摘要：天然发酵酸菜是中国传统特食品，风味独特。深受消费者的喜爱和青睐，被视为生活中不可缺少的调味品。天然发酵酸菜是由生态环境中的乳酸菌和白菜混合而成。由于未经巴氏消毒的蔬菜表面微生物种类复杂多样，在发酵过程中容易引入有害微生物。本研究采用形态学和分子生物学方法对天然发酵酸菜中的微生物多样性进行了分析和研究。结果表明，天然发酵酸菜中主要含有乳酸菌钠、芽孢杆菌钠和酵母菌钠，且乳酸菌钠的比例远远高于芽孢杆菌钠和酵母菌钠。本研究可为今后酸菜发酵的规模化和标准化提供理论依据。 关键词：酸菜；发酵；微生物多样性；大规模的生产
1引言
中国人口众多，物产丰富，地大物博，具有民族特的传统食品分布遍布全国。发酵蔬菜是最具特的传统食品之一。酸菜是最具代表性的发酵蔬菜之一，在现代生活中发挥着重要的营养作用。它是由新鲜蔬菜经过微生物的一些理想的生化反应而制成的蔬菜产品。在
发酵中起主要作用的微生物是乳酸菌。适量食用酸菜对人体健康有益，可促进肠道菌生长，具有降低胆固醇、降低血压、降低血脂、提高人体免疫力等一系列益处。它还能降解草酸，预防肾脏疾病，帮助人体吸收铁，因此受到人们的喜爱[1]。目前，酸菜多采用自然发酵的方法。发酵过程不易控制，由于添加了不适当的盐会产生过多对人体有害的亚硝酸盐，带来严重的食品安全风险，因此在一定程度上限制了酸菜的生产数量和质量。适当浓度的盐溶液不仅可以控制酸菜中乳酸菌的生长和代谢活性，影响酸菜的风味和品质，还可以使酸菜不易腐坏，增加保质期。传统的纯培养法是研究酸菜早期微生物多样性的主要方法。根据培养基中培养的微生物的形态或生化特征进行鉴定，再通过显微观察和生化鉴定对样品中的微生物种类进行分类鉴定。传统的纯培养法原理简单，实验设备要求低，微生物形态观察和计数方便的优点，但它也有结果不能充分反映样品中微生物多样性的缺点，虽然依赖纯培养法有许多局限性，但这种方法仍然极大地促进了微生物学的发展[2]远程定向强声扩音系统摇臂喷头。
安装网2材料与方法
2.1试验材料和设备
卷心菜：从当地超市购买；盐：无碘盐350g深矿盐袋；干酪乳杆菌：中国微生物研究所提
供。无锡兴顺生物科技有限公司上海天泰科技有限公司；山东奥莱博仪器有限公司PhmeterOhaus仪器（上海）有限公司济南同鑫生物科技有限公司高压蒸汽杀菌罐山东博科生物实业有限公司常州凯航仪器有限公司ZD-9560卧式脱振动筛北京京创泰宁伟业科技发展有限公司；深圳市奥德玛电子科技有限公司鹤壁市鑫鑫诚信仪器有限公司苏州安泰净化有限公司三洋、日本；奥林巴斯显微镜（中国）有限公司德国Ependoff的移液管[3]。 2.2试验所需引物
试验所需引物均由上海生物技术有限公司合成。
2.3培养基制备
2.3.1MRS培养基ic卡防水水表
牛肉精蛋白胨8g，酵母精粉4g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸铵3g，醋酸钠3g，葡萄糖18g，硫酸镁1g，琼脂18g，水1000mL,ph6-7121℃灭菌20min。
2.3.2YPD介质
葡萄糖18g，酵母粉8g，蛋白胨18g，琼脂18g,pH6-7，蒸馏水1000mL121，℃灭菌20min。
2.3.3PDA培养基
土豆200g，葡萄糖18g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，磷酸二氢钾1g，琼脂18g,pH6-7，蒸馏水1000mL,121℃灭菌20min。
2.4工具包
细菌基因组DNA试剂盒，琼脂糖DNA回收试剂盒。
2.5自然发酵
酸菜生产工艺选用优质白菜→风干→加盐→罐装发酵→酸菜。挑选优质蔬菜，晾干3天，去黄叶，用水清洗，洗净的白菜放入发酵罐密封，加1%-1.5%盐，控制发酵罐温度15-20℃，每2天采样，连续30天[4]。
2.6菌株的分析、纯化和计数
发酵过程中，每隔2d取出20mL发酵液样品，在超净工作台上稀释10100、1000、10000次，分别包覆在MRS、YPD、PDA3培养基上，每种稀释浓度各3板，检测菌落数量。
2.7形态鉴定
将分离在MRS、YPD和pda上的菌落进行分离，观察形态学纯化得到的菌株的微观形态特征（菌落大小、形状、直径和光泽）。
2.8样品DNA提取
1.916SrDNA分析分离纯化菌株进行形态学鉴定后，利用16SrDNA序列在分子水平上对待测菌株进行进一步的比较和鉴定。系统发育树构建过程：将获得的序列放入NCBI和数据库中进行比对，比对后确定总类。本组所有数据均从NCBI数据库下载，所得数据与这些数据合并。合并后的数据上传到铁道部网站进行分类。将订购的序列上传到cipress网站，并在网站上建立最大简约树。最后，对该物种进行系统发育分析。
香蜜果3结果与分析
3.1菌种分离纯化
随着发酵时间的增加，自然发酵酸菜的微生物多样性先增加后保持不变，从三种不同培养基中分离出的菌株数量也不同。在MRS培养基中分离到7株，在YPD培养基中分离到4株，在PDA培养基中分离到3株。分离效果如下：MRS培养基〉YPD培养基〉PDA培养基[5]。
3.2形态鉴定
从MRS、YPD和PDA三种培养基中共分离到14株。分别观察其形状、大小、有无凸起、表面是否光滑、光泽、颜。分离得到的细菌均为乳白，大小小于1mm，形态以圆形和近圆形为主。根据形态特征大致可分为乳杆菌、不动杆菌、酵母菌和大肠杆菌四大类。结果表明，天然发酵酸菜具有丰富的微生物多样性。
3.316SrDNA识别
以上14株菌株经16SrDNA鉴定，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。在提取的DNA中加入正向引物和反向引物。PCR检测后，所得PCR产物送上海生物技术有限公司测序。获得原始序列后，在BioEitd软件上对原始序列进行检查和拼接，并将拼接序列放入NCBA数据系统中进行Blast比对。在初步确定微生物分类单元后，下载该分类单元的相关物种序列进行物种多样性分析。
3.4系统发育分析
相关数据从NCBI数据库下载，采用MAFFT排序，在BioEitd中手动编辑，剔除冗余和不合格序列。自然发酵的酸菜可以分为三大类：乳酸菌、大肠杆菌和念珠菌。其中乳杆菌（Lactobacillus）是天然发酵酸菜中的主要菌，占11/14，而酵母菌（酵母）和芽孢杆菌（Bacillus）所占比例均较低，仅占2/14[6]。
4结束语
蔬菜的发酵主要是由微环境中微生物的生长和代谢活动引起的，而微生物的各种生长和代谢活动对发酵蔬菜的各个方面都有一定的影响。发酵蔬菜除了含有蔬菜本身丰富的营养成分外，还含有乳酸菌发酵形成的乳酸、核苷酸、醇、醛、酮、酯等物质，这些物质不仅赋予酸菜独特的风味，而且对人体健康也大有裨益。由于加工类型不同，发酵过程中使用的原料、发酵温度、盐溶液浓度、发酵工艺等因素都会对乳酸菌的落结构产生影响，其中发酵温度和盐溶液浓度对其影响较大。发酵酸菜具有营养丰富、风味独特和开胃健脾等特点。目前，酸菜的发酵主要是家庭式小规模生产，存在发酵时间长、产量不稳定等诸多因素，在泡菜发酵过程中，细菌的结构及其生长代谢活性对泡菜的品质有显著影响，也有研
究表明，盐度是影响大肠杆菌生长的最重要因素。自然发酵的酸菜中，乳酸杆菌的种类占有主导优势，其次为酵母菌和芽孢杆菌。然而，目前对酸菜中微生物的结构和活性、相互作用关系以及相关的生理生化反应缺乏科学、全面地研究和标准。特别是对不同加工方式的酸菜以及日常生活和工业中乳酸菌的生长规律缺乏统一系统的指导标准和应用。这些都将成为未来蔬菜发酵研究的重要课题。
雨棚制作参考文献：
[1] 陈龚.试论中国泡菜的历史与发展[J].食品与发酵科技，2010,46(3):1-5.
[2] 尼海咯，邓冕，冯月玲.东北地区酸菜产业现状及发展对策[J].中国调味品，2011,36(6):10-12。
[3] 燕平梅，魏爱丽．蔬菜半固态发酵的研究[J].中国调味品，2020,45(11):34- 37,50.
[4] 李继文, 姜爱丽, 胡文忠,等.东北酸菜的发酵工艺及使用食品抗氧化剂和防腐剂的必要性[J].食品安全质量检测学报,2018,9(19):5090-5094.
[5] 何家乐, 吴幻, 刘梦绮,等.添加糖和乳酸菌对东北酸菜发酵效果的影响[J].中国调味品,2021,46(5):22-27,44.
[6] 朱翔, 汪冬冬, 明建英,等.四川泡菜和东北酸菜在发酵过程中的物质成分变化[J].中国调味品,2021,46(4):78-81.
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议