量？…
不能。由于CCK-8是通过和细胞内的脱氢酶进行反应间接反映活细胞数量，如果细胞已经死亡，但脱氢酶的活性还在，则试剂测定的细胞数量将会比真实值高，不能真实反映活细胞数量，建议采用别的方法测定。
29.实验之前，是否需要先检测一下培养基和CCK-8是否会反应？
建议使用一个孔作一下检测，因为有培养基中可能含有氧化还原反应的物质，在正式实验之前有必要先确认培养基和CC K-8是否反应。一般正常在的O D值应该在0.4以下。
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