一种用于改善非酒精性脂肪肝的山银花多糖及其制备方法和应用

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于改善非酒精性脂肪肝的山银花多糖及其制备方法和应用。

背景技术：

2.非酒精性脂肪肝疾病(nonalcoholic fatty liver disease，nafld)包括肝脏的单纯性脂肪变性(无炎症脂肪沉积)、非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化等，疾病进展后期会引起肝硬化、肝脏衰竭甚至肝癌。研究表明，nafld已经影响到全球约四分之一的人口，其中在西方国家影响约30％的普通人。在过去十几年中，nafld的发病率在亚洲国家增长迅速，在我国，成人nafld患病率已经接近三分之一，甚至未成年人的nafld患病率也在逐年增加。nafld已经成为我国第一大慢性肝病。
3.越来越多的证据表明，脂质积累是nafld的一个关键启动事件。肝细胞中过量的脂肪酸会增加脂毒性物质的产生，进而触发氧化应激和促炎细胞因子的释放。炎症反应不仅激活肝星状细胞，肝纤维化的主要贡献者，也加剧了肝细胞的脂毒性应激。建立抗炎和抗纤维化疗法是肝纤维化，是非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，nash)的主要临床需要之一。近几年，由于中药良好的抗炎和抗纤维化的作用，导致中药及其有效成分在防治nafld方面被广泛报道，并显示出良好的应用前景。而且在众多用于防治nafld的中药成分中，中药多糖是被最为广泛报道的。现有研究表明，不同结构的多糖nafld的主要作用机制不同，效果差异巨大。由于不同来源、结构的多糖结构多样，生物活性、作用机制有可能不相同，所以寻nafld疗效显著、质量可控、机理清晰、食物来源的高质量、低成本低和高安全性的食源性多糖，对于多糖的开发利用以及预防脂肪肝具有重要的意义和价值。

技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种特定的山银花多糖及其在改善非酒精性脂肪肝功中的应用。
5.为此，本发明提供了一种用于改善非酒精性脂肪肝的山银花多糖，包括：所述山银花多糖包括阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、木糖、甘露糖、果糖、半乳糖、葡萄糖。
6.具体的，上述阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、木糖、甘露糖、果糖、半乳糖、葡萄糖的质量浓度比为(3-4):(9-10):(5-6):(1-2):(5-6):(0.5-1):(0.2-0.6):(35-36)。
7.本发明还提供了上述山银花多糖的制备方法，包括以下步骤：
8.(1)采用超声辅助提取法提取山银花粉末，滤液离心取上清液，浓缩后加入乙醇静置，离心取沉淀；
9.(2)沉淀加水溶解后加入萃取液萃取脱蛋白，得到脱蛋白后的多糖溶液，将其浓缩、冻干得到山银花粗多糖；
10.(3)向山银花粗多糖中加水充，分溶解后过滤，滤液采用纤维素柱层析，洗脱后收集含多糖的一次洗脱液；
11.(4)将一次洗脱液在凝胶过滤柱上进一步层析，洗脱后收集二次洗脱液；
12.(5)二次洗脱液浓缩、冻干后即得山银花多糖。
13.具体的，上述步骤(1)具体为：采用超声辅助提取法提取山银花粉末，滤液离心取上清液，浓缩后加入乙醇使含醇量为75％-85％，静置36-60h，离心取沉淀。
14.具体的，上述步骤(2)中萃取液为savage试剂；所述savage试剂中氯仿与正丁醇的体积比为4：1。
15.具体的，上述步骤(3)中纤维素柱为deae-52纤维素柱。
16.具体的，上述步骤(3)中层析后依次使用水、0.1mol/l nacl洗脱；流速为1ml/min，收集洗脱液为一次洗脱液。
17.具体的，上述步骤(4)中凝胶过滤柱为sephadex g-100凝胶过滤柱。
18.具体的，上述步骤(4)中层析后使用水洗脱，流速为0.5ml/min，收集含多糖的洗脱液为二次洗脱液。
19.本发明提供的这种山银花多糖可制作用于改善非酒精性脂肪肝的组合物。
20.与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
21.本发明提供的这种山银花多糖作用机理清晰，不仅可以减轻nafld的糖代谢异常和胰岛素抵抗，还可以通过减少脂质积累、抑制脂质合成相关的基因和蛋白的表达来缓解代谢应激诱导的nash的进展。此外，山银花多糖还可通过改善肠道菌结构，进而对肝脏脂肪变性具有良好的保护作用，对预防和改善非酒精性脂肪肝具有重要的意义和价值。通过本发明提供的方法制备的山银花多糖纯度高，有效成分结构特征清晰，质量可控，从而可保证功效，有利于解决以复杂组方防治nafld所带来的功效不稳定、质控目标不清楚等问题。
22.以下将结合附图对本发明做进一步详细说明。
附图说明
23.图1是本发明实施例1中lp在层析柱上分布示意图；其中，a为在deae-52纤维素柱上的lp分布，b为在sephadex g-100柱上的lp分布。
24.图2是本发明实施例1中gc分析结果图；其中，a为单糖标准品的gc，b为lp单糖组成的gc；1.阿拉伯糖；2.鼠李糖；3.核糖；4.木糖；5.甘露糖；6.果糖；7.半乳糖；8.葡萄糖；9.葡萄糖醛酸。
25.图3是本发明实施例2中山银花多糖预防hfsw诱导的肥胖和胰岛素抵抗的实验结果；其中，a为在小鼠中测试lps在hfsw诱导的nafld中的作用的程序示意图；b为每组小鼠的体重，n＝10/组；c为各组小鼠的白脂肪重量，n＝10/组；d为各组小鼠的空腹血糖、血胰岛素含量和homa-ir，每组n＝10；e为每组小鼠的gtt和itt结果，每组n＝10；f为每组小鼠肝脏的pas染图像，每组n＝8，刻度尺为100μm；g为小鼠肝脏中基因(g6pc和pck1)的mrna转录水平，每组n＝3；h为小鼠肝脏中胰岛素信号通路相关分子(irs1、akt和gsk3β)的蛋白表达水平，每组n＝3。
26.图4是本发明实施例2中山银花多糖保护hfsw诱导的肝脏脂肪变性的实验结果；其中，a为各组小鼠的肝脏重量和指数，每组n＝10；b为小鼠血清中alt和ast的量，n＝10/组；c
为小鼠血清中tgs、tc、ldl-c和hdl-c的含量，每组n＝10；d为小鼠肝组织中tgs、tc、ldl-c和hdl-c的含量，n＝10/组；e为h&e和油红o染图像、肝脏切片的nas评分(下降)和小鼠肝脏脂滴面积的定量分析结果，每组n＝6，刻度尺为100μm；f为gsea脂肪酸生物合成结果，每组n＝3只小鼠；g为脂质代谢相关分子表达变化的热图，每组n＝3只小鼠；h为小鼠肝脏中基因(cd36、fabp1、fasn、pparg、scd1和srebf1)的mrna转录水平，每组n＝3；i为小鼠肝脏中分子(srebp1c、acc、pparγ和fasn)的蛋白表达水平，每组n＝3。
27.图5是本发明实施例2中山银花多糖通过影响肠道菌来nafld的实验结果；其中，a为根据chao1和ace指数以及观察物种评估的α多样性，每组n＝6；b为基于bray-curtis距离的肠道微生物pca和pcoa图，每组n＝6；c为小鼠粪便中细菌门水平的相对丰度直方图；d为门水平上厚壁菌、拟杆菌、变形菌和放线菌的相对丰度，每组n＝6；e为属水平上鼠杆菌和脱硫弧菌的相对丰度，n＝6/组；f和g为鼠杆菌和脱硫弧菌与血脂(tc和tgs)、炎症指标(tnf-α和il-1β)和纤维化指数(tgf-β)水平的相关性分析。
具体实施方式
28.下面将结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。尽管已经详细描述了本发明的代表性实施例，但是本发明所属技术领域的普通技术人员将理解，在不脱离本发明范围的情况下可以对本发明进行各种修改和改变。因此，本发明的范围不应局限于实施方案，而应由所附权利要求及其等同物来限定。
29.下面通过具体实施例对本发明的用于改善非酒精性脂肪肝的山银花多糖及其制备方法和应用的效果进行研究。
30.实施例1：
31.本实施例提供了一种山银花多糖，通过以下步骤制备并对其组分进行了分析。
32.1、多糖提取和纯化
33.(1)采用超声辅助提取法提取山银花粉末，滤液离心取上清液，浓缩至适当体积后加入95％乙醇使醇含量为80％，静置48h，离心取沉淀。
34.(2)沉淀加水溶解后加入savage试剂(氯仿：正丁醇＝4：1)萃取脱蛋白，重复萃取造作，直至物变形蛋白产生为止，得到脱蛋白后的多糖溶液，将其浓缩至适当体积后冻干，得到山银花粗多糖。
35.(3)称取0.6g山银花粗多糖，溶于10ml水中，分溶解后过滤，滤液采用deae-52纤维素柱(柱体积为2.6
×
60cm)层析，依次使用水、0.1mol/lnacl、0.2mol/l nacl、0.3mol/l nacl、0.4mol/l nacl、0.5mol/l nacl、1mol/l nacl洗脱。流速为1ml/min，10ml/管，每个梯度洗脱液收集60管，取0.2ml/管采用苯酚-浓硫酸法隔管检测多糖含量。如图1a所示，山银花粗多糖经纤维素柱纯化为四种多糖clp1、clp2、clp3和clp4。
36.(4)将clp1在sephadex g-100凝胶过滤柱(长度：100cm，内径：2.6cm)上进一步层析，使用水洗脱，流速为0.5ml/min，5ml/管，共收集40管，取0.2ml/管采用苯酚-浓硫酸法隔管检测多糖含量，结果如图1b所示，得到均质多糖lp。收集含多糖的洗脱液为二次洗脱液。
37.(5)二次洗脱液浓缩、冻干后即得山银花多糖。经deae-52纤维素柱和sephadex g-100凝胶柱纯化的金银花多糖收率为1.41％，lp纯度为94.15％。
38.2、单糖组分分析
39.多糖酸水解：分别精密称取10.00mg山银花多糖样品，加入1ml 2mol/l三氟乙酸，置于120℃高温条件下反应6h，冷却至室温后加入适量甲醇，氮气吹干，重复操作至除尽三氟乙酸，得到多糖水解产物。
40.单糖衍生化：采用三甲基硅烷衍生化法进行单糖的衍生化，干燥后的山银花多糖水解样品分别加入1ml吡啶，摇匀使其溶解，再加0.4ml的六甲基二硅胺烷，0.2ml的三甲基氯硅烷，放置于60℃烘箱中反应30min，3000rpm/min离心10min，取上清液得到单糖衍生物。单糖标准品半乳糖(d-gal)、葡萄糖(d-glc)、阿拉伯糖(d-ara)、甘露糖(d-man)、果糖(fru)、核糖(rib)、木糖(d-xyl)、葡萄糖醛酸(d-glca)、鼠李糖(l-rha)及其混合物也分别按照上述方法进行衍生化。使用aglient 7890a气相谱仪进行气相谱分析，通过比较单糖混标谱图保留时间确定山银花多糖中单糖组成，根据样品中各单糖峰面积及单糖回归曲线计算山银花多糖中各单糖的质量浓度比。结果如图2所示，山银花多糖中的单糖组成均为阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、木糖、甘露糖、果糖、半乳糖、葡萄糖，上述各单糖质量浓度比为3.61:9.08:5.04:1.01:5.32:0.59:0.40:35.75。
41.实施例2：
42.本实施例研究了采用实施例1方法制备的山银花多糖(lp)在改善非酒精性脂肪肝中的作用效果。实验所使用的雄性c57bl/6j小鼠(8周龄)购自斯贝福实验动物科技公司，所用试剂、仪器均为市售商品。所有动物实验均经北京中医药大学动物保护与使用委员会批准。
43.一、实验方法
44.1、动物分组
45.将c57bl/6j小鼠在恒定的温度(22
±
2℃)和12小时/12小时光照和黑暗周期下适应一周，并自由提供标准的食物和水。
46.hfsw饲喂：高脂饮食-含42％的热量和0.2％的胆固醇(td.88137,harlan laboratories,inc,indianapolis,in,usa)，外加饮用水中含有果糖-葡萄糖溶液(d-葡萄糖:18.9g/l和d-果糖:23.1g/l)
47.将小鼠随机分为4组：
48.control组：以标准鼠粮饲喂8周；
49.hfsw组：以hfsw饲喂8周；
50.hfsw-lpl组：以hfsw饲喂8周，在饲喂4周后每天灌胃100mg/kg的lp一次；
51.hfsw-lph组：以hfsw饲喂8周，在饲喂4周后每天灌胃200mg/kg的lp一次。
52.每隔一周记录各组小鼠体重、食物摄入量和饮水量。实验结束时，小鼠全部处死。收集血清，制备肝脏进行石蜡切片或液氮冷冻。
53.2、血糖及胰岛素检测
54.在实验过程中测量不同时间点的空腹体重和空腹血糖。按照说明书用elisa法测定空腹血清胰岛素。葡萄糖耐量试验(gtt)和胰岛素耐量试验(itt)小鼠禁食6h，分别腹腔注射葡萄糖(1g/kg)和胰岛素(0.75u/kg)后测定血糖。分别于注射葡萄糖或胰岛素后15、30、60、120min测血糖。
55.3、血清和肝脏生化指标和细胞因子检测
56.采用购自南京建成生物有限公司的商业试剂盒检测血清和肝脏中的生化指标：谷氨酸氨基转移酶(alt)和天门冬氨酸氨基转移酶(ast)，以及脂质相关指标：甘油三酯(tg)、总胆固醇(tc)、低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)和高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)的含量。
57.血清和肝脏中细胞因子的含量采用购自酶联免疫生物有限公司的elisa试剂盒检测。
58.4、组织学分析和免疫组织化学
59.用10％中性福尔马林或卡诺溶液固定小鼠肝组织，并将其包埋在石蜡中。通过石蜡包埋肝切片的高碘酸希夫染(pas)观察肝组织中的糖原积聚。将嵌入的肝块切成5μm厚的切片，并用苏木精和伊红(h&e)和masson染，以观察脂质积聚模式和纤维化组织含量。用油红o染包埋在tissue-tek-oct复合物中的冷冻肝组织，以评估脂滴积聚。使用光学显微镜观察组织的组织学特征并成像。
60.5、荧光聚合酶链反应(pcr)检测
61.real-time qpcr方法采用sybr green pcr master mix，按照制造商的方案进行。通过比较ct法测定管家基因(actb)相关基因的相对表达量，并以相对mrna水平与内控相比表达。
62.6、western blotting
63.小鼠肝组织或细胞在裂解缓冲液中裂解。采用bicinchoninic acid蛋白测定(thermo fisher)试剂盒测定蛋白质浓度。总蛋白溶解物用梯度凝胶(10％，page凝胶快速制备试剂盒，epizyme)分离，转移到pvdf膜，并在4℃与一抗印迹过夜。洗净印迹，与酶标二抗孵育。用化学发光成像系统检测信号。
64.7、肠道菌分析
65.实验结束前收集粪便，在-80℃冷冻，直到微生物落分析。采用快速dna粪便迷你试剂盒提取粪便总dna。16s rrna基因v3-v4区扩增采用细菌通用引物集，样品送美吉生物科技有限公司进行测序分析。
66.8、统计分析
67.所有数据均以平均值
±
标准差表示。两组之间的差异用t检验进行检验。多组织间比较采用单因素方差分析(one-way anova)。p值分别用以下方式表示:
*
p《0.05；
**
p《0.01；
#
p《0.05；
##
p《0.01；ns表示没有显著差异。
68.二、实验结果分析
69.1、山银花多糖有效保护hfsw诱导的肥胖和胰岛素抵抗
70.通过高脂肪/高胆固醇(hfhc)饮食并在水中添加葡萄糖和半乳糖，饲喂10周后成功建立小鼠nafld模型(图3a)，利用该模型研究发现：山银花多糖能够有效地抑制hfsw导致的体重增长(图3b)；降低小鼠体内白脂肪的重量(图3c)，与hfsw组相比，山银花多糖能显著降小鼠体内空腹血糖和空腹胰岛素的含量，以及稳态评估模型和胰岛素抵抗(homa-ir)指数(图3d)，此外，在gtt和itt分析中，与hfsw组小鼠相比，饲喂山银花多糖的hfsw-lph和hfsw-lpl组小鼠的葡萄糖浓度和曲线下面积显著降低，表明山银花多糖改善了葡萄糖耐量和胰岛素耐量(图3e)。对肝组织进行高碘酸希夫(pas)染，结果表明山银花多糖恢复了hfsw导致的小鼠糖原含量减少(图3f)，与此结果相一致，山银花多糖也抑制了与糖异生相关的基因(g6pc和pck1)的表达(图3g)。此外，山银花多糖能明显促进胰岛素信号通路的激
活，如磷酸化胰岛素受体底物1(p-irs1)、磷酸化丝氨酸/苏氨酸激酶akt(p-akt)和糖原合成酶激酶(p-gsk3β)的蛋白表达水平升高(图3h)。这些结果表明山银花多糖可以缓解hfd引起的肥胖和胰岛素抵抗。
71.2、山银花多糖保护hfsw诱导的肝脏脂肪变性
72.在hfsw喂养8周后，与control组小鼠相比，肝脏重量(lws)和肝脏指数(lw/bw)增加。相反，经山银花多糖的小鼠的lws和lw/bw比率显著降低(图4a)。此外，hfsw-lph和hfsw-lpl组中小鼠的肝脏脂质含量(tg和tc)和血清脂质含量(tg、tc、hdl-c和ldl-c)均远低于hfsw组(图4c和4d)。组织学上，h&e和油红o染显示山银花多糖处理的小鼠肝细胞中的脂滴较小，气球样变性较少(图4e)。基因集富集分析(gesa)证明hfsw组肝脏脂肪酸合成基因高度富集；肝脏中的脂质沉积是脂肪酸合成和摄取有关的几个分子的共同参与调节的(图4f)。热图和rt-pcr分析表明，山银花多糖能有效抑制脂肪酸摄取(cd36和fabp1)和合成(fasn、pparg、scd1和srebf1)相关基因的表达(图4g和4h)。wb结果显示lp能显著抑制脂质合成相关蛋白的表达(图4i)。此外，通过对小鼠血清alt和ast水平测量说明山银花多糖能够改善hfsw饮食诱导的肝损伤程度显(图4b)。总的来说，山银花多糖能够缓解hfsw诱导的肝脂肪变性。
73.3、山银花多糖通过影响肠道菌来nafld
74.通过16s rrna基因测序分析control、hfsw和hfsw-lph组的小鼠肠道菌的整体结构。如图5a所示，结果显示3组间粪便中肠道菌的observed species、chao 1和ace指数均无差异，该指数反映了肠道菌落的均匀性和多样性。此外，主成分分析(pca)和主坐标轴分析(pcoa)图显示，hfsw-lph与hfsw组分离(图5b)，这表明高剂量lp引起了肠道菌落组成的变化。图5c展示了门水平上的肠道细菌图谱概述。结果表明，与hfsw组相比，高剂量lp增加了拟杆菌门的相对丰度，降低了变形菌门的相对丰度(图5d)。在属水平上，lp能显著升高desulfovibrio的相对丰度(图5e)。此外，通过spearman相关性评估，观察到desulfovibrio丰度与脂质指标(tc和tg)、炎症指标(肿瘤坏死因子α，tnf-α和白介素1β，il-1β)以及纤维化指标(透明质酸，ha和肿瘤生长因子β，tgf-β)之间存在很强的负相关(图5f和5g)。
75.综上所述，本发明提供的这种山银花多糖不仅可以减轻nafld的脂肪变性和胰岛素抵抗，还可以通过减少脂质积累、抑制脂质合成相关的基因和蛋白的表达来缓解代谢应激诱导的nash的进展。此外，山银花多糖还可通过改善肠道菌结构，进而对肝脏脂肪变性具有良好的保护作用，对预防和改善非酒精性脂肪肝具有重要的意义和价值。
76.以上例举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.一种用于改善非酒精性脂肪肝的山银花多糖，其特征在于，包括：所述山银花多糖包括阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、木糖、甘露糖、果糖、半乳糖、葡萄糖。2.如权利要求1所述的用于改善非酒精性脂肪肝的山银花多糖，其特征在于：所述阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、木糖、甘露糖、果糖、半乳糖、葡萄糖的质量浓度比为(3-4):(9-10):(5-6):(1-2):(5-6):(0.5-1):(0.2-0.6):(35-36)。3.如权利要求1-2任意一项所述山银花多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采用超声辅助提取法提取山银花粉末，滤液离心取上清液，浓缩后加入乙醇静置，离心取沉淀；(2)沉淀加水溶解后加入萃取液萃取脱蛋白，得到脱蛋白后的多糖溶液，将其浓缩、冻干得到山银花粗多糖；(3)向山银花粗多糖中加水充，分溶解后过滤，滤液采用纤维素柱层析，洗脱后收集含多糖的一次洗脱液；(4)将一次洗脱液经过透析除去氯化钠后在凝胶过滤柱上进一步层析，洗脱后收集二次洗脱液；(5)二次洗脱液浓缩、冻干后即得山银花多糖。4.如权利要求3所述山银花多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)具体为：采用超声辅助提取法提取山银花粉末，滤液离心取上清液，浓缩后加入乙醇使含醇量为75％-85％，静置36-60h，离心取沉淀。5.如权利要求3所述山银花多糖的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中萃取液为savage试剂；所述savage试剂中氯仿与正丁醇的体积比为4：1。6.如权利要求3所述山银花多糖的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中纤维素柱为deae-52纤维素柱。7.如权利要求6所述山银花多糖的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中层析后依次使用水、0.1mol/l nacl进行洗脱；流速为1ml/min，收集洗脱液为一次洗脱液。8.如权利要求3所述山银花多糖的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中凝胶过滤柱为sephadex g-100凝胶过滤柱。9.如权利要求8所述山银花多糖的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中层析后使用水洗脱，流速为0.5ml/min，收集含多糖的洗脱液为二次洗脱液。10.一种用于改善非酒精性脂肪肝的组合物，其特征在于：所述组合物包括如权利要求1-2任意一项所述的山银花多糖。

技术总结

本发明属于生物技术领域，具体提供了一种用于改善非酒精性脂肪肝的山银花多糖，包括：所述山银花多糖包括阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、木糖、甘露糖、果糖、半乳糖、葡萄糖。本发明还提供了一种山银花多糖的制备方法，采用该方法制备的山银花多糖纯度高，有效成分结构特征清晰，质量可控。所述山银花多糖不仅可以减轻非酒精性脂肪肝病(NAFLD)中糖代谢异常和胰岛素抵抗，还可以通过减少脂质积累、抑制脂质合成相关的基因和蛋白的表达来缓解代谢应激诱导的非酒精性脂肪肝炎(NASH)的进展。此外还可通过改善肠道菌结构，进而对肝脏脂肪变性具有良好的保护作用，对预防和改善非酒精性脂肪肝具有重要的意义和价值。有重要的意义和价值。有重要的意义和价值。