李红波;胡梁斌;王淼焱;孙俊良
【摘 要】研究了香菇多糖、海带多糖、石耳素等10余种多糖对黄曲霉生长及产毒的抑制作用,发现海带多糖、香菇纤维素、马铃薯直链淀粉、A型大豆多糖能够明显降低黄曲霉菌丝产量;同时海带多粮、香菇纤维素、马铃薯直链淀粉、香菇多糖、绿豆多糖抑制了黄曲霉菌产毒,其中海带多糖、马铃薯直链淀粉、香菇纤维素、香菇多糖能够明显降低黄曲霉菌菌丝产毒能力.%The inhibitory effects of more than 10 polysaccharides on the growth and toxin production of Aspergillus flavus were studied.It was found that Laminaria polysaccharide, Lentinus edodes cellulose, potato amylose and A - type soybean polysaccharide could significantly reduce the mycelium yield of Aspergillus flavus, while Laminaria polysaccharide, Lentinus edodes cellulose, potato amylase, Lentinus edodes polysaccharide and mungbean polysaccharide could inhibit the aflatoxin production, of which Laminaria polysaccharide, Lentinus edodes cellulose, potato amylase and Lentinus edodes polysaccharide could obviously reduce the aflatoxin - producing capability of Aspergillus flavus. 【期刊名称】《江西农业学报》
生物化粪池【年(卷),期】2011(023)005
【总页数】3页(P82-84)
【作 者】李红波;胡梁斌;王淼焱;孙俊良
【作者单位】河南科技学院食品学院,河南新乡453003;河南科技学院食品学院,河南新乡453003;河南科技学院食品学院,河南新乡453003;河南科技学院食品学院,河南新乡453003
二阶低通滤波电路【正文语种】中 文
焦磷酸盐【中图分类】S482.7
黄曲霉菌(Aspergillus flavus)产生的黄曲霉毒素(aflatoxin)是目前发现的毒性和致癌性最强的化学物质之一，被世界卫生组织认定为1A级危险物(WHO，1993)[1]。黄曲霉毒素污染
控制仍是世界性难题。随着遗传学、分子生物学的迅速发展，人们开始通过遗传工程，从源头上培育抗性材料。但对黄曲霉有免疫或高抗的花生、玉米等作物的遗传资源比较缺乏。生物控制黄曲霉毒素污染是最近研究的热点。尽管目前尚未有一种控制黄曲霉的植物源杀菌剂问世，但有很多植物源活性物质在实验室表现出对黄曲霉的强烈抑制作用。Nogueira等[2]发现从菊科植物藿香蓟提取的精油能够有效抑制黄曲霉毒素产生;Vargas-Arispuro等[3]测定了植物Larrea tridentata提取物对黄曲霉和寄生曲霉的抑制作用，发现主要活性物质属于木质素类。然而，这些植物源提取物的规模生产比较困难，而且其有效成分的作用机理和安全性还有待于进一步研究。利用微生物对黄曲霉的拮抗或竞争来控制黄曲霉毒素污染也颇受关注。无毒菌株成为优势种在田间防治黄曲霉毒素的方法已经在美国获得认证[4]，一些菌株在田间使用2次使毒素减少90%以上。然而，活体的无毒菌株对环境的影响还有待于进一步评估。我国学者对黄曲霉毒素污染控制也颇有研究。朱新贵等[5]研究发现食品上常见的枯草芽孢杆菌、乳酸菌和醋酸菌降解毒素能力最强，在液体培养60 h后，黄曲霉毒素分别可被去除89%、88%和81%。畅晓渊等[6]从奶酪中分离出一种扩展短杆菌(Brevibacterium linens)，能够产生抑制黄曲霉的物质。但是尚没有将拮抗菌应用于食品行业控制黄曲霉毒素污染的报道，这可能由于对活体菌的应用风险日益受到重视。
鉴于上述原因，生防菌产生的活性物质更加受到关注。Moyne等发现枯草芽孢杆菌分泌的抗菌肽bacillomycin D能抑制黄曲霉菌丝的生长[7]。但是这些两性抗菌肽的纯化困难，作用机制和毒理仍然需要进一步研究。
制动总泵2005 年，Reverberi等[8]报道香菇(Lentinus edodes)中的多糖提取物能够抑制寄生曲霉(A.parasiticus)产生黄曲霉毒素。研究表明很可能是多糖提取物中的β-葡聚糖激活了与氧化胁迫反应相关的转录因子hsf-2，并且延迟了黄曲霉毒素产生相关基因afIR和norA的转录。文中数据显示多糖造成的抗氧化酶反应迟于对毒素合成的抑制效应，因此抗氧化酶反应很可能是多糖对黄曲霉作用的并列行为，不是毒素抑制的根本原因。2006年，Zjalic等[9]发现白腐菌(Trametes versicoior)产生的β-葡聚糖也能够抑制黄曲霉毒素的合成，再次展现了β-葡聚糖在黄曲霉毒素控制中的应用前景。本文研究了香菇多糖等10余种不同结构的多糖对黄曲霉菌生长及产毒的影响作用，初步分析归纳了多糖与抑制黄曲霉毒素相关的分子特性，为黄曲霉毒素代谢网络、黄曲霉毒素污染控制提供了新思路。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试菌株 黄曲霉菌CGMCC3.2890购于中国普通微生物菌种保藏管理中心，PDA培养基4℃保存。黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)由江苏省农业科学院赠送。手机滑轨
1.1.2 培养基 PDA培养基，沙氏液体培养基(蛋白胨1 g、葡萄糖4 g、蒸馏水100 mL，自然pH值，高压121℃灭菌20 min)。
1.1.3 试剂 乙腈、甲醇为谱纯。蛋白胨、葡萄糖、95%乙醇、无水乙醇、丙酮等为分析纯。香菇多糖购于中国科学院;海带多糖购于美国sigma公司;石耳素购于日本Wako公司;燕麦β-葡聚糖购于珠海晋平科技有限公司;A型大豆多糖、B型大豆多糖购于河南省新乡市世界之窗工贸有限公司;马铃薯直链淀粉、玉米支链淀粉购于农业部谷物及制品质检中心;果胶购于郑州百和化工产品有限公司;壳聚糖购于济南海得贝海洋生物工程有限公司。
1.1.4 仪器 Waters2695高效液相谱仪;GJ-18冷冻干燥机(北京四环科学仪器);回转式恒温调速摇床(上海通特电讯设备厂);MTN-2800W氮吹仪(天津奥特塞恩斯仪器有限公司);Heidolph VV2000旋转蒸发仪。
1.2 试验方法
1.2.1 试验设计 香菇多糖、海带多糖、石耳素、燕麦β-葡聚糖、A型大豆多糖、B型大豆多糖、马铃薯直链淀粉、玉米支链淀粉、果胶、壳聚糖、绿豆多糖(自提)、花生壳纤维素(自提)、香菇纤维素(自提)分别添加到20 mL沙氏液体培养基中(含多糖1 mg/mL)，高压121℃灭菌20 min。冷却后接种黄曲霉孢子悬浮液，孢子终浓度为1×105CFU/mL。30℃，120 r/min培养48 h，检测菌丝产量和 AFB1产量[8]。
1.2.2 孢子悬浮液制备 取保存的黄曲霉菌接种于PDA平板上，30℃下培养5 d，待黄曲霉长满平板后，将无菌Tritonx-100(0.1%)5 mL倒入平板，轻微摇动使黄曲霉孢子均匀散入溶液中，用移液将孢子悬浮液吸入1.5 mL离心管中，用血球计数板在显微镜下计数，稀释成1×106CFU/mL待用，黄曲霉孢子要现配现用[10]。
1.2.3 纤维素提取 取一定量的花生壳，粉碎，粉末水洗3～4次后挤干水分，按10～13 mL/g加入稀硫酸溶液，料液pH 值为1.5，于(85 ±5)℃下浸提1.5 ～2.0 h，趁热过滤，热水洗涤滤渣。滤渣水洗至中性，用5%的H2O2漂白，干燥、打粉、过筛获得花生壳水不溶性纤维素。香菇水不溶性纤维素同样方法获得[11]。
1.2.4 绿豆多糖提取 绿豆皮处理后加入蒸馏水→50℃水浴溶胀1 h→80℃水浴浸提3 h→离
心(3000 r/min，15 min)→上清液旋转蒸发浓缩→浓缩液3倍95%乙醇沉淀→真空抽滤→有机溶剂洗涤(95%乙醇、无水乙醇、丙酮先后洗涤)→滤渣40℃干燥→制得水溶性粗多糖。
1.2.5 黄曲霉菌丝产量测定 将培养液用Whatman No14滤纸过滤，将菌丝放入平皿中，90℃烘烤24 h，然后将菌丝放入干燥器中至恒重，测定菌丝产量[12]。
1.2.6 AFB1提取及含量测定[7] 吸取一定量黄曲霉培养滤液，加3倍氯仿萃取，萃取液于60℃用氮吹仪吹干，溶解在甲醇中，过0.22 μm微孔滤膜，然后用HPLC测定。谱柱:COSMOSIL 5C18-MS-II Packed Column(4.6 mm I.D.×250 mm)(上海泉岛公司);柱温:22 ℃;进样量:10 μL;检测波长:365 nm;流动相:乙腈、甲醇、水的体积比为1∶1∶2;流速:1 mL/min。
探针天线
1.2.7 数据分析 试验重复3次，菌丝和AFB1产量的平均值用SPSS软件中SNK法进行统计分析。
2 结果与分析
恒温摇床中30℃、120 r/min培养48 h后黄曲霉菌菌丝产量及毒素含量见表1。
由表1可见，与只接种黄曲霉孢子的CK组相比，添加海带多糖、香菇纤维素、马铃薯直链淀粉的3组菌丝产量显著减少，添加石耳素、壳聚糖、A型大豆多糖的3组菌丝产量显著增高(P＜0.05)，表明海带多糖、马铃薯直链淀粉、香菇纤维素能够明显抑制黄曲霉菌丝生长，而石耳素、壳聚糖、A型大豆多糖则能够促进菌丝生长。经海带多糖、香菇纤维素、马铃薯直链淀粉、香菇多糖、绿豆多糖等处理的5组AFB1产量显著减少(P＜0.05)，其余处理组毒素含量无显著差别;同时含海带多糖、马铃薯直链淀粉、香菇纤维素、香菇多糖等4组单位质量菌丝AFB1含量极低，果胶组则较高，差异显著(P＜0.05)。表明海带多糖、马铃薯直链淀粉、香菇纤维素、香菇多糖、绿豆多糖虽然都能使AFB1含量减少，但只有海带多糖、马铃薯直链淀粉、香菇纤维素、香菇多糖能够明显抑制黄曲霉菌菌丝产毒能力。此外，果胶则促进了黄曲霉菌菌丝产毒能力。
海带多糖又称昆布多糖、褐藻淀粉，是一种广泛存在于褐藻中的杂多糖，在昆布属、海带属等植物中含量较丰富。大量试验研究表明，昆布多糖具有抗肿瘤、促免疫、抗凝血等多种活性[13]。试验中所用海带多糖平均分子量约为7.7 kDa，糖链结构是以β-1，3-葡聚糖为主链，含有极少量β-1，6-葡萄糖苷键分支。马铃薯直链淀粉，是由葡萄糖以α-1，4-糖苷键结合而成的链状化合物。香菇多糖是香菇中分离出的一种重要的具有生理活性的物质，
具有抗病毒、抗肿瘤、增强人体免疫力等多种功能[14]，主要结构为β-1，3-葡聚糖，含有少量的 β-1，6-吡喃葡萄糖苷键分枝。香菇水不溶性纤维素为本实验室提取，推测主要为β-1，4-葡聚糖。果胶是植物中的一种酸性多糖，是细胞壁中一个重要组分，最常见的结构是α-1，4连接的多聚半乳糖醛酸。
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