一种肉桂酸酰胺衍生物的合成及其制药应用

1.本发明属于药物化合物技术领域，具体涉及一种肉桂酸酰胺衍生物结构、其制备方法及其抗肿瘤活性与制药应用。

背景技术：

2.肉桂酸(3-苯基丙烯酸)是一种天然芳香羧酸，是在肉桂和人参等植物、水果、全谷物、蔬菜和蜂蜜中发现的关键化学物质。苯环上取代的丙烯酸基团使肉桂酸具有顺式(z)或反式(e)构型，其中反式(e)构型最为常见，肉桂酸可通过苯丙氨酸的酶促脱氨反应制备。肉桂酸的结构如下：
3.除了天然存在于植物中的肉桂酸衍生物外，苯环和丙烯酸基团的存在使其修饰合成肉桂酸衍生物成为可能。肉桂酸衍生物不仅是二苯乙烯、苯乙烯等化合物的中间体，还具有抗肿瘤、抗菌、抗真菌、抗炎、神经保护和抗糖尿病等活性。已有文献报道的肉桂酸衍生物有阿魏酸咖啡酸以及korosec等人合成的等。这些肉桂酸衍生物的结构修饰涉及苯环、丙烯基和羧基连接子等部分。
4.肉桂酸衍生物的生物活性改变归因于取代基的性质和位置，例如苯环上取代基的性质和位置影响衍生物的抗菌、抗癌和抗氧化活性，羧基连接子的长度也影响衍生物的生物活性。常规药物的耐药性和缺乏具有低副作用的方法来控制肿瘤、微生物生长、神经系统疾病等现实因素推动了基于肉桂酸的性化合物的开发研究。

技术实现要素：

5.本发明提供了一种肉桂酸酰胺衍生物，其具有有价值的药理性质，特别是抑制肿瘤生长、加速细胞凋亡和抑制细胞活力。
6.本发明还进一步提供了所述肉桂酸酰胺衍生物的制备方法。
7.具有式i结构的化合物，或者其立体异构体、药物可接受的盐或多晶型：
[0008][0009]
其中：
[0010]
r1为苯环上的氢或取代基，r1为取代基时可相同或不同，独立的选自单取代或多取代；r1独立的选自氢、卤素、1-4个碳原子的烷基、1-4个碳原子的烷氧基、1-4个碳原子的卤代烷烃、1-4个碳原子的烷苯基、0-4个碳原子的烷氧苯基、未取代的包含氧氮硫的饱和或不饱和五元六元杂环化合物或被叔丁氧羰基等取代的包含氧氮硫的饱和或不饱和五元六元杂环化合物中的一个或更多个基团；
[0011]
r2和r3相同或不同，独立的选自氢、未取代或取代的苯基、萘基、蒽基、菲基，其中的取代基被独立地选自卤素、1-4个碳原子的烷基、1-4个碳原子的烷氧基、1-4个碳原子的卤代烷烃、1-4个碳原子的烷苯基、0-4个碳原子的烷氧苯基、未取代的包含氧氮硫的饱和或不饱和五元六元杂环化合物或被叔丁氧羰基等取代的包含氧氮硫的饱和或不饱和五元六元杂环化合物中的一个或更多个基团；
[0012]
r4独立的选自氢、甲基、二取代甲基、三取代甲基、未取代或取代的1-4个碳原子的烷苯基、萘基、蒽基、菲基，其中1-4个碳原子的烷苯基、萘基、蒽基、菲基的取代基被独立地选自卤素、1-4个碳原子的烷基、1-4个碳原子的烷氧基、1-4个碳原子的卤代烷烃、1-4个碳原子的烷苯基、0-4个碳原子的烷氧苯基或卤素等取代的0-4个碳原子的烷氧苯基、未取代的包含氧氮硫的饱和或不饱和五元六元杂环化合物或被叔丁氧羰基等取代的包含氧氮硫的饱和或不饱和五元六元杂环化合物中的一个或更多个基团；
[0013]
表示单键或双键；
[0014]
优选，r1为苯环上的氢或取代基，r1为取代基时选自间位单取代，r1选自氢、0-4个碳原子的烷氧苯基、未取代的包含氧氮硫的饱和或不饱和五元六元杂环化合物或被叔丁氧羰基等取代的包含氧氮硫的饱和或不饱和五元六元杂环化合物中的一个或更多个基团；
[0015]
优选，r2和r3相同，均选自氢；
[0016]
优选，选自双键；
[0017]
优选，r4选自未取代的1-4个碳原子的烷苯基或取代的1-4个碳原子的烷苯基，其中取代基被独立地选自异丙基、叔丁基、1-4个碳原子的烷氧基、0-4个碳原子的烷氧苯基或卤素等取代的1-4个碳原子的烷氧苯基、未取代的包含氧氮硫的饱和或不饱和五元六元杂环化合物或被叔丁氧羰基等取代的包含氧氮硫的饱和或不饱和五元六元杂环化合物中的一个或更多个基团。
[0018]
在本发明的一个实施方案中，其中r1为苯环上的氢或取代基，r1为取代基时选自间位单取代，r1选氢、苯氧基、基、叔丁氧羰基取代基或吡啶基中的一个或更多个基团，r2和r3均选自氢，选自双键，r4选自未取代的1-4个碳原子的烷苯基或被独立地选自1-4个碳原子的烷氧基、异丙基、叔丁基、苯氧基、或卤素中的一个或更多个基团取代的1-4个碳原子的烷苯基，其具有式ii结构：
[0019]
根据本发明的一个实施方案，优选化合物为式ii所示的化合物，其中r1独立的选自氢、r4独立的选自独立的选自独立的选自示例性化合物包括表1中阐述的化合物及其药物可接受的盐或其溶剂合物：
[0020]
表1
[0021]
[0022]
[0023][0024]
本发明还提供式i和ii化合物的制备方法：式i和ii化合物由左侧酸部分ra进一步反应生成酰氯，然后与右侧胺部分rb缩合而成，
[0025][0026]
根据本发明的示例性化合物中左侧酸部分ra包括表2阐述的中间体化合物：
[0027]
表2
[0028][0029]
其中，中间体化合物ra1和ra2可以按照本领域已知的合成方法制备，例如：(ra1)in quest of small-molecules as potent non-competitive inhibitors against influenza,bioorg.chem.,2021,114,105139；(ra2)multitarget molecular hybrids of cinnamic acids,molecules,2014,19,20197-20226。
[0030]
因此本发明还提供上述中间体化合物ra3，其制备方法如下：
[0031][0032]
根据本发明的示例性化合物中右侧胺部分包括表3阐述的中间体化合物：
[0033]
表3
[0034]
[0035][0036]
其中，中间体化合物rb1～rb12可按照本领域已知的合成方法制备，例如：(rb1)pct int.appl.,2014120995,07aug 2014；(rb6)cn,111116375a,08may 2020；(rb11)efficient conversion of primary and secondary alcohols to primary amines,tetrahedron letters,48(44),7745-7746；2007。
[0037]
除特别说明之外，上述制备方法中已有文献报道的化合物均可以采用本领域已知的反应方法和条件进行。
[0038]
本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明的式i化合物或其溶剂化物作为活性成分，任选地还含有一种或多种药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体是制药领域中常用或已知的各种辅料，包括但不限于：稀释剂、粘合剂、抗氧化剂、ph调节剂、防腐剂、润滑剂、崩解剂等。
[0039]
在本发明的一种实施方式中，所述药物组合物用于或预防癌症，抑制肿瘤生长、加速细胞凋亡和抑制细胞活力。
[0040]
根据本发明，所述癌症包括实体瘤和非实体瘤以及原发性和继发性癌症，包括但不限于白血病、肝癌、肺癌、结肠癌、淋巴癌和甲状腺癌等，优选，所述癌症为原发性肝癌和结肠癌。
[0041]
所述药物组合物中含有式i化合物的量(以式i化合物计)为0.1-1000mg，优选1-500mg，更优选为5-100mg。
[0042]
所述药物组合物中式i化合物(以式i化合物计)占药物组合物的质量百分比为0.01％-95％，根据剂型不同例如可以为0.1％-10％，0.3～5％，或者10％-90％，优选为20％-80％，更优选为30％-70％等含量范围。
[0043]
所述药物组合物的剂型可以是口服剂的形式，例如片剂、胶囊、丸剂、粉剂、颗粒剂、悬浮剂、糖浆剂等；也可以是注射给药的剂型，例如注射液、粉针剂等，通过静脉内、腹膜内、皮下或肌肉内的途径注射给药。所有使用的剂型形式都是药学领域普通技术人员所熟知的。例如所述药物组合物可以为注射液，式i化合物在注射液中的浓度可以为1-15mg/ml，例如5mg/ml、10mg/ml、12.5mg/ml等。
[0044]
所述药物组合物的施用途径包括但不限于：口服的；含服的；舌下的；透皮的；肺的；直肠的；肠胃外的，例如，通过注射，包括皮下的、真皮内的、肌内的、静脉内的；通过植入储库或储液器。
[0045]
式i化合物的施用剂量(以式a化合物计)将取决于接受者的年龄、健康和体重，联用药物的种类，频率，给药途径等。药物可以单一日剂量施用，每天给药一次、每两天给药一次、每三天给药一次、每四天给药一次，或者总日剂量以每天两次、三次或四次的分开剂量施用。式i化合物用药量(以式i化合物计)为0.01-100mg/kg/天，优选为0.1-10mg/kg/
天，例如为0.5mg/kg/天，1mg/kg/天、2mg/kg/天、5mg/kg/天等等。
[0046]
所述药物组合物可以和其他的剂联合应用给药或者制成组合药物。所述其他剂根据疾病和病症类型不同，可以是其他的癌症的药物等。
[0047]
其他的癌症的药物包括但不限于：紫杉类(多西他赛、紫杉醇)、铂类(奥沙利铂、顺铂)、氟尿嘧啶类(希罗达、替吉奥)、蒽环类(多柔吡星、吡柔吡星)、吉菲替尼、索拉菲尼、抗生素、血容量扩充剂、血管活物、糖皮质激素、血制品、血糖控制药物、抗凝药等。
[0048]
本发明提供式i化合物在制备或预防癌症的药物中的应用。所述药物能够抑制肿瘤生长、加速细胞凋亡和抑制细胞活力。
[0049]
本发明提供式i化合物和其他的癌症的药物联合在制备或预防癌症的药物中的用途。
[0050]
本发明提供式i化合物和其他的癌症的药物联合在制备抑制癌症患者的肿瘤生长的药物中的用途。
[0051]
本发明提供式i化合物和其他的癌症的药物联合在制备加速癌症患者的肿瘤细胞凋亡的药物中的用途。
[0052]
本发明提供式i化合物和其他的癌症的药物联合在制备抑制癌症患者的肿瘤细胞活力的药物中的用途。
[0053]
本发明提供式i化合物在制备和其他的癌症的药物联合或预防癌症药物中的用途。
[0054]
本发明提供一种或预防癌症，抑制肿瘤生长、加速细胞凋亡和抑制细胞活力的方法，其特征在于，对有需要的患者施用有效量的式i化合物或其溶剂化物、或者含有式i化合物或其溶剂化物的药物组合物。
[0055]
本发明式i化合物具有明确且高效的癌症和预防效果，能够抑制肿瘤生长、加速细胞凋亡和抑制细胞活力，不具有细胞毒性。因此在用途的同时保证用药的安全性。式i化合物结构明确，利于制备和质量控制。
附图说明
[0056]
图1cck-8检测细胞活力实验结果
[0057]
图2流式凋亡检测-给药24h,10μm后hepg2细胞凋亡情况
[0058]
图3流式凋亡检测-给药48h,10μm后hepg2细胞凋亡情况
[0059]
图4流式凋亡检测-给药24h,15μm后hepg2细胞凋亡情况
[0060]
图5流式凋亡检测-给药24h lo2细胞凋亡情况
[0061]
图6划痕实验结果
[0062]
图7化合物18毒性实验小鼠给药14天主要器官he染结果
[0063]
图8化合物18毒性实验小鼠血清生化指标
[0064]
图9化合物18毒性实验14天小鼠体重变化
[0065]
图10不同浓度梯度化合物18对hct-18和hct116细胞活力的影响
具体实施方式
[0066]
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，
下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
[0067]
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
[0068]
pcc：氯铬酸吡啶盐；(dppf)2pdcl2：[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯；pd(oac)2：醋酸钯；pd/c：钯碳；pph3：三苯基磷；tbab：四丁基溴化铵；nabh4：硼氢化钠；bppo：n1,n2双([1,1'-联苯]-2-基)乙二酰胺；tmsbr：三甲基溴硅烷；(cocl)2：草酰氯；tfa：三氟乙酸；dmf：n,n-二甲基甲酰胺；pd(pph3)4：四三苯基膦钯。
[0069]
实施例1 ra系列化合物的制备
[0070]
1、肉桂酸(ra1)的制备方法
[0071][0072]
在室温下，50ml dmf中依次加入苯甲醛(5.00ml，49.06mmol)、丙二酸(15.32g，147.31mmol)以及吡啶(4.00ml，49.72mmol)。95℃搅拌过夜后tlc监测，待反应完全后用饱和nahco3溶液/二氯甲烷体系萃取。收集有机层后加入过量无水硫酸钠干燥，随后过滤并减压浓缩，经硅胶柱谱法纯化(石油醚：乙酸乙酯＝2:1，体积比)，得到白固体肉桂酸(ra1)(6.71g，92％)。
[0073]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ12.07(bs,1h),7.80(d,j＝16.0hz,1h),7.58
–
7.51(m,2h),7.42
–
7.36(m,3h),6.46(d,j＝16.0hz,1h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ172.86,147.25,134.16,130.88,129.09(2c),128.51(2c),117.48.
[0074]
2、(e)-3-苯氧基肉桂酸(ra2)的制备方法
[0075][0076]
取3-苯氧基苄醇(1.00ml，5.75mmol)溶于20ml dcm中，加入氯铬酸吡啶盐(1.80g，8.63mmol)室温搅拌3h，tlc监测，待反应完全后，加入50ml dcm稀释并加入大量硅藻土，搅拌15min后垫硅藻土过滤并用dcm洗涤3-5遍。收集滤液并减压浓缩，经硅胶柱谱法纯化，得到淡黄液体间苯氧基苯甲醛(ra2-1)(0.84g，74％)。
[0077]
在室温下，往10ml dmf中依次加入间苯氧基苯甲醛(1.00ml，5.79mmol)、丙二酸(1.90g，18.27mmol)以及吡啶(0.48ml，5.97mmol)。95℃搅拌过夜，tlc监测，待反应完全后用饱和碳酸氢钠溶液二氯甲烷体系萃取。收集有机层后加入过量无水硫酸钠干燥0.5h随后过滤并减压浓缩，经硅胶柱谱法纯化(石油醚：乙酸乙酯＝5:1，体积比)，得到白固体(e)-3-苯氧基肉桂酸(ra2)(1.29g，93％)。
[0078]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ12.32(bs,1h),7.79(d,j＝15.6hz,1h),7.78
–
7.38(m,3h),7.32(s,1h),7.22-7.20(m,2h),7.13
–
7.07(m,3h),6.45(d,j＝15.6hz,1h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ172.66,158.07,156.65,146.50,135.89,130.36,130.03(2c),123.93,123.32,120.99,119.33,119.28,118.20,117.98.
[0079]
3、(e)-3(4-(1-叔丁氧羰基)-基)肉桂酸(ra3)的制备方法
[0080][0081]
1)4-(3-溴-苯基)-3，6-二氢-2h-吡啶-1-羧酸叔丁酯(ra3-1)的制备
[0082][0083]
取4-(4,4,5,5-四甲基-[1,3,2]二氧杂-2-基)-3,6-二氢-2h-吡啶-1-羧酸叔丁酯(1.00g，3.23mmol)、(dppf)2pdcl2(0.12g，0.16mmol)以及k2co3(1.34g，9.71mmol)于100ml三颈烧瓶中，加入超声脱气的二恶烷/水(15ml：15ml)混合液溶解后再缓慢滴加1-溴-3-碘苯(0.50ml，3.92mmol)。氩气保护，85℃搅拌过夜，tlc监测。待反应结束后，室温搅拌0.5h，待三颈烧瓶冷却至室温后，二氯甲烷/饱和食盐水体系萃取，收集有机层后加入过量无水硫酸钠干燥0.5h随后过滤并减压浓缩，经硅胶柱谱法纯化，得到无油状4-(3-溴-苯基)-3，6-二氢-2h-吡啶-1-羧酸叔丁酯(ra3-1)(0.72g，66％)。
[0084]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.50(s,1h),7.38(d,j＝7.8hz,1h),7.29(d,j＝7.8hz,1h),7.19(td,j＝7.8,2.1hz,1h),6.04(s,1h),4.10
–
4.04(m,2h),3.64-3.61(m,2h),2.52
–
2.44(m,2h),1.49(s,9h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ154.84,142.88,130.17,129.99(2c),128.17(2c),123.59,122.74,79.84,43.93,43.48,28.56(3c),27.36.
[0085]
2)4-(3-溴苯基)-1-甲酸叔丁酯(ra3-2)的制备
[0086][0087]
取化合物ra3-1(1.00g，2.97mmol)以及10％的pd/c(0.10g)于50ml三颈烧瓶中，加入20ml乙酸乙酯溶解，经重复换气后接入氢气球，室温搅拌过夜，tlc监测，反应完全后垫硅藻土过滤，减压浓缩后上柱，经硅胶柱谱法纯化后得到4-(3-溴苯基)-1-甲酸叔丁酯(ra3-2)(0.97g，96％)。
[0088]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.34-7.30(m,2h),7.16-7.10(m,2h),4.35
–
4.11(m,2h),2.77(t,j＝12.8hz,2h),2.60(t,j＝12.0hz,1h),1.79(d,j＝12.0hz,2h),1.58(q,j＝12.8hz,2h),1.47(s,9h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ154.86,148.19,130.20,130.08,129.53,125.56,122.68,79.62,44.13,42.56(2c),33.10(2c),28.58(3c).
[0089]
3)(e)-3(4-(1-叔丁氧羰基)-基)肉桂酸(ra3)的制备
[0090][0091]
依次取化合物ra3-2(0.50g，1.47mmol)、pd(oac)2(0.03g，0.13mmol)以及pph3(0.09g，0.29mmol)于50ml三颈烧瓶中并加入20ml dmf溶解，ar2保护，室温搅拌10min，再加入三乙胺(0.61ml，4.40mmol)丙烯酸(0.12ml，1.77mmol)，升温至120℃搅拌过夜。待tlc显示反应停止后，应用二氯甲烷/饱和食盐水体系萃取，收集有机层后加入过量无水硫酸钠干燥0.5h随后过滤并减压浓缩，经硅胶柱谱法纯化(石油醚：乙酸乙酯＝10:1，体积比)，得到白粉末状(e)-3(4-(1-叔丁氧羰基)-基)肉桂酸(ra3)(0.35g，72％)。
[0092]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ10.07(s,1h),7.74(d,j＝15.9hz,1h),7.40
–
7.29(m,3h),7.23(d,j＝7.6hz,1h),6.44(d,j＝15.9hz,1h),4.24(s,2h),2.86
–
2.71(m,2h),2.71
–
2.57(m,1h),1.81(d,j＝13.0hz,2h),1.62(tt,j＝13.3,6.5hz,2h),1.47(s,9h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ171.75,154.99,146.73,146.62,134.42,129.28,129.23,126.93,126.45,117.68,79.78,44.41,42.66(2c),33.14(2c),28.57(3c).
[0093]
实施例2 rb系列化合物的制备
[0094]
4、(3-苯氧基苯基)甲胺(rb1)的制备方法
[0095][0096]
1)rb1-1的制备
[0097]
依次取3-苯氧基苄醇(1.40ml，8.04mmol)，tmsbr(1.17ml，8.87mmol)于5ml圆底烧瓶中，室温搅拌1h，待tlc监测到反应大致完全后，减压浓缩，经硅胶柱谱法纯化(石油醚)，得到无液体状rb1-1(2.07g，98％)。
[0098]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.39(tt,j＝7.4,1.2hz,2h),7.32(t,j＝7.9hz,1h),7.19-7.14(m,2h),7.11
–
7.02(m,3h),6.97(ddt,j＝8.2,2.5,1.2hz,1h),4.46(s,2h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ157.68,156.79,139.69,130.19,129.95(2c),123.79,123.71,119.26,119.21(2c),118.68,33.02.
[0099]
2)rb1-2的制备
[0100]
取化合物rb1-1(0.60g，2.28mmol)溶于dmf(15ml)中，缓慢加入邻苯二甲酰亚胺化钾(0.46g，2.49mmol)，室温搅拌5h，待tlc监测显示反应完毕后，加水(50ml)稀释沉淀，静置1.5h，待沉淀完全后，过滤收集固体并用水洗涤3遍，即得白晶体状rb1-2(0.69g，92％)。
[0101]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.85(dd,j＝5.4,3.1hz,2h),7.71(dd,j＝5.4,3.1hz,2h),7.32(t,j＝7.8hz,2h),7.26(t,j＝7.9hz,1h),7.14(d,j＝7.8hz,1h),7.12
–
7.06(m,2h),6.98(d,j＝8.2hz,2h),6.87(dd,j＝8.0,2.4hz,1h),4.82(s,2h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ168.07,157.58,157.02,138.38,134.16(2c),132.19,130.09(2c),129.86,123.53
(2c),123.48,123.17,119.06,119.01(2c),118.03,41.38.
[0102]
将前述rb1-2加入乙醇(40ml)形成悬浮液，缓慢加入水合肼(0.50ml)，加热回流5h，tlc监测，待反应完毕后冷却静置0.5h，过滤收集滤液，浓缩后即得(3-苯氧基苯基)甲胺(rb1)粗品，不经进一步纯化而直接投入下一步反应，(0.38g，91％)。
[0103]
实施例3化合物1-18的制备方法
[0104]
1、化合物1的制备
[0105][0106]
取化合物ra1(0.50g，3.38mmol)于烘干的50ml圆底烧瓶中，加入20ml无水dcm溶解，滴入1滴干燥的dmf做催化剂，冰浴并缓慢加入草酰氯(0.25ml，2.95mmol)搅拌反应40min，tlc监测，待反应完全后加入干燥的三乙胺(0.70ml，5.05mmol)以及化合物rb1(0.59g，2.96mmol)，室温反应1h，反应完全后减压浓缩，使用中性氧化铝柱谱法纯化，得到棕固体(e)-n-(3-苯氧基苄基)肉桂酰胺(化合物1)(0.88g，两步产率90％)。
[0107]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.67(d,j＝15.8hz,1h),7.53
–
7.42(m,2h),7.35(d,j＝4.9hz,5h),7.27(d,j＝8.4hz,1h),7.13(d,j＝7.7hz,1h),7.07(d,j＝7.7hz,1h),7.01(d,j＝8.4hz,3h),6.91(d,j＝8.2hz,1h),6.61
–
6.42(m,2h),4.53(t,j＝3.8hz,2h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ166.07,157.64,157.00,141.44,140.42,134.83,130.09,129.86,129.78,128.87,127.89,123.49,122.56,120.57,119.04,118.14,117.72,43.53.
[0108]
2、化合物2-11的制备
[0109]
1)(e)-n-苄基-3-苯氧基肉桂酰胺(化合物2)的制备
[0110][0111]
合成步骤同化合物1，获得棕固体(e)-n-苄基-3-苯氧基肉桂酰胺(化合物2)(0.58g，两步产率93％)。
[0112]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.45(d,j＝15.6hz,1h),7.27
–
7.09(m,8h),7.05(d,j＝7.7hz,1h),7.03
–
6.95(m,2h),6.87(t,j＝8.5hz,3h),6.44(s,1h),6.29(d,j＝15.6hz,1h),4.38(d,j＝5.7hz,2h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ165.80,157.75,156.83,140.52,138.20,136.70,130.16,129.93,128.72,127.87,127.53,123.65,123.01,121.44,119.99,119.11,117.43,43.81.
[0113]
2)(e)-n-苄基(4-异丙基)-3-苯氧基肉桂酰胺(化合物3)的制备
[0114][0115]
合成步骤同化合物1，获得(e)-n-苄基(4-异丙基)-3-苯氧基肉桂酰胺(化合物3)(0.21g，两步产率51％)。
[0116]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.58(d,j＝15.6hz,1h),7.37
–
7.26(m,3h),7.26
–
7.15(m,5h),7.15
–
7.08(m,2h),7.03
–
6.95(m,3h),6.33(d,j＝15.6hz,1h),6.03(d,j＝5.0hz,1h),4.53(d,j＝5.6hz,2h),2.94
–
2.82(m,1h),1.23(s,3h),1.23(s,3h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ165.49,157.80,156.77,148.39,140.58,136.66,135.45,130.15,130.01,129.90,128.06,126.82,123.65,122.98,121.30,119.96,119.15,117.25,43.68,33.84,24.01.
[0117]
3)(e)-n-苄基(4-叔丁基)-3-苯氧基肉桂酰胺(化合物4)的制备
[0118][0119]
合成步骤同化合物1，获得(e)-n-苄基(4-叔丁基)-3-苯氧基肉桂酰胺(化合物4)(0.23g，两步产率55％)。
[0120]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.57(d,j＝15.6hz,1h),7.33
–
7.29(m,4h),7.26
–
7.21(m,3h),7.16(d,j＝7.7hz,1h),7.10(d,j＝4.2hz,2h),6.99
–
6.94(m,3h),6.34(d,j＝15.6hz,1h),6.24(t,j＝5.1hz,1h),4.48(d,j＝5.6hz,2h),1.28(s,9h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ165.59,157.79,156.79,150.59,140.50,136.70,135.12,130.15,129.91,127.77,125.67,123.65,123.01,121.41,119.94,119.15,117.30,43.56,34.54,31.36.
[0121]
4)(e)-n-苄基(4-甲氧基)-3-苯氧基肉桂酰胺(化合物5)的制备
[0122][0123]
合成步骤同化合物1，获得(e)-n-苄基(4-甲氧基)-3-苯氧基肉桂酰胺(化合物5)(0.11g，两步产率24％)。
[0124]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.56(d,j＝15.6hz,1h),7.35
–
7.27(m,2h),7.26(d,j＝7.4hz,1h),7.23
–
7.18(m,3h),7.13
–
7.05(m,2h),6.97(t,j＝8.9hz,3h),6.82(d,j＝8.3hz,2h),6.35(d,j＝15.6hz,1h),6.28(s,1h),4.43(d,j＝5.3hz,2h),3.75(s,3h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ165.63,159.01,157.73,156.79,140.42,136.70,130.28,130.14,129.91,129.28,123.64,123.00,121.46,119.92,119.11,117.35,114.08,55.28,43.30.
[0125]
5)(e)-n-苄基(3,4-二甲氧基)-3-苯氧基肉桂酰胺(化合物6)的制备
[0126][0127]
合成步骤同化合物1，获得(e)-n-苄基(3,4-二甲氧基)-3-苯氧基肉桂酰胺(化合物6)(0.68g，两步产率93％)。
[0128]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.58(d,j＝15.5hz,1h),7.32(t,j＝7.7hz,2h),7.24(t,j＝7.9hz,1h),7.16(d,j＝7.7hz,1h),7.14
–
7.07(m,2h),6.99(s,1h),6.96(d,j＝8.3hz,2h),6.82(d,j＝8.2hz,2h),6.77(d,j＝8.0hz,1h),6.52
–
6.29(m,2h),4.45(d,j＝5.2hz,2h),3.81(s,3h),3.81(s,3h).
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ165.63,157.80,156.80,149.18,148.52,140.53,136.71,130.82,130.18,129.92,123.68,123.04,121.45,120.31,119.98,119.13,117.34,111.37,111.30,55.96,55.91,43.74.
[0129]
6)(e)-n-苄基(4-乙氧基)-3-苯氧基肉桂酰胺(化合物7)的制备
[0130][0131]
合成步骤同化合物1，获得(e)-n-苄基(4-乙氧基)-3-苯氧基肉桂酰胺(化合物7)(0.21g，两步产率51％)。
[0132]
h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.55(d,j＝15.6hz,1h),7.32(t,j＝7.9hz,2h),7.27
–
7.24(m,1h),7.17(t,j＝9.5hz,3h),7.13
–
7.06(m,2h),6.98
–
6.94(m,3h),6.81(d,j＝8.6hz,2h),6.34(d,j＝15.6hz,1h),6.26(s,1h),4.42(d,j＝5.6hz,2h),3.96(q,j＝7.0hz,2h),1.38(t,j＝7.0hz,3h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ165.55,158.42,157.75,156.79,140.43,136.70,130.13,130.09,129.90,129.27,123.64,123.00,121.44,119.92,119.12,117.32,114.66,63.48,43.34,14.84.
[0133]
7)(e)-n-苄基(4-氯)-3-苯氧基肉桂酰胺(化合物8)的制备
[0134][0135]
合成步骤同化合物1，获得(e)-n-苄基(4-氯)-3-苯氧基肉桂酰胺(化合物8)(0.25g，两步产率63％)。
[0136]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.57
–
7.55(m,1h),7.32(t,j＝6.8hz,2h),7.28
–
7.21(m,3h),7.21
–
7.05(m,5h),6.99(d,j＝7.1hz,3h),6.36(d,j＝13.6hz,2h),4.45(s,2h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ165.75,157.80,156.77,140.89,136.75,136.53,133.32,130.18,129.90,129.16,128.82,123.67,123.03,121.05,120.07,119.12,117.30,43.08.
[0137]
8)(e)-n-苄基(4-溴)-3-苯氧基肉桂酰胺(化合物9)的制备
[0138][0139]
合成步骤同化合物1，获得(e)-n-苄基(4-溴)-3-苯氧基肉桂酰胺(化合物9)(0.23g，两步产率52％)。
[0140]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.58(d,j＝15.7hz,1h),7.42(d,j＝7.7hz,2h),7.34(t,j＝7.5hz,2h),7.31
–
7.24(m,1h),7.20
–
7.08(m,5h),6.99(t,j＝6.9hz,3h),6.35(d,j＝15.7hz,1h),6.15(s,1h),4.47(d,j＝5.8hz,2h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ165.66,157.82,156.75,141.00,137.25,136.49,131.81,130.19,129.90,129.53,123.67,123.04,121.45,120.93,120.10,119.14,117.26,43.15.
[0141]
9)(e)-n-(4-甲氧基苯乙基)-3-苯氧基肉桂酰胺(化合物10)的制备
[0142][0143]
合成步骤同化合物1，获得(e)-n-(4-甲氧基苯乙基)-3-苯氧基肉桂酰胺(化合物10)0.24g，两步产率52％)。
[0144]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.54(d,j＝15.6hz,1h),7.38
–
7.23(m,3h),7.17(d,j＝7.6hz,1h),7.13
–
7.10(m,4h),6.97(m,3h),6.83(d,j＝8.5hz,2h),6.27(d,j＝15.6hz,1h),5.89(s,1h),3.76(s,3h),3.58
–
3.53(m,2h),2.81(t,j＝12.4,5.4hz,2h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ165.68,158.32,157.72,156.84,140.22,136.73,130.82,130.13,129.89,129.73,123.60,123.03,121.52,119.95,119.05,117.38,114.11,55.27,41.06,34.74.
[0145]
10)(e)-n-(4-甲氧基苯丙基)-3-苯氧基肉桂酰胺(化合物11)的制备
[0146][0147]
合成步骤同化合物1，获得(e)-n-(4-甲氧基苯丙基)-3-苯氧基肉桂酰胺(化合物11)(0.23g，两步产率48％)。
[0148]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.52(d,j＝15.6hz,1h),7.29(m,3h),7.16(d,j＝7.6hz,1h),7.14
–
7.03(m,4h),6.99
–
6.94(m,3h),6.79(d,j＝8.4hz,2h),6.33(d,j＝15.6hz,1h),6.11(s,1h),3.74(s,3h),3.37(dd,j＝13.2,6.6hz,2h),2.59(t,j＝7.6hz,2h),1.89
–
1.76(m,2h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ165.82,157.91,157.73,156.85,139.97,136.79,133.50,
130.14,129.90,129.30,123.61,123.01,121.74,119.89,119.07,117.35,113.91,55.26,39.44,32.43,31.42.
[0149]
3、化合物12-19制备
[0150]
1)(e)-n-苄基-3(4-(1-叔丁氧羰基)-基)肉桂酰胺(化合物12)的制备
[0151][0152]
合成步骤同化合物1，获得(e)-n-苄基-3(4-(1-叔丁氧羰基)-基)肉桂酰胺(化合物12)(0.31g，两步产率87％)。
[0153]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.63(d,j＝15.6hz,1h),7.35
–
7.30(m,5h),7.28
–
7.22(m,3h),7.15(d,j＝7.6hz,1h),6.65(d,j＝10.3hz,1h),6.50(dd,j＝15.6,2.6hz,1h),4.54(d,j＝5.8hz,2h),4.21(d,j＝9.3hz,2h),2.76(s,2h),2.62
–
2.57(m,1h),1.75(d,j＝12.5hz,2h),1.58
–
1.51(m,2h),1.48(s,9h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ165.96,154.85,146.33,141.17,138.37,135.11,128.98,128.67,128.15,127.83,127.44,126.40,125.79,120.78,79.56,43.76,42.53,33.06,28.51.
[0154]
2)(e)-n-苄基(4-甲氧基)-3(4-(1-叔丁氧羰基)-基)肉桂酰胺(化合物13)的制备
[0155][0156]
合成步骤同化合物1，获得(e)-n-苄基(4-甲氧基)-3(4-(1-叔丁氧羰基)-基)肉桂酰胺(化合物13)(0.20g，两步产率52％)。
[0157]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.64(d,j＝15.6hz,1h),7.34
–
7.28(m,3h),7.26(s,1h),7.24(s,1h),7.17(d,j＝7.6hz,1h),6.86(d,j＝8.6hz,2h),6.43(d,j＝15.6hz,1h),6.17(s,1h),4.50(d,j＝5.6hz,2h),4.23(s,2h),3.78(s,3h),2.78(s,2h),2.65
–
2.59(m,1h),1.79(d,j＝12.7hz,2h),1.62
–
1.56(m,2h),1.48(s,9h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ165.71,159.04,154.85,146.38,141.25,135.04,130.32,129.30,129.01,128.23,126.36,125.83,120.61,114.09,79.56,55.32,43.33,42.57,33.05,28.50.
[0158]
3)(e)-n-苄基(4-乙氧基)-3(4-(1-叔丁氧羰基)-基)肉桂酰胺(化合物14)的制备
[0159][0160]
合成步骤同化合物1，获得(e)-n-苄基(4-乙氧基)-3(4-(1-叔丁氧羰基)-基)肉桂酰胺(化合物14)(0.32g，两步产率79％)。
[0161]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.62(d,j＝15.4hz,1h),7.28(s,3h),7.24
–
7.17(m,2h),7.19(s,1h),6.82(d,j＝2.8hz,2h),6.47(d,j＝14.6hz,2h),4.47(s,2h),4.21(m,2h),3.98(m,2h),2.76(q,2h),2.60(m,1h),1.79
–
1.76(m,2h),1.56(m,2h),1.48(s,9h),1.38(t,j＝4.3hz,3h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ165.79,158.38,154.84,146.33,141.05,135.13,130.28,129.20,128.97,128.11,126.36,125.78,120.85,114.66,79.53,63.46,43.29,42.53,33.06,28.50,14.81.
[0162]
4)(e)-n-苄基(4-异丙基)-3(4-(1-叔丁氧羰基)-基)肉桂酰胺(化合物15)的制备
[0163][0164]
合成步骤同化合物1，获得(e)-n-苄基(4-异丙基)-3(4-(1-叔丁氧羰基)-基)肉桂酰胺(化合物15)(0.21g，两步产率53％)。
[0165]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.65(d,j＝15.6hz,1h),7.31(dd,j＝12.4,4.3hz,2h),7.28
–
7.21(m,3h),7.21
–
7.14(m,3h),6.45(d,j＝15.6hz,1h),6.29(s,1h),4.53(d,j＝5.5hz,2h),4.23(s,2h),2.91
–
2.86(m,1h),2.77(s,2h),2.64
–
2.61(m,1h),1.76(t,j＝16.2hz,2h),1.59
–
1.56(m,2h),1.48(s,9h),1.23(s,3h),1.22(s,3h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ165.77,154.85,148.30,146.36,141.22,135.58,135.06,134.48,129.01,128.21,128.03,126.80,126.38,125.83,120.66,79.56,43.63,42.57,33.84,33.09,28.51,24.04.
[0166]
5)(e)-n-苄基-3(4-基)肉桂酰胺(化合物16)的制备
[0167][0168]
将化合物12(0.20g,0.48mmol)置于50ml圆底烧瓶中，加入二氯甲烷(2ml)使之溶解，0℃下加入tfa(0.5ml,6.73mmol)，在25℃反应12h。经过tlc监测反应结束后，在0℃下，用饱和nahco3溶液将ph调至8左右。用dcm与饱和nacl溶液萃取，收集dcm层，加入无水na2so4干燥，过滤。通过柱层析谱法分离纯化，(固定相为中性氧化铝，流动相为dcm:meoh＝10:1)，减压浓缩，得到白粉末状(e)-n-苄基-3(4-基)肉桂酰胺(化合物16)(0.11g，产率72％)。
[0169]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.74(t,j＝5.9hz,1h),7.47(d,j＝15.8hz,1h),7.42(t,j＝10.6hz,3h),7.38
–
7.35(m,1h),7.35
–
7.29(m,4h),7.28
–
7.24(m,2h),6.75(d,j＝15.8hz,1h),4.41(d,j＝5.9hz,2h),3.24(d,j＝12.1hz,2h),3.17(s,1h),2.86(dd,j＝11.1,8.8hz,2h),2.78
–
2.74(m,1h),1.84(s,2h),1.76(dd,j＝12.3,9.6hz,2h).
13
c nmr(100mhz,dmso-d6)δ167.02,145.00,140.50,138.51,135.31,129.01,128.23,127.88,127.28,126.93,126.29,125.71,120.65,44.12,42.94,39.63,29.68.
[0170]
6)(e)-n-苄基(4-甲氧基)-3(4-基)肉桂酰胺(化合物17)的制备
[0171][0172]
合成步骤同化合物16，获得(e)-n-苄基(4-甲氧基)-3(4-基)肉桂酰胺(化合物17)(0.12g，73％)。
[0173]1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.56(d,j＝15.8hz,1h),7.39(d,j＝6.0hz,2h),7.30(dd,j＝10.1,5.6hz,1h),7.25
–
7.22(m,3h),6.86(dd,j＝8.9,2.4hz,2h),6.65(d,j＝15.8hz,1h),4.41(d,j＝3.0hz,2h),3.73(s,3h),3.20
–
3.08(m,2h),2.75
–
2.72(m,2h),2.69
–
2.54(m,1h),1.79(t,j＝11.5hz,2h),1.73
–
1.59(m,2h).
13
c nmr(100mhz,cd3od)δ166.95,159.05,146.89,140.69,135.05,130.44,128.77,128.69,128.05,126.21,125.34,120.38,113.58,54.30,45.75,42.47,41.98,32.86.
[0174]
7)(e)-n-苄基(4-乙氧基)-3(4-基)肉桂酰胺(化合物18)的制备
[0175][0176]
合成步骤同化合物16，获得(e)-n-苄基(4-乙氧基)-3(4-基)肉桂酰胺(化合物18)(0.08g，51％)。
[0177]1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.57(d,j＝15.7hz,1h),7.44(s,2h),7.34
–
7.32(m,1h),7.29
–
7.22(m,3h),6.87(d,j＝7.8hz,2h),6.68(d,j＝15.7hz,1h),4.43(s,2h),4.00(q,j＝6.8hz,2h),3.29(d,j＝12.3hz,2h),2.91
–
2.88(m,2h),2.78(t,j＝11.9hz,1h),1.92(d,j＝13.2hz,2h),1.85
–
1.76(m,2h),1.36(t,j＝6.0hz,3h).
13
c nmr(100mhz,cd3od)δ166.96,158.34,146.20,140.57,135.18,130.37,128.83,128.66,127.95,126.21,125.45,120.56,63.09,45.24,42.49,41.16,31.77,13.81.
[0178]
8)(e)-n-苄基(4-异丙基)-3(4-基)肉桂酰胺(化合物19)的制备
[0179][0180]
合成步骤同化合物16，获得(e)-n-苄基(4-异丙基)-3(4-基)肉桂酰胺(化合物19)(0.03g，21％)。
[0181]1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.56(d,j＝15.8hz,1h),7.42(d,j＝1.7hz,2h),7.32(t,j＝7.8hz,1h),7.27
–
7.22(m,3h),7.19(d,j＝8.2hz,2h),6.65(d,j＝15.8hz,1h),4.45(s,2h),3.31
–
3.30(m,1h),3.23(d,j＝12.4hz,2h),2.86
–
2.79(m,2h),1.87(d,j＝12.5hz,2h),1.76
–
1.71(m,2h),1.23(s,3h),1.21(s,3h).
13
c nmr(100mhz,cd3od)δ167.04,147.83,146.56,140.68,135.82,135.11,128.78,128.00,127.39,126.25,126.20,125.34,120.34,45.49,42.74,41.60,33.71,32.32,23.09.
[0182]
实施例4 cck-8细胞活力检测实验
[0183]
初步活性筛选后选取化合物18进行后续活性检测实验。选用肝癌细胞hpeg2和正
常肝细胞lo2两种细胞系并采用cck-8试剂盒进行细胞活力检测实验，为探讨化合物18对人肝癌细胞hepg2和正常肝细胞lo2的细胞活力及增殖的影响，用不同浓度的化合物18或乐伐替尼(阳)作用于hepg2细胞24h或48h，实验方法如下：
[0184]
1)复苏hepg2及lo2细胞并培养至三代以上，pbs冲洗细胞两次后，使用胰蛋白酶消化细胞并离心，随后进行细胞计数。
[0185]
2)将细胞以每孔约1x104个细胞的密度接种于96孔板上(100μl/孔)，并将其放入培养箱中培养过夜。
[0186]
3)预培养结束后，向96孔板中加入不同浓度(0、5、10、15、20、50μm)的化合物18，孵育24h或48h。
[0187]
4)共孵育结束后，向96孔板中加入cck-8溶液(10μl/孔)。
[0188]
5)将96孔板在培养箱中孵育1-4h。
[0189]
6)用酶标仪测定在450nm处的吸光度，并计算细胞活力，公式如下：
[0190]
细胞活力(％)＝(加药od-空白od)/(对照od-空白od)
[0191]
加药od：含有细胞、cck-8和化合物18孔位的吸光度
[0192]
空白od：含有培养基、cck-8孔位的吸光度
[0193]
对照od：含有细胞、cck-8孔位的吸光度。
[0194]
表1-1试剂耗材及设备
[0195][0196]
实验结果如图1所示，化合物18对人肝癌细胞hepg2的活力有抑制作用，呈浓度和时间依赖性。我们观察到当给药浓度大于等于10μm时，化合物18对hepg2细胞在24h或48h的存活率都有明显的抑制作用。例如，10μm化合物18作用24h后，hepg2细胞活力仅为62.87％，而10μm化合物18作用48h后，hepg2细胞活力仅为27.31％，与阳性对照药物乐伐替尼相比均有显著性差异。这些结果表明化合物18抑制了人肝癌细胞hepg2细胞的生长。而当用相同浓度梯度的化合物18或乐伐替尼作用于人正常肝细胞lo2细胞48h后时可以看出在10-20μm浓度区间内化合物18对lo2细胞的毒性明显低于阳性对照药物乐伐替尼。
[0197]
实施例5 annexin v-fitc/pi荧光双染细胞凋亡检测
[0198]
为探讨化合物18对人肝癌细胞hepg2和正常肝细胞lo2的细胞凋亡的影响，用不同浓度的化合物18或乐伐替尼(阳)作用于hepg2和lo2细胞24h或48h，实验方法如下：
[0199]
1)复苏hepg2细胞并培养至三代以上，pbs冲洗细胞两次后，使用胰蛋白酶消化细胞并离心，随后进行细胞计数。
[0200]
2)将细胞以每孔约1x106个细胞的密度接种于12孔板上(2ml/孔)，并将其放入培养箱中培养过夜。
[0201]
3)预培养结束后，向12孔板中加入10/15μm的化合物18，孵育24h或48h。
[0202]
4)共孵育结束后，pbs冲洗细胞两次后，使用胰蛋白酶消化细胞并离心，弃上清，收集细胞，pbs洗涤一次，轻轻重悬细胞并计数。
[0203]
5)取1x105重悬的细胞，300g离心5min，弃上清。用pbs洗涤细胞一次，离心后弃上清，加入100μl稀释的1xannexin v binding buffer工作液重悬细胞。
[0204]
6)细胞悬液中加入2.5μl的annexin v-fitc和2.5μl的pi染液。
[0205]
7)轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育15-20min。
[0206]
8)加入400μl稀释的1xannexin v binding buffer，混匀样本。
[0207]
9)立即上机检测。
[0208]
表2-1试剂耗材及设备
[0209][0210]
实验结果分别如图2、图3、图4和图5所示，人肝癌细胞hepg2用10或15μm的乐伐替尼或化合物18处理24或48h，并以dmso处理的细胞作为对照。在经化合物18处理的人肝癌细胞hepg2中，晚期凋亡细胞的平均比例与乐伐替尼组之间有显著差异。而经化合物18处理的人正常肝细胞lo2中，早期和晚期凋亡细胞的平均比例与乐伐替尼组之间没有显著差异。
[0211]
实施例6细胞划痕实验
[0212]
实验方法：
[0213]
1)提前30min将实验器材灭菌，并用紫外照射直尺和marker笔30min。
[0214]
2)用marker笔在6孔板背面均匀地划横线，线与线间距离为0.5-1cm。
[0215]
3)将细胞以每孔约5x106个细胞的密度接种于6孔板上(2.5ml/孔)，并将其放入培养箱中培养过夜。
[0216]
4)第二天用无菌头垂直于6孔板背后的横线划痕，每孔划5条。
[0217]
5)用pbs洗细胞3次后加入含2％血清的dmem高糖培养基。
[0218]
6)实验孔加入10μm的化合物18，阳性对照孔加入10μm的乐伐替尼，溶剂孔加入同体积的dmso，空白对照孔加入同体积的pbs后将6孔板放入细胞培养箱培养，48h后取样拍
照。
[0219]
表3-1试剂及耗材
[0220][0221]
为了评估化合物18对hepg2细胞迁移能力的影响，我们进行了划痕实验。如图6所示，与空白对照组相比，化合物18在10μm浓度下，处理48h后可以有效延缓划痕处的闭合，且与阳性对照组的细胞迁移率无显著性差异。说明化合物18能够有效抑制hepg2细胞的迁移能力。
[0222]
实施例7小鼠器官毒性实验
[0223]
为探讨化合物18的安全性，选取balb/c小鼠连续给药14天，检测给药后小鼠各器官损伤情况和血清中的生化指标。
[0224]
1、小鼠各器官损伤情况检测
[0225]
实验方法如下：
[0226]
1)将18只六周龄雄性balb/c小鼠随机分为3组，每组6只，分别为对照组1和实验组1，2。随后按顺序在每只裸鼠耳叶上打好标记耳钉(1-18号)。(对照组：1-6号；实验组1：7-12号；实验组2：13-18号。)
[0227]
2)对各组裸鼠均采用灌胃给药，给药体积为100μl/只，连续给药14天：
[0228]
对照组：100μl溶剂/只/天(5％dmso+1％吐温80+无菌pbs)
[0229]
实验组1：20mg/kg/天18(化合物18+5％dmso+1％吐温80+无菌pbs)
[0230]
实验组2：50mg/kg/天18(化合物18+5％dmso+1％吐温80+无菌pbs)
[0231]
每日记录各组小鼠体重并绘制生长曲线。
[0232]
3)于末次灌胃后，禁食、不禁水24h，称取小鼠体质量，摘眼球取血法取小鼠全血，分离血清。采用颈椎脱臼法处死小鼠，摘取心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏及脑并放入多聚甲醛中固定24h。
[0233]
4)将固定后的上述器官分别放入包埋盒后，用自动脱水机脱水，脱水时按照70％乙醇、80％乙醇、85％乙醇、90％乙醇和95％乙醇顺次梯度进行，每个步骤1h。随后将器官浸泡于无水乙醇中三次，每次45min。
[0234]
5)脱水结束后，取出器官并依次放入乙醇/二甲苯(v/v＝1:1)混合液30min，100％二甲苯30min进行组织透化。
[0235]
6)将器官放入62℃的石蜡/二甲苯(v/v＝1:1)混合液中浸泡1h，石蜡ⅰ中浸泡
120min，石蜡ⅱ中浸泡120min。
[0236]
7)浸蜡结束后，使用包埋机对各器官进行石蜡包埋并放入4℃冰箱保存备用。
[0237]
8)将上述包埋器官的石蜡块用切片机切成厚度约为5μm的薄片，放入摊片机摊开后，置于载玻片上。
[0238]
9)将载玻片放入65℃烘箱中烘烤4h。
[0239]
10)将载玻片放入二甲苯ⅰ和二甲苯ⅱ中各15min以去除石蜡。
[0240]
11)随后将载玻片依次放入无水乙醇，95％乙醇，90％乙醇，80％乙醇及70％乙醇各5min，最后在蒸馏水中轻轻涮洗。
[0241]
12)将载玻片浸入苏木素染液6min后，用蒸馏水轻轻冲洗，并依次浸泡75％乙醇30s，95％乙醇3min。
[0242]
13)将载玻片进入伊红染液3min后，依次放入90％乙醇1min，95％乙醇1min，无水乙醇1min，二甲苯ⅰ和二甲苯ⅱ中各5min浸泡。
[0243]
14)滴加中性树胶并加盖玻片封片，于室温晾干后在正置显微镜下观察器官组织状态。
[0244]
表4-1试剂及耗材
[0245]
[0246][0247]
表4-2实验仪器及设备
[0248][0249]
实验结果如图7和图8所示，对照组、实验组1(20mg/kg/天18)及实验组2(50mg/kg/天18)的小鼠在连续给药14天后小鼠体重均没有减轻(图8)，表明小鼠对化合物18的耐受性良好。此外，通过组织切片并经he染后对三组小鼠体内心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏及脑六大器官进行了病理学评估。he染后的组织着情况与组织病理变化相关。如图7所示，三组小鼠的器官均呈现出正常的组织学外观，细胞结构完整，细胞间隙正常，未发现细胞凋亡、组织反应或炎症浸润等异常现象。结果表明，连续口服给药14天时，20mg/kg及50mg/kg的化合物18不会诱导小鼠组织病变，具有良好的安全性。
[0250]
2、血清中的生化指标检测
[0251]
实验方法如下：
[0252]
表5-1试剂耗材及设备
[0253][0254]
1)小鼠血清bun含量检测
[0255][0256]
按上表依次加入并混匀相应试剂后37℃恒温水浴10min，随后向每管中加入1ml酚显试剂和1ml碱性次氯酸钠，混匀后置于37℃恒温水浴10min，最后于640nm处检测各组吸光度，并代入以下公式计算小鼠血清中尿素氮浓度：尿素氮浓度(mm)＝[(a样品-a空白)/(a标准-a空白)]
ⅹ
标准品浓度
ⅹ
待测样本稀释倍数。
[0257]
2)小鼠血清cr含量检测
[0258][0259]
按上表依次加入并混匀相应试剂后于37℃静置5min，随后在546nm波长下测得吸光值a1。向每个孔中加入酶溶液b 60μl，37℃静置5min后于546nm处测得吸光值a2。代入以下公式计算小鼠血清中肌酐浓度：
[0260][0261][0262]
3)小鼠血清ast含量检测
[0263][0264]
轻轻震荡96孔板，室温静置15min后于510nm处测得各组吸光度并带入标准曲线得出各组小鼠血清中ast活力值。
[0265]
4)小鼠血清alt含量检测
[0266]
[0267][0268]
轻轻震荡96孔板，室温静置15min后于510nm处测得各组吸光度并带入标准曲线得出各组小鼠血清中alt活力值。
[0269]
实验结果如图9所示，由于小鼠的脏器功能可以通过血清中的部分生化指标反应出来，而肝、肾又是其主要的排毒器官，因此我们选择给药小鼠血清中的谷丙转氨酶(alt)和谷草转氨酶(ast)这两种指标作为小鼠肝脏功能的评判标准；选择给药小鼠血清中的肌酐(cr)和尿素氮(bun)这两种指标作为小鼠肾脏功能的评判标准。由图可知，给药组小鼠的四种生化指标的含量与对照组无显著性差异，且均在正常范围内，说明连续口服给药14天时，20mg/kg及50mg/kg的化合物18不会对小鼠的肝肾功能造成影响。
[0270]
实施例8化合物18对结直肠癌细胞的抑制作用
[0271]
按照实施例4所述cck-8细胞活力检测实验步骤，对结直肠癌细胞hct-8和hct116细胞给予化合物18后检测细胞活力。
[0272]
实验结果如图10所示，化合物18对结直肠癌细胞hct-8和hct116细胞的活力有抑制作用，呈浓度依赖性。我们观察到当给药浓度大于等于40μm时，给药24h后化合物18对hct-8和hct116细胞的存活率都有明显的抑制作用。例如，化合物18作用24h后，hct-8细胞活力仅为20.29％，hct116细胞活力仅为42.81％，与阳性对照药物5-氟尿嘧啶相比均有显著性差异。这些结果表明化合物18抑制了hct-8和hct116细胞的生长。
[0273]
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.具有式i结构的化合物，或者其立体异构体、药物可接受的盐或多晶型：其中：r1为苯环上的氢或取代基，r1为取代基时可相同或不同，独立的选自单取代或多取代；r1独立的选自氢、卤素、1-4个碳原子的烷基、1-4个碳原子的烷氧基、1-4个碳原子的卤代烷烃、1-4个碳原子的烷苯基、0-4个碳原子的烷氧苯基、未取代的包含氧氮硫的饱和或不饱和五元六元杂环化合物或被叔丁氧羰基等取代的包含氧氮硫的饱和或不饱和五元六元杂环化合物中的一个或更多个基团；r2和r3相同或不同，独立的选自氢、未取代或取代的苯基、萘基、蒽基、菲基，其中的取代基被独立地选自卤素、1-4个碳原子的烷基、1-4个碳原子的烷氧基、1-4个碳原子的卤代烷烃、1-4个碳原子的烷苯基、0-4个碳原子的烷氧苯基、未取代的包含氧氮硫的饱和或不饱和五元六元杂环化合物或被叔丁氧羰基等取代的包含氧氮硫的饱和或不饱和五元六元杂环化合物中的一个或更多个基团；r4独立的选自氢、甲基、二取代甲基、三取代甲基、未取代或取代的1-4个碳原子的烷苯基、萘基、蒽基、菲基，其中1-4个碳原子的烷苯基、萘基、蒽基、菲基的取代基被独立地选自卤素、1-4个碳原子的烷基、1-4个碳原子的烷氧基、1-4个碳原子的卤代烷烃、1-4个碳原子的烷苯基、0-4个碳原子的烷氧苯基或卤素等取代的0-4个碳原子的烷氧苯基、未取代的包含氧氮硫的饱和或不饱和五元六元杂环化合物或被叔丁氧羰基等取代的包含氧氮硫的饱和或不饱和五元六元杂环化合物中的一个或更多个基团；表示单键或双键；优选，r1为苯环上的氢或取代基，r1为取代基时选自间位单取代，r1选自氢、0-4个碳原子的烷氧苯基、未取代的包含氧氮硫的饱和或不饱和五元六元杂环化合物或被叔丁氧羰基等取代的包含氧氮硫的饱和或不饱和五元六元杂环化合物中的一个或更多个基团；优选，r2和r3相同，均选自氢；优选，选自双键；优选，r4选自未取代的1-4个碳原子的烷苯基或取代的1-4个碳原子的烷苯基，其中取代基被独立地选自异丙基、叔丁基、1-4个碳原子的烷氧基、0-4个碳原子的烷氧苯基或卤素等取代的1-4个碳原子的烷氧苯基、未取代的包含氧氮硫的饱和或不饱和五元六元杂环化合物或被叔丁氧羰基等取代的包含氧氮硫的饱和或不饱和五元六元杂环化合物中的一个或更多个基团。2.如权利要求1所述的化合物，其中r1为苯环上的氢或取代基，r1为取代基时选自间位单取代，r1选氢、苯氧基、基、叔丁氧羰基取代基或吡啶基中的一个或更多个基团，r2和r3均选自氢，选自双键，r4选自未取代的1-4个碳原子的烷苯基或被独立地选自1-4个碳原子的烷氧基、异丙基、叔丁基、苯氧基、或卤素中的一个或更多个基团取代的1-4个
碳原子的烷苯基，其具有式ii结构：3.如权利要求1和2所述的化合物，其中化合物选自：
或者其药物可接受的盐或其溶剂合物。4.如权利要求1-3所述的化合物的合成方法。5.一种药物组合物，其含有权利要求1-3所述的化合物、其药物可接受的盐或其溶剂合物；优选，所述药物组合物用于或预防癌症，抑制肿瘤生长、加速细胞凋亡和抑制细胞
活力；所述癌症包括实体瘤和非实体瘤以及原发性和继发性癌症，包括但不限于白血病、肝癌、肺癌、结肠癌、淋巴癌和甲状腺癌等，优选，所述癌症为原发性肝癌和结肠癌。6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，进一步包含其他的药物，所述其他药物选自癌症药物。7.权利要求1-3所述的化合物或其溶剂合物在制备药物中的应用；优选，所述药物用于或预防癌症，抑制肿瘤生长、加速细胞凋亡和抑制细胞活力；所述癌症包括实体瘤和非实体瘤以及原发性和继发性癌症，包括但不限于白血病、肝癌、肺癌、结肠癌、淋巴癌和甲状腺癌等，优选，所述癌症为原发性肝癌和结肠癌。

技术总结

本发明提供了一种肉桂酸酰胺衍生物，所述衍生物具备式I所述结构。本发明涉及式I所述结构化合物的制备与制药应用，如说明书中所定义。式I化合物以肉桂酸结构为母核进行结构修饰与优化，筛选的化合物具有明确且高效的癌症效果，能够抑制肿瘤生长、加速细胞凋亡和抑制细胞活力，且不具有细胞毒性，因此在用途的同时保证用药的安全性。本发明还涉及使用式I的化合物或者其药物可接受的盐或者与其他药物联合应用于多种非实体瘤与实体瘤的，包括但不限于原发性或继发性癌症例如肝癌、肺癌、结肠癌等的。式I：式I：式I：式I：