2021年第40卷第3期
总第349期 -101-
中国酿造
研究报告
陈丽艳,邢怡,宓月光,孙国东,孙银玲,曹阳,冯丽娜,王伟明*
收稿日期:2020-09-03
修回日期:2020-10-29
基金项目:国家自然科学基金项目(U20A20400);黑龙江省自然科学基金联合引导项目(LH2019H094);黑龙江省应用技术研究与开发计划
项目(GA17C013)
作者简介:陈丽艳(1971-),女,主任药师,硕士,主要从事药食同源中药发酵及中药与肠道微生物相互作用研究工作。
*通讯作者:王伟明(1966-),女,研究员,博士,主要从事中药新药及大健康产品研发工作。
(黑龙江省中医药科学院,黑龙江哈尔滨150036)
摘要:采用双向固体发酵技术,通过发酵菌种和发酵时间的考察,以梔子昔转化率为评价指标筛选梔子豉最佳发酵工艺。采用高效 液相谱(HPLC 定梔子q
和 的含量,采用紫外分光光度 定梔子豉水溶的吸光度值果表明,梔子
蒿、桑叶水煎液浸泡黑豆作为发酵基质,接种枯草芽抱杆菌(Bacillus subtili5和伞枝犁头霉(.Fusarium umbel/otu ;复合菌(1:1)于2+ "
168 h 制备梔子豉,此
条件下,梔子q 完全
生成的梔子 价最高(OD 59o nm <为0.575),精 丝
和天冬氨
酸含量分别下降了 94.9%、71.6%和52.0%,而脯氨酸、组氨酸和谷氨酸含量分别升高了 3.4倍、1.5倍和1.5倍。发酵法制备梔子豉实现了 主要成分的体外生物转化及药效提高,可为梔子豉汤新剂型及食疗产品开发提
关键词:梔子豉汤 ;环烯ef ;梔子;生物
中图分类号:R378.2
文章编号:0254-5071 (2021)03-0101-05
doi:10.11882/j.issn.0254-5071.2021.03.018
引文格式:陈丽艳,邢怡,宓月光,等梔子豉汤固体发酵菌质的制备及主要成分含量变化[J].中国酿造,2021,40(3):101-105.
Preparation and main components content change of solid-state fermentation product of Zhizichi decoction
CHEN Liyan, XING Yi, MI Yueguang, SUN Guodong, SUN Yinling, CAO Yang, FENG Lina, WANG Weiming *
(Heilongjiang Academy of Traditional Chinese Medicine, Harbin 150036, China)
Abstract : The Zhizichi was prepared by bidirectional solid-state fermentation technology, and the fermentation technology was optimized by investigating the fermentation strain and times and using the conversion rate of geniposide as evaluation index. The contents of geniposide, genipin and amino acids were
detected by HPLC, and the absorbance value of aqueous solution of Zhizichi was determined by ultraviolet spectrophotometry. The results showed that using
the black bean immersed in the decoction of Gardenia jasminoides , Artemisia annua and Morus alba as the fermentation substrate, Zhizichi was fermented
with Bacillus subtilis and Fusarium umbellatum (1:1) at 28 " for 168 h. Under the optimum fermentation condition, the geniposide was completely converted and the gardenia blue value was the highest (the OD 590 阿 value 0.575). The content of arginine, serine and aspartic acid decreased 94.9%, 71.6% and 52.0%,
respectively, while the content of proline, histidine and glutamate increased 3.4, 1.5 and 1.5 times, respectively. The in vitro biotransformation and efficacy
of the main components of Zhizichi prepared by fermentation method was achieved, which provided a basis for the development of new Zhizichi decoction and food therapy products.
Key words : Zhizichi decoction; solid-state fermentation; iridoid; gardenia blue; biotransformation
梔子豉汤为张仲景的经典名方,由梔子和淡豆豉两味 药食同源中药配伍而成,为清宣胸中郁热,虚烦懊恼
不得眠之良方叫现代药理研究表明,梔子豉汤具有抗抑郁 作用,环烯ef 类成分为其主要药效物质,其中梔子q 含
量最高冏。药代动力学和肠吸收代谢动力学研究表明,梔
子q 生物利用度低, 经肠 生物及肠 其代谢为 吸收利用问 而 不稳定,在一定条件下可与
生成稳定的梔子蓝冋,且梔子
梔子q 和 [7] 冏研究 ,梔子豉汤 用 梔子 淡豆豉 的方 由
梔子豉汤在煎煮过程中存在:梔子q 炉葡萄糖昔酶〉京尼平(不 稳定)与含 迪物 - 物(梔子的
,其中 - 物 其抗抑郁作
用优于梔子q 和京尼平w 淡豆豉为特殊的发酵类中药饮
,含有一定 量的 生 ,具有 肠
作用[11],在梔子豉汤 中,由于高
一 分有 生物
的 , 分 现梔
子q 的生物转化,且京尼平与氨基酸的
定
过程。
研究在梔子豉汤 方 , 用
,梔子
浸泡黑作为 质,
以枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis )和伞枝犁头霉(Fusarium
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•102Serial No.349China Brewing Research Report
umbellatani)复合菌作为发酵菌株制备梔子豉,通过发酵菌株及发酵时间的考察,以梔子;的转化率为评价指标,在体外实现梔子;的降解及京尼平-氨基酸复合物的动态积累过程,为提高梔子豉汤药效及新产品开发提供依据。1材料与方法
1.1材料与试剂
1.1.1药材和菌株
青蒿和桑叶(批号170101):河北祁新中药颗粒饮片有限公司;黑豆(批号20170503):北京药有限公司;
梔子(批号171001):中药饮片有限公司
枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)DDC-SP1、伞枝梨头霉(Absidia corynbifera)DDC-SP11、米根霉(Rhizopus oryzae) DDC-SP14:豆豉饮片中,中
物菌中(号为17-066-161-169, 17-276-852-1123和17-066-163-171),三株菌经筛选具有较高的和0-昔酶活
1.1.2化学试剂
梔子;对照品(批号Z-003-170222)(纯度>98%)、京尼平品(批号J-028-161216)(纯度>98%):成
生物有限公司;17种氨基酸水解标样混合:酸(Asp)、酸(Ser)、酸(Glu)、酸(Gly)、酸(His)、酸(Arg)、酸(Thr)、酸(Ala)、酸(Pro)、酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、绷氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、酸(Lys)、酸(He)、酸(Leu)、
酸(Phe);AccQ-Fluor(酸、、
、酸-酸):Waters公司、(为)为产分析纯。
1.1.3培养基
营养琼脂(nutrient agar,NA)培养基:蛋白"10.0g_L,牛肉粉3.0g/L,氯化钠5.0g/L,琼脂15.0g/L,加热溶解于1000nL蒸/留水中。121!高压灭菌15nin。
肉汤(NB)培养基:称取"10.0g/L,牛肉浸粉3.0g/L,氯化钠5.0g/L,加热溶解于1000nL蒸憎水中。121!高压灭菌15nin。
马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar, PDA)培养基:马铃薯浸 6.0g/L,20.0g/L,20.0g/L,加热溶解于1000nL蒸/留水中。115!高压灭菌20nin。
马铃薯葡萄糖肉汤(potato dextrose broth,PDB)培养基:马铃薯浸 6.0g/L,20.0g/L,加热溶解于1000nL 蒸/留水中。115!高压灭菌20nin。
1.2仪器与设备
Waters Alliance2489高效液相谱(high performance liquid chronatography, HPLC)仪:美国Waters公司;DHP9272恒温培养箱:上海一恒科学仪器有限公司;UV/VIS Lanbda 365紫外-可见分光光度计:美国PE公司;BSA224S电子天平:德赛多利斯学仪器有限公司;HNY-2102C恒温培振荡器:津欧诺仪器有限公司;LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器:上海申安医疗器械厂;DH6-907385-II I电热恒温鼓风干燥箱:上海新苗医疗器械制造有限公司。
1.3方法
1.3.1梔子豉汤各药味配伍剂量的换算
《伤寒论》记载梔子豉汤由“梔子十四个(掰),香豉四合(绵裹)”配伍而成。依据东汉时期量衡的计量方法,换算为现代的梔子15g、淡豆豉50g问。《中药》淡豆豉质量标1kg豆青蒿、桑叶为70〜100g叭此,梔子豉汤制备中梔子:青蒿:桑叶:黑豆质量比为15:5:5:50。
1.3.2发酵基质的制备
1.3.1的取梔子(打碎)、桑叶、青蒿加10倍水煎煮2次,每次1h,过滤,合滤浓100nL,的黑豆中(黑豆药的为1:0.8(g:nL))浸泡12〜16h,待药液吸尽,于121!高压灭菌30nin,即
1.3.3菌液的制备、接种及培养
分别利用枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)DDC-SP1>伞枝头(Absidia coryn bifera)DDC-SP11、(Rhizopus oryzae)DDC-SP14三株菌采用单菌和双菌发酵,发酵品号及采用的发酵菌株为1号:菌株DDC-SP1;2号:菌株DDC-SP11;3号:菌株DDC-SP144号:菌株DDC-SP1和DDC-SP11(1:1,V/V) ;5号:菌株DDC-SP1和DDC-SP14(1:1, V/V);6号:菌株DDC-SP11和DDC-SP14(1:1,V/V)。按照细菌和菌的培温,菌菌(菌株DDC-SP1)发酵温37!,霉菌和复合菌发酵温为28
将菌株DDC-SP1接种至营养肉汤中于37!、120r/nin摇培18〜24h,枯芽抱杆菌DDC-SP1菌液(108〜109CFU/nL);菌株DDC-SP11和DDC-SP14分别接种至马铃薯葡萄糖培中,于28!、120r/nin培3〜5d,
别制成抱子菌悬液(105〜106抱子/mL)。将1.3.2的发酵基质上菌,菌发酵样品菌量为2mL/100g,菌发酵品菌菌量为1mL/100g,混匀,除1号品于37!、120r/nin摇床培养外,其余5于28!、120r/nin 摇床培,于发酵时间取,60!干燥。 1.3.4样品中梔子F和京尼平的含量测定
高效相KHPLC)梔子;、京尼平和基酸的量
供试品溶液制备:分别取发酵0、1d、3d、7d、10d、15d 的干燥品,碎成(80),取粉末3.0g,置
塞锥形瓶中,加入体积分数为50%50nL,量,摇,40nin,量,体积为50%量,以3000r/nin20nin,取上
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液10 $L 加体积分数为50%甲醇定容至50 mL ,摇匀,0.45 滤膜过滤备用。
对照品溶液的配制:精密称取梔子J 和京尼平对照品, 分别加体积分数为50%甲醇制成400 !,mL 的对照品溶液,
用体积分数为50%甲醇进行系列稀释,0.45 滤膜过滤。
HPLC 谱条件:参照李翔等1142的方法,Symmetry C i 8
柱(4.6 mm x 150 mm , 5 |xm );流动相A 为甲醇,流动相;为
停车场收费管理系统
0.5%冰醋酸;流速1 mL/min ,检测波长254 =m ,进样量10応,
柱温40 °C ;梯度洗脱程序设置以流动相A 计:0〜2 min , 10%;
3〜8 min , 22%; 9〜13 min , 30%; 14〜40 min , 60%; 41〜42 min ,
30%; 43〜50 min , 10%。1.3.5样品溶液吸光度值测定
京尼平可 酸成 微型汽油机
素,
度不一,分子质量相差很大,一般以价或者
度 量品质115]0分别精密称取不 梔子
样品 1 g ,加 100 mL 摇匀, 取20 min ,
置过滤,取滤液,以6 000 r/min 15 min ,取 液,于
波长590 nm 测 度 01.3.6样品游离氨基酸含量测定
用 液相谱- 测器法(high performance
liquid chromatography-fluorescence detector , HPLC-FLD )测定
酸的量。
在确定7 d 为最佳发酵时间的前提下考察游离氨基酸 的含量变化,分别于发酵0、6 h 、12 h 、24 h 、48 h 、72 h 、120 h 、
168 h 取样,60 C , 参照宓月光等购游离氨基酸含量
测定方法,分别精密称取 样品 200 mg ,加0.1 mol/mL 的盐酸10 mL ,混匀,超声提取40 min , 8 000 r/min 离心20 min , 取 液过0.45 !m 滤膜,进样量10 !L o 2结果与分析
2.1梔子豉发酵过程中梔子)和京尼平的含量变化
对照品梔子J (A )、京尼平梔子 样品(C )的
高效液相谱 1; 1可,梔子J 24〜390 !g/mL
质量度
系, 方程为Y x 6 962.804 4A Z35 420.657 1,相关系数R 为0.997 4;京尼平在
22〜355 !g/mL 质量浓度
系,
线性方程为Y M10.56A Z32 838,相关系数R 为0.998 2,梔子
J
和京尼平谱 分
样品 过程梔子J 量
threadx系统
2。2可,
1 ,2
3和6样品梔子J 量, ,3
样品梔子J 含量
长逐渐下降,2和4样品均在7 d 为0,4样品3 d 解快,1 3和5样品
15 d 梔子J 完全转,6转 慢 2 3和6的
菌 为霉菌,1 长
迟缓期,因此梔子J 未解,28 "恒温1 d 可能利 梔子J 的溶出
小幅
趋势,
1枯草芽抱杆菌,由于细菌生长较快,酶活逐渐 使梔子J 量
;3〜7 d 霉菌
对数 长期, 梔子J 微 酶的作用 快速降
解 表明,用菌株DDC-SP 1和DDC-SP11
菌
7 d 梔子J 转 快。
图1
+子-(A )、京尼平(B )及+子豉样品(C )高效液相谱图
Fig. 1 HPLC chromatography of geniposide (A), genipin (B) and
Zhizichi sample (C)
图2各组样品发酵过程中+子-含量变化
Fig. 2 Chan g es of garde n o s ide contents in each group of samples
during fermentation
样品 过程京尼平含量 3。
图3可,1 2和4样品京尼平含量 7 d 为0,推
测此段京尼平 酸可能完全成 ,
3d
京尼平降解速率1号〉4号〉2号;3号样品发酵15d 京尼平转
化完全,而6号样品京尼平转化最慢,15 d 仍含有0.14 mg/go 除1号样品外,
样品京尼平量先 后小幅
再 的趋势,可能
菌酶系的构成活力相
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关,除1号为单一枯草芽抱杆菌发酵外,其他各组的发酵菌 均含有霉菌,发酵1〜3 %霉菌生长处于迟缓期。发酵第1天, 由于梔子H 较少量转化为京尼平,梔子中原有的京尼平与 大豆中的氨基酸结合生成梔子蓝而使京尼平含量下降,
在1〜3 %又有小幅升高,此阶段细菌正处于生长繁殖的活
跃期,梔子H 转化速度高于京尼平与氨基酸结合的速度,
使京尼平产生积累,发酵3 %后随着梔子H 和大豆蛋白的 逐渐降解,生成的京尼平动 与 氨基酸结合生成梔子
蓝 合, 京尼平含量 速下降。结 , 菌株
DDC-SP 1与DDC-SP11合菌发酵
梔子H 降解为京尼平且于发酵7 %完全转化。
图3各组样品发酵过程中京尼平含量变化
Fig. 3 Changes of genipin contents in each group of samples during
ferme n tatio n
综上,2号和4号样品均在7 %梔子H 和京尼平含量降
为0,— 面 梔子H 完全降解,一方面 京尼平完全与氨基酸 成 合 , 而4号在第3天 成 转化
速 。4号 菌 DDC-SP 1与DDC-SP11复合菌发
酵 梔子,发 梔子H 的转化
京尼平-氨基酸的结合。
2.2不同发酵时间梔子豉水溶液吸光度值变化
各组样品发酵过程中吸光度值(0D5%血值)变化结果
见表1。
表1各组样品发酵过程中0D 阪口值变化
Tablel Changes of
。。如
;value of each group of samples during fermentation
4D 590 nm
发酵时1'可/%样品N 发酵基质
1
371015
10.1640.3240.3450.3120.3622
0.165
0.205
0.190
0.163
www.3x6c
0.31230.155
0.1580.1800.1450.3650.10740.2790.308
0.5750.437
0.4975
0.222
0.2520.3750.3380.234
60.2180.205
0.165
0.264
0.209
由表1可知,随着发酵时间的延长,各组样品溶液的吸光度值未呈规律性变化,但4号样品发酵7 %吸光度值最大
为0.575, 1产生的梔子蓝 高。由于各组发酵菌
的 活 ,梔子H 和大豆蛋白的转化 在
,每组样品中京尼平与 氨基酸生成梔子蓝 合
的组成含量一样。
问 ,赖氨酸、
氨酸氨酸和氨酸与京尼平
较,而天冬
氨酸 氨酸和 氨酸 较 , 氨酸
, 此
梔子豉水溶液OD 56)血值不呈规律变化。结果表明,采用菌DDC-SP 1与DDC-SP11复合菌发酵7 %生成梔子蓝的
高。
2.3梔子豉最佳发酵工艺
梔子 发酵 为梔子 15 g 5 g
叶5 =,加10倍量水煎煮2次, 1 h ,合 ,滤
至100 mL ,拌入净黑豆(黑豆与药液的料液比为1.0:0.8
(g :mL))浸泡12〜16 h ,待黑豆将药液吸尽,装袋,121 "
高压灭菌30 min ,稍凉,分别接种菌株DDC-SP 1菌液(108〜
109 CFU/mL)和菌株DDC-SP11 菌液(105〜106抱子数/mL)
各1 mL/100 g ,摇匀,于28 "培养168 h (7 %),60 "干燥,即
得梔子豉。
2.4梔子豉发酵过程中游离氨基酸的含量变化
在确定梔子 的基础上,考察发酵7 %内样品
游离氨基酸的含量 化氨基酸混合标样’样品的HPLC-FLD
谱图见图4,各组样品氨基酸含量测定结果见表2。
时间/min
l.Asp ;2. Ser ; 3. Glu ; 4. Gly ; 5. His ; 6. NH 3; 7. Arg ; 8. Thr ; 9. Ala ; 10. Pro ;11. Cys ; 12. Tyr ;13. Val ; 14. Met ; 15. Lys ; 16. Ile ; 17. Leu ; 18. Phe 。
图4氨基酸混合标准品及梔子豉样品的H PLC-FLD 谱图
Fig. 4 HPLC-FLD chromatogram of mixed ami n o acid stan d ards and
Zhizichi samples
由图4可知,17种氨基酸衍生物均达到基线分离,分离
良好。由表2可知,氨基酸含量于发酵24〜72 h 变化明显,
72 h 后趋于平稳。发酵基质(0 h)中精氨酸(Arg)含量 高为
3.16 mg/g ,丝氨酸(Ser)和脯氨酸(Pro 之,别为0.81 mg/g
和0.73 mg/g ,1他氨基酸含量在0〜0.3 mg/g (所有样品中 均 出现胱氨酸 谱峰)。随着发酵 的 长,样品中不氨基酸含量 化趋势不一 ,168 h 精氨酸(Arg 含量下
降了94.9%,丝氨酸(Ser)和天 氨酸(Asp)含量 别下降
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了71.6%和52.0%,而脯氨酸(Pro )含量升高了3.4倍,组氨 酸(His )和谷氨酸(Glu )含量均升高1.5倍,其余氨基酸含量 未发生明显变化。梔子豉发酵过程中出现了几种氨基酸含
量上升或下降的现象,其中精氨酸含量下降幅度最大,可能
京尼平与精氨酸结合较多K1A20M ,另外,梔子豉发酵过程复杂, 涉及多种成分的变化及相互作用,尚需进一步深入研究。
表2梔子豉发酵过程中17种游离氨基酸的含量变化
Table 2 Chan g es of 17 kinds of free ami n o acids contents duri n g
Zhizichi fermentation
mg/g
氨基酸
发酵时间/h
0612244872120168
Asp*0.250.270.280.30
0.21
0.12
0.100.12
Ser*
0.81
0.780.68
0.710.250.150.19
0.23Glu #0.250.300.310.35
0.280.250.330.37Gly 0.050.070.050.06
0.04
0.040.070.08His #
0.190.21
0.150.210.330.200.240.28Arg* 3.16 3.38 3.08 3.56 2.070.880.260.16Thr 0.090.120.090.13
0.090.070.080.09Ala 0.24
0.32
0.300.290.29
0.220.280.30Pro #0.730.930.99
1.03
1.82
2.02
2.18
2.46
Cys
ND ND ND ND ND
ND ND ND
Tyr 0.11
0.200.140.23
0.130.10
0.130.15Val 0.060.090.08
0.080.050.050.080.09Met 0.020.070.030.070.030.030.040.04Lys
0.070.120.090.13
0.080.07
0.100.12Ile 0.04
0.080.060.080.04
0.030.060.07Leu
0.050.08
0.070.080.050.040.09
0.10Phe 0.08
0.130.12
0.13音箱的制作
0.05
0.04
0.05
0.06
注)”表示含量下降表示含量上升,“ND ”表示未检出。
3结论
发
成为开发中药新药的新途径,
国家 新药一 用
而成问。本研究在梔子豉汤原方基础上,采用双向固体发酵技术制
梔子豉,
了其最发酵
梔子
作 发酵基 1 种
(Bacillus subtilis )和伞枝犁头霉(Fusarium umbellatum)复合 菌(1:1, W V )于28
"发酵168 h 。此条件下,梔子昔和京尼
平含量降为0,生成的京尼平-氨基酸复合的 最高 (ODa 皿为0.575),精氨酸(Arg )、丝氨酸(Ser )和 氨酸 (Asp )含量分别下降了 94.9%、71.6%、52.0%,而脯氨酸(Pro )、
组氨酸(His )和 氨酸(Glu )含量含量分 升高了 3.4倍、 1.5倍、1.5倍。
梔子豉 成分的
转化机制制备梔子豉,明确了其最佳发酵工艺及主要成分含量变化1
过 大 药基
的新
新药开发
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