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一种富含NAD的酵母浸出物及其制备方法和应用与流程

24h。
15.优选地，液体发酵培养基包含，按100毫升培养基中的质量含量克数计，碳源3-10％、酵母浸出物0.5-1％、硫酸铵2-5％、硫酸镁1-2％、磷酸二氢钾0.5-1％、硫酸锌0.1-0.5％；
16.优选地，碳源是甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜或者水解糖中的一种或两种以上的组合。
17.优选地，所述酵母乳中，溶剂为水，以干物质含量计，酵母细胞的质量百分比为10-15％。
18.优选地，所述酵母为酿酒酵母或假丝酵母中的一种或两种以上的组合；
19.优选地，所述酵母为保藏编号为cctcc no:m2016418的酿酒酵母fx-2(saccharomyces cerevisiae fx-2)和/或保藏编号为cctcc no:m2017782的假丝酵母c1.7(wickerhamomyces anomalus c1.7)。
20.优选地，所述细胞自溶包括，灭活酵母菌和酶解过程；
21.优选地，在加热条件下灭活酵母；优选地，在85-95℃条件下，保温10-30分钟灭活酵母；
22.优选地，酶解反应温度为40-60℃，酶解反应ph为5.0-6.0，酶解反应时间为15-24h；
23.优选地，酶解反应的酶制剂为蛋白酶；优选地，按照酵母乳干重添加酶制剂0.1-1％。
24.优选地，细胞自溶后还包含灭酶过程；
25.优选地，在65-75℃条件下灭酶。
26.优选地，所述纯化过程包括固液分离，取液体进行浓缩；
27.优选地，通过减压蒸发或喷雾干燥进行浓缩。
28.本发明还提供所述的酵母浸出物或所述的制备方法得到的酵母浸出物在微生物培养基中的应用。
29.本发明提供的酵母浸出物富含nad，同时具有较高含量的含氮物质以及氨基酸，具有较强的促微生物生长能力。
具体实施方式
30.本发明提供一种富含nad的酵母浸出物及其制备方法和应用。
31.酵母浸出物是一种营养非常全面的有机氮源，为微生物的生长提供氮源的同时还能提供微量元素，维生素等生长因子。现有技术中的酵母浸出物中nad的含量较低。
32.本发明提供的酵母浸出物中含有nad的质量百分比为0.98-2.2％，总氮的质量百分比为10-13％和氨基酸态氮的质量百分比为2.5-6％。
33.在本发明的一种优选实施方式中，所述酵母浸出物中含有nad的质量百分比为0.98-2.2％，优选为1.2-2.2％，优选为1.6-2.2％，更优选为2.0-2.2％，特别优选为2.1-2.2％；总氮的质量百分比为10-13％，优选为11-13％，和氨基酸态氮的质量百分比为2.5-6％。
34.本发明提供的富含nad的酵母浸出物的制备方法，包含通过前期发酵提高酵母内源nad的含量，后期在酵母自溶过程中使nad溶出，同时防止nad降解，得到富含nad的酵母浸
出物。
35.本发明提供的富含nad的酵母浸出物的方法。包含在酵母发酵过程中添加喹啉酸、烟酸、烟酰胺或者烟酰胺核糖中的一种或组合，得到富含nad的酵母，酵母经过洗涤收集得到富含nad的酵母乳，酵母乳通过温度、ph等条件的控制，促进酵母自溶，同时添加外源酶辅助酵母酶解得到富含nad的酵母浸出物。
36.本发明提供的富含nad的酵母浸出物的制备方法，在发酵过程中无需添加生物素，而采取添加喹啉酸、烟酸、烟酰胺和烟酰胺核糖中的一种或组合，降低生产成本，提高酵母中nad的含量。
37.本发明提供的一种具体实施方式中，所述富含nad的酵母浸出物的制备方法包含如下步骤：
38.1)酵母乳获得：发酵条件ph4.0-6.0，培养温度30-34℃，培养时间为12-24h。发酵培养基配方如下：碳源3-10％、酵母浸出物0.5-1％、硫酸铵2-5％、硫酸镁1-2％、磷酸二氢钾0.5-1％、硫酸锌0.1-0.5％(以上均为质量体积比w/v)。其中碳源是甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜或者水解糖中的一种或多种进行组合。另外根据发酵液体积，每1l发酵液称取6-15g喹啉酸、烟酸、烟酰胺、烟酰胺核苷中的一种或者组合，配制成100ml溶液灭菌，从发酵开始到发酵结束，匀速流加到发酵液中。发酵结束后，将发酵液在5000-7000rpm条件下离心，弃上清，向重相中加入纯水后再次离心分离得到洗涤的酵母，再用纯水将酵母稀释成干物质含量为10-15％的酵母乳。
39.2)酵母自溶过程：将上述酵母乳加热至85-95℃，保温10-30分钟灭活酵母菌，使胞内nad不被酵母自身消耗，降温至40-60℃，调节ph5.0-6.0，按照酵母乳干重添加酶制剂0.1-1％，自溶15-24h，所述的酶制剂为蛋白酶。
40.3)分离纯化：上述酵母自溶后得到自溶液，经过65-75℃灭酶处理，离心机5000-7000rpm，离心5-10min收集上清液，上清液通过减压蒸发，得到富含碱基和碱基衍生物的酵母抽提物膏体(水分含量30-35％)，或者经过喷雾干燥得到粉体(水分《5％)。
41.在本发明的一种具体实施方式中，酵母自溶过程所用的酶制剂为蛋白酶，具体的，可采用商购的pa系列蛋白酶(安琪酵母股份有限公司出售)具体如fa-2。
42.本发明实施例中所用的试剂及仪器来源信息如下表1所示。
43.表1
[0044][0045]
本发明所采用酿酒酵母fx-2(saccharomyces cerevisiae fx-2)于2016年8月1日保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc no:m2016418。该菌株在公开号为cn108220175a的专利公开文本中已有记载。
[0046]
本发明所采用假丝酵母c1.7(wickerhamomyces anomalus c1.7)于2017年12月11日保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc no:m2017782。该菌株在公开号为cn110959853a的专利公开文本中已有记载。
[0047]
本发明实施例中的理化指标检测方法如下所示：
[0048]
(1)水分的测定
[0049]
采用国家标准gb/t 23530-2009中6.2的方法，取一定质量的样品，在103℃下烘干4小时至恒重，称重计算水分的含量。
[0050]
(2)总氮的测定
[0051]
采用国家标准gb/t 23530-2009中6.4的凯式定氮法：取样品(相当于
[0052]
总氮30-440mg)，在混合催化剂a(硫酸钾与污水硫酸铜按97:3比例混合)5g和催化剂b(硒粉与硫酸钾按0.1:100比例混合)2.5g作用下，加入20ml浓硫酸进行消煮；再进行蒸馏，用硼酸吸收产物氨；再用0.1mol/l的盐酸滴定，读取数据，计算总氮含量。
[0053]
(3)氨基酸态氮的测定
[0054]
采用国家标准gb/t 23530-2009中6.5所述的氨基酸态氮的检测方法：
[0055]
取5g样品，稀释后用0.5mol/l的氢氧化钠溶液滴定至ph为8.2，并保持1min。缓慢加入36％的甲醛溶液10ml，与中性氨基酸中的非解离型氨基反应，生成单羟甲基和二羟甲基诱导体，此反应完全定量进行。此时放出的氢离子用上述氢氧化钠滴定，根据碱液的消耗
量，计算出氨基酸态氮的含量。
[0056]
(4)ph的测定
[0057]
采用国家标准gb/t 35536-2017中7.2.1所述的ph的检测方法：配置一定重量百分比浓度水溶液，采用玻璃电极测定灭菌后的ph值。同一样品两次测定值之差应不应超过0.04。
[0058]
(5)nad的检测
[0059]
采用高效液相谱法进行nad的含量测定。
[0060]
高效液相谱仪：采用agilent zorbax sb-aq谱柱(5um，4.6mm*150mm)，流动相0.025mmol/l三乙胺-磷酸缓冲液(ph6.0)与乙腈梯度洗脱，流速1ml/min，检测波长254mm。
[0061]
将nad标品配制成0.05％、0.1％、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％和1.0％标准浓度，在高效液相谱仪中进样，并绘制成标准曲线。待测样品用水溶解后，过0.22um滤膜，进行高效液相谱分析，根据标准曲线计算各个样品中nad的含量。
[0062]
实施例1
[0063]
1.酵母培养基配制：甘蔗糖蜜3％，酵母浸出物0.8％，硫酸铵2％，硫酸镁1％，磷酸二氢钾0.5％，硫酸锌0.1％，调节ph4.5。
[0064]
2.酵母培养：将酿酒酵母fx-2按接种量为1％(w/v)加入到2l上述培养基中，培养温度30℃，通气量5l/min，搅拌速度300rpm/min，称取6g喹啉酸溶解至100ml水中，从发酵开始匀速流加至发酵结束，培养12h。
[0065]
3.离心机5000rpm，离心5min，收集重相，向重相中加入纯水，搅拌均匀后5000rpm离心5min，重新收集重相，加入纯水至酵母细胞干重10％(w/v)。
[0066]
4.将上述酵母乳加热至85℃，保温30min，降温至40℃，调节ph5.0，按照酵母乳干重添加蛋白酶0.1％，自溶酶解24h。
[0067]
5.将自溶液升温至65℃，维持30min。离心机5000rpm，离心5min。收集上清液，减压蒸发浓缩，喷雾干燥得到粉状成品，水分含量3.5％。
[0068]
实施例2
[0069]
1.酵母培养基配制：甘蔗糖蜜5％，酵母浸出物0.5％，硫酸铵4％，硫酸镁1.5％，磷酸二氢钾0.5％，硫酸锌0.3％，调节ph5.0。
[0070]
2.酵母培养：将酿酒酵母fx-2按接种量为1％(w/v)加入到2l上述培养基中，培养温度30℃，通气量5l/min，搅拌速度300rpm/min，称取8g烟酰胺溶解至100ml水中，从发酵开始匀速流加至发酵结束，培养18h。
[0071]
3.离心机6000rpm，离心5min，收集重相，向重相中加入纯水，搅拌均匀后5000rpm离心5min，重新收集重相，加入纯水至酵母细胞干重12％(w/v)。
[0072]
4.将上述酵母乳加热至90℃，保温20min，降温至50，调节ph5.5，按照酵母乳干重添加蛋白酶0.5％，自溶酶解20h。
[0073]
5.将自溶液升温至65℃，维持30min。离心机5000rpm，离心5min。收集上清液，减压蒸发浓缩，喷雾干燥得到粉状成品，水分含量3.7％。
[0074]
实施例3
[0075]
1.酵母培养基配制：甘蔗糖蜜10％，酵母浸出物1％，硫酸铵5％，硫酸镁2％，磷酸二氢钾0.5％，硫酸锌1％，调节ph6.0。
[0076]
2.酵母培养：将假丝酵母c1.7按接种量为1％(w/v)加入到2l上述培养基中，培养温度34℃，通气量5l/min，搅拌速度300rpm/min，称取4g烟酸、4g烟酰胺核苷溶解至100ml水中，从发酵开始匀速流加至发酵结束，培养24h。
[0077]
3.离心机6000rpm，离心5min，收集重相，向重相中加入纯水，搅拌均匀后6000rpm离心5min，重新收集重相，加入纯水至酵母细胞干重15％(w/v)。
[0078]
4.将上述酵母乳加热至95℃，保温10min，降温至60℃，调节ph6.0，按照酵母乳干重添加蛋白酶1％，自溶酶解15h。
[0079]
5.将自溶液升温至70℃，维持30min。离心机5000rpm，离心5min。收集上清液，减压蒸发浓缩，喷雾干燥得到粉状成品，水分含量3.0％。
[0080]
实施例4
[0081]
1.酵母培养基配制：甘蔗糖蜜8％，酵母浸出物0.6％，硫酸铵4％，硫酸镁1.5％，磷酸二氢钾0.5％，硫酸锌0.3％，调节ph5.5。
[0082]
2.酵母培养：将假丝酵母c1.7按接种量为1％(w/v)加入到2l上述培养基中，培养温度34℃，通气量5l/min，搅拌速度300rpm/min，称取7g喹啉酸、8g烟酰胺溶解至100ml水中，从发酵开始匀速流加至发酵结束，培养20h。
[0083]
3.离心机6000rpm，离心5min，收集重相，向重相中加入纯水，搅拌均匀后6000rpm离心5min，重新收集重相，加入纯水至酵母细胞干重15％(w/v)。
[0084]
4.将上述酵母乳加热至95℃，保温10min，降温至58℃，调节ph5.5，按照酵母乳干重添加蛋白酶0.8％，自溶酶解19h。
[0085]
5.将自溶液升温至70℃，维持30min。离心机5000rpm，离心5min。收集上清液，减压蒸发浓缩，喷雾干燥得到粉状成品，水分含量2.8％。
[0086]
对比例1
[0087]
1.酵母培养基配制：甘蔗糖蜜6％，酵母浸出物0.8％，硫酸铵3.5％，硫酸镁1％，磷酸二氢钾0.3％，硫酸锌0.6％，调节ph5.5。
[0088]
2.酵母培养：将酿酒酵母fx-2按接种量为1％(w/v)加入到2l上述培养基中，培养温度30℃，通气量5l/min，搅拌速度300rpm/min，培养20h。
[0089]
3.离心机6000rpm，离心5min，收集重相，向重相中加入纯水，搅拌均匀后6000rpm离心5min，重新收集重相，加入纯水至酵母细胞干重13％(w/v)。
[0090]
4.将上述酵母乳加热至90℃，保温15min，降温至55℃，调节ph 5.5，添加蛋白酶0.5％，按自溶期间保持温度和ph不变，自溶20h。
[0091]
5.将自溶液升温至65℃，维持30min。离心机5000rpm，离心5min。收集上清液，减压蒸发浓缩，喷雾干燥得到粉状成品，水分含量4.0％。
[0092]
对比例2
[0093]
1.酵母培养基配制：甘蔗糖蜜5％，酵母浸出物0.5％，硫酸铵4％，硫酸镁1.5％，磷酸二氢钾0.5％，硫酸锌0.3％，调节ph5.0。
[0094]
2.酵母培养：将酿酒酵母fx-2按接种量为1％(w/v)加入到2l上述培养基中，培养温度30℃，通气量5l/min，搅拌速度300rpm/min，称取8g烟酰胺溶解至100ml水中，从发酵开始匀速流加至发酵结束，培养18h。
[0095]
3.离心机6000rpm，离心5min，收集重相，向重相中加入纯水，搅拌均匀后6000rpm
离心5min，重新收集重相，加入纯水至酵母细胞干重13％(w/v)。
[0096]
4.将上述酵母乳加热至55摄氏度，调节ph 5.5，添加蛋白酶0.5％，按自溶期间保持温度和ph不变，自溶20h。
[0097]
5.将自溶液升温至65℃，维持30min。离心机5000rpm，离心5min。收集上清液，减压蒸发浓缩，喷雾干燥得到粉状成品，水分含量3.1％。
[0098]
表2中所示为实施例1-4和对比例1-2制备得到的酵母浸出物中总氮、氨基酸态氮和nad含量检测结果。
[0099]
表2
[0100][0101]
如表2所示，本发明提供的酵母浸出物中，nad含量达到9800mg/kg以上，尤其是实施例4中制备得到的酵母浸出物中nad含量达到21900mg/kg。
[0102]
实验例1
[0103]
将实施例1-4和对比例1-2得到的酵母浸出物进行微生物灵敏度测试(促生长能力)：
[0104]
检测方法参照gb/t 35536-2017中7.4.3的方法，检测上述酵母浸出物对枯草芽孢杆菌cmcc(b)63501、乙型副伤寒沙门菌cmcc(b)50094和白念珠菌cmcc(f)98001的促生长性能。
[0105]
1.将上述实施例1-4、对比例1-2分别配制成2％(w/v)溶液，调节ph7.0
±
0.5，分装到试管中。同时配制胰酪大豆胨液体培养基，灭菌后分装到试管中作为对照，每管3个平行。
[0106]
2.将枯草芽孢杆菌、乙型副伤寒沙门菌、白念珠菌菌液稀释至102cfu/ml、101cfu/ml、1cfu/ml。稀释好的菌液，每个稀释度接种1ml到第1步中的试管中，33℃
±
2℃培养36h，观察记录待测培养管和对照培养管阳性管数。
[0107]
3.计算
[0108]
式中：
[0109]
r——促生长能力；
[0110]
t——待测培养管阳性生长管数；
[0111]
s——对照培养管阳性生长管数。
[0112]
实验结果如表3所示。
[0113]
表3
[0114]
样品促生长能力实施例177.78％实施例288.89％实施例3100％实施例4100％对比例166.67％对比例255.56％
[0115]
从表3可以看出，本发明提供的富含nad的酵母浸出物具有优越的促进微生物生长性能，尤其实施例3和实施例4中提供的富含nad酵母浸出物，促微生物生长能力达到100％。
[0116]
实验例2
[0117]
1.将实施例1-4，对比例1-2中制备的酵母浸出物，配制成2％(w/v)，并添加2％(w/v)葡萄糖，0.5％碳酸钙(w/v)，灭菌备用。
[0118]
2.将凝结芽孢杆菌cgmcc1.6576，按照培养液体积1％接种量接种至上述培养基中，50℃培养24h，培养结束后测定培养液中的乳酸含量，并计算乳酸得率s。
[0119][0120]
式中：
[0121]
s——乳酸得率，
[0122]
l——发酵液发酵后乳酸含量(g/l)
[0123]
v——发酵液发酵后总体积(l)
[0124]
g——添加葡萄糖的总量(g)
[0125]
实验结果如表4所示。
[0126]
表4
[0127]
样品乳酸得率实施例193.71％实施例295.42％实施例395.66％实施例496.69％对比例187.14％对比例286.87％
[0128]
从表4可以看出，本发明提供的富含nad的酵母浸出物应用于培养凝结芽孢杆菌，能够增强凝结芽孢杆菌产乳酸性能，尤其利用本发明实施例3和4中得到的酵母浸出物培养凝结芽孢杆菌，乳酸得率达到95.66％和96.69％。
[0129]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.一种富含nad的酵母浸出物，其特征在于，以干物质含量计，所述酵母浸出物中含有nad的质量百分比为0.98-2.2％，总氮的质量百分比为10-13％和氨基酸态氮的质量百分比为2.5-6％。2.根据权利要求1所述的酵母浸出物，其特征在于，以干物质含量计，所述酵母浸出物中含有nad的质量百分比为1.2-2.2％，总氮的质量百分比为11-13％和氨基酸态氮的质量百分比为2.5-6％。3.权利要求1或2所述的酵母浸出物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包含，将酵母菌通过液体发酵得到酵母乳，细胞自溶后，纯化得到所述酵母浸出物，其中，在发酵过程中流加含有喹啉酸、烟酸、烟酰胺和烟酰胺核苷中的一种或者两种以上的组合的培养基。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述酵母菌为酿酒酵母或假丝酵母中的一种或两种以上的组合。5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，流加的培养基中喹啉酸、烟酸、烟酰胺和烟酰胺核苷中的一种或者两种以上的组合的质量体积比以g/ml培养基计为4-15％。6.根据权利要求3-5任意一项所述的制备方法，其特征在于，液体发酵培养基的ph为4.0-6.0，培养温度为30-34℃，培养时间为12-24h。7.根据权利要求3-6任意一项所述的制备方法，其特征在于，液体发酵培养基包含，按100毫升培养基中的质量含量克数计，碳源3-10％、酵母浸出物0.5-1％、硫酸铵2-5％、硫酸镁1-2％、磷酸二氢钾0.5-1％、硫酸锌0.1-0.5％；优选地，碳源是甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜或者水解糖中的一种或两种以上的组合。8.根据权利要求3-7任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述酵母乳中，溶剂为水，以干物质含量计，酵母细胞的质量百分比为10-15％。9.根据权利要求3-8任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述酵母为酿酒酵母或假丝酵母中的一种或两种以上的组合；优选地，所述酵母为保藏编号为cctcc no:m2016418的酿酒酵母fx-2(saccharomyces cerevisiae fx-2)和/或保藏编号为cctcc no:m2017782的假丝酵母c1.7(wickerhamomyces anomalus c1.7)。10.根据权利要求3-9任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述细胞自溶包括，灭活酵母菌和酶解过程；优选地，在加热条件下灭活酵母；优选地，在85-95℃条件下，保温10-30分钟灭活酵母；优选地，酶解反应温度为40-60℃，酶解反应ph为5.0-6.0，酶解反应时间为15-24h；优选地，酶解反应的酶制剂为蛋白酶；优选地，按照酵母乳干重添加酶制剂0.1-1％。11.根据权利要求3-10任意一项所述的制备方法，其特征在于，细胞自溶后还包含灭酶过程；优选地，在65-75℃条件下灭酶。12.根据权利要求3-10任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述纯化过程包括固液分离，取液体进行浓缩；优选地，通过减压蒸发或喷雾干燥进行浓缩。13.根据权利要求1或2所述的酵母浸出物或权利要求3-12任意一项所述的制备方法得
到的酵母浸出物在微生物培养基中的应用。

技术总结

本发明提供一种富含NAD的酵母浸出物及其制备方法和应用。本发明提供的富含NAD的酵母浸出物，以干物质含量计，含有NAD的质量百分比为0.98-2.2％，总氮的质量百分比为10-13％和氨基酸态氮的质量百分比为2.5-6％。本发明提供的酵母浸出物富含NAD，同时具有较高含量的含氮物质以及氨基酸，具有较强的促微生物生长能力。能力。