第二部分 谱分析
一 薄层谱法概述
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薄层谱法是一种基于混合物组分在固定相和流动相之间的不均匀分配或保留而将其分离的方法。与HPLC不同，TLC将固定相涂铺在栽板上，使之形成均匀的薄层。被分离的样品溶液点加在薄层板下沿的位置，再把下沿向下放入盛有流动相（深度约5mm）的密闭缸中，进行谱展开，实现混合组分分离。被展开的组分斑点即谱谱带，通过适当技术对谱谱带进行处理可得到定性和定量的检测结果。薄层谱法具有技术比较简单，操作容易，分析速度快，高分辨能力，结果直观，不需昂贵仪器设备就可以分离较复杂混合物等特点。
二 薄层谱法中的薄层板、薄层板的涂铺、点样和展开
（一）薄层板
气体处理
TLC分离的选择性主要取决于固定相的化学组成及其表面的化学性质。可通过改变涂层材料的化学组成或对材料表面进行化学改性来实现改变薄层谱分离的选择性。此外，固定相的物理性质，如比表面积、比空容、平均孔径等也对其谱行为产生影响。
（1）载体 对TLC载体的基本要求为：机械强度好、化学惰性好（对溶剂、显剂等）、耐一定温度、表面平整、厚度均匀、价格适宜。
（2）固定相 TLC固定相包括改性固定相和未改性固定相两类。硅胶和氧化铝是最常用的两种未改性固定相。
（3）粘合剂 在制备薄层板时，一般需在吸附剂中加入适量粘合剂，其目的是使吸附剂颗粒之间相互粘附并使吸附剂薄层紧密的附着在载板上。常用的粘合剂可分为无机粘合剂和有机粘合剂两类。
（4）荧光指示剂 荧光指示剂是便于在薄层谱图上对一些基本化合物斑点（无颜斑点、无特征紫外吸收斑点）定位的试剂。加入荧光指示剂后，可以使这些化合物斑点在激发光波照射下显出清晰的荧光，便于检测。
（二）薄层板的涂铺
涂板方法可以分为涂布法、倾注法、喷洒法及浸渍法四类，其中涂布法是应用最广泛的涂板方法。
TLC固定相薄层涂铺大多采用湿法匀浆，要求薄层均匀、平整、无气泡、不易造成凹坑和龟裂。
薄层板活化处理可以获得适宜活性，提高谱分离效率和选择性。
（三）点样
点样是TLC分离和精确定量的关键。不同种类的样品常需选用不同的配样溶剂，一般采用易挥发的非极性或弱极性溶剂配样。离子型化合物样品，常需先衍生化成在挥发性强、极性小的溶剂中易溶解的样品衍生物。最适合点样的样品浓度应为（1～5）μg·μL-1，点样体积视点样技术不同而异。TLC定量分析时，样品量的适宜范围为最小检出量的几倍至几十倍。样品原点一般在1mm左右为佳，原点过大或样品量过大，会导致分离变坏。点样步骤一般占TLC全部分析时间的三分之一左右，所以使点样仪器化、自动化，既快又准，获
得好的重复性，是TLC工作者所期盼的。
（四）展开
TLC展开就是流动相沿薄层（固定相）运动，以实现样品混合组分分离的过程。这一过程需在具有一定形状的展开室中进行。薄层展开有三种形式，直线式展开方式为实际应用中使用最普遍的展开方式。
三 薄层谱流动相与展开机制
（一）对流动相溶剂选择的基本考虑
薄层谱溶剂的选择对分离的影响很大。与HPLC同理，对复杂样品的分离能否得到理想的结果，流动相的选择是最重要的因素之一，不同溶质与流动相分子、固定相分子间的作用力不同，因此其移动速度也不同，最终导致样品中各组分的分离。对流动相的选择不仅需考虑极性、选择性等因素，更基本的应注意以下因素的影响：
(1)溶剂纯度，含有杂质影响分离。
(2)溶剂吸收环境水分，会使极性等性质改变。
(3)存放条件不适宜或贮存时间过长，溶剂会变性。
(4)混合流动相之间发生作用会使溶剂性质改变。溶剂极易挥发，流动相组成随时改变。
（二）几种常用薄层谱分离模式的展开机制
1.液固吸附展开
在TLC分离中，液固展开是一种最经典的展开方式。液固展开常用极性吸附硅胶、氧化铝作固定相。流动相依其极性可在吸附剂表面形成单分子或双分子溶剂吸附层，展开过程中，组分的保留及分离选择性主要有以下三种因素决定：
a.溶剂对样品的溶解能力；
b.溶质和流动相分子对固定相表面活性吸附位点的竞争；
c.溶质分子与吸附剂表面上吸附中心间的特殊作用力。
2.液液分配展开
与液液分配柱谱分配机理相同，组分在互不相溶的两液相中的溶解度不同，因此迁移速率存在差异，在迁移过程中得到分离。
除以上两种展开机制外，还有化学键合相展开和离子交换展开。
四 薄层谱吸附剂与载体的选择
1.薄层谱对吸附剂的要求为：
1.具有大的表面积与足够的吸附能力；
2.对不同的组分有不同的吸附性，因而能较好的分离不同的化学组分；
3.在所用的溶剂和展开剂中不溶解；
4.不与试样中各组分、溶剂和展开剂起化学反应或破坏、分解作用
5.颗粒均匀、在使用过程中不会碎裂
6.具有可逆的吸附性，既能吸附样品组分，又易于解吸；
7.为便于观察分离结果，最好是白固体。
2.分配谱对所用载体的要求为：
a.表面积大；
b.在展开剂中不溶解，与展开剂和样品组成不起化学反应或分解作用；
c.对样品组分无吸附性或吸附性极弱；
d.对固体液是惰性的。
五 薄层谱扫描仪
（一）仪器结构
TLC扫描仪结构主要包括光学元件组合系统、电子元件组合系统及机械元件组合系统。
（二）主要功能
薄层谱扫描仪主要用于TLC图被分离斑点和薄层空白的光学相应信号测
量。要求仪器光源稳定，光波单性能好，光波长在（200～800nm）检测器灵敏度高。
六 薄层谱定性定量方法
（一）斑点定位
斑点定位必须采用非破坏性方法。当斑点紫外光显示时，可采用长波长和短波长紫外灯，使用方便、灵活。采用化学试剂显时，通过手动或电动喷雾器向展开好的薄层板喷洒显试剂。
（二）定性方法
1.利用保留值定性
在特定的谱系统中，化合物的Rf稀土氧化物值一定，比较未知物和标准物的Rf值，能够作为鉴定未知物的依据。Rf值的准确测定受多方面因素影响，为了增加Rf值定性的可靠性，必须通过改变谱系统的选择性，重复测定同一化合物的Rf值。如果在分离机理不同的谱体系中，
比较Rf值仍能得到肯定的结果，那么其可靠性将更大。
2.板上化学反应定性
板上化学反应定性主要有以下两种方式：
a.反应后生成特征颜的化合物，借以鉴定反应物；发热器
b.反应后生成复杂的、无法鉴定组分的混和物，但可根据生成物的“指纹”
特征加以鉴定；
c.除以上两种定性反方法外，还有板上光谱定性、TLC与其他联用技术间
接联用定性、薄层谱－傅里叶变换红外光谱联用定性以及薄层谱－质谱联用定性。
（三） 定量方法
1.间接定量法
链轮设计
间接定量法就是将TLC已分离的物质斑点洗脱下来，再采用其他方法对该洗脱液进行定量分析。TLC间接定量的关键是斑点组分的定量洗脱。选用怎样的洗脱方法，取决于，组分和薄层吸附剂的性质。用来洗脱组分斑点的溶剂，对下一步定量方法应无影响。
a.分光光度法 将下来的洗脱液配制成标准体积，再同样条件下对样品和
标准液进行吸光值测量。
b.HPLC法 以TLC法斑点洗脱液直接作HPLC分离和定量
c.GC法 以TLC法斑点洗脱液直接作GC分离和定量。
d.质谱法 采用组分质谱图中的特征离子峰可进行定量。
2.直接定量法
a.斑点面积测量法 以半透明纸扫下TLC图上的斑点界限，然后测量其面
积。将斑点面积同平行操作的标准样面积相比较进行定量。
b.目测法 将被测样品和系列溶液点在同一薄层板上，展开后用适当方法
显，可以得到系列斑点，将被测样品的斑点面积大小和颜与标准系列的斑点相比较，可推测出样品的含量范围。这种定量法非常适用于对常规大量样品的重复分析。
七 应用实例—TLC测定黄曲霉毒素B1
（一）、原理
镀铬添加剂根据黄曲霉毒素B1能在波长365毫微米紫外光下产生蓝紫荧光的特性，采取薄层层析法，将样品经提取、浓缩、薄层分离后，利用其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定其含量。
（二）、试剂
1.石油醚：沸程 30－60℃
2.正已烷
3.氯仿
4.苯
5.乙腈
6.甲醇
7.无水乙醚：如不是无水乙醚，则应脱水后再用。
8.丙酮
9.无水硫酸钠
10.硅胶G：薄层层析用
11.苯乙腈混合液：取苯98毫升，乙腈2毫升，混匀冰箱存放备用。
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