【基金项目】皖南医学院校级重点科研项目培育基金（ＷＫ２０１７Ｚ０４
）【收稿日期】２０１６ １２ ０９【修回日期】２０１７ ０７ ０３
△【通讯作者】Ｔｅｌ：１３９６５１８３５９５；Ｅ ｍａｉｌ：２５８１０４９７５＠ｑｑ．ｃｏｍ
鑫１，孙盼盼２，洪
云３，虞
乐４，李
曙４
△（１．皖南医学院药理学教研室，２．皖南医学院护理学教研室，３．
皖南医学院弋矶山医院超声医学科，４．皖南医学院病理生理学教研室，芜湖２４１０００
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）【摘要】目的：观察葛根素对人非小细胞肺癌Ａ５４９细胞生长的抑制作用及其机制。方法：体外培养人非小细胞肺癌细胞（Ａ５４９），不同浓度（６０μｇ／ｍｌ，１２０μｇ／ｍｌ，２４０μｇ／ｍｌ）葛根素处理２４ｈ后；采用ＣＣＫ ８法观察葛根素对细胞的增值抑制作用；吖啶橙（ＡＯ）／溴化乙锭（ＥＢ）双染法及ＡｎｎｅｘｉｎⅤ ＰＩ双染流式细胞术检测药物作用前后Ａ５４９细胞的形态学变化及凋亡状况；Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测Ａｐｅｌｉｎ／ＡＰＪ蛋白水平的变化。结果：ＣＣＫ ８法检测结果说明葛根素能抑制Ａ５４９细胞的增值，具有浓度和时间依赖关系；流式细胞术进一步证实葛根素具有诱导细胞凋亡的作用，与Ａ５４９细胞组比较，葛根素各处理组Ａｐｅｌｉｎ／ＡＰＪ蛋白水平均有不同程度下调。结论：葛根素可能通过调节Ａｐｅｌｉｎ／ＡＰＪ蛋白的表达诱导Ａ５４９细胞凋亡。【关键词】葛根素；Ａ５４９；Ａｐｅｌｉｎ／ＡＰＪ；凋亡【中图分类号】Ｒ７３ ３
【文献标识码】Ａ
【文章编号】１０００ ６８３４（２０１７）０５ ４６６ ０４
【ＤＯＩ】１０．１２０４７／ｊ．ｃｊａｐ．５５３５．２０１７．１１１
ＰｕｅｒａｒｉｎｉｎｄｕｃｅｓａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎＡ５４９ｃｅｌｌｓ
ＪＩＮＸｉｎ１，ＳＵＮＰａｎ ｐａｎ２，ＨＯＮＧＹｕｎ３，ＹＵＬｅ４，ＬＩＳｈｕ
４△（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＮｕｒｓｉｎｇ，３．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＵｌｔｒａｓｏｎｏｇｒａｐｈｙ，ＹｉｊｉｓｈａｎＨｏｓｐｉｔａｌ
，４．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ＷａｎｎａｎＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｗｕｈｕ２４１００２，Ｃｈｉｎａ
）【ＡＢＳＴＲＡＣＴ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｐｕｅｒａｒｉｎｉｎｄｕｃｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｈｕｍａｎｎｏｎ ｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｎｅｒＡ５４９ｃｅｌｌｓａｎｄｉｔｓｐｏｓｓｉｂｌｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ５４９ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｃｕｌｔｉｖａｔｅｄｉｎｖｉｔｒｏ．Ｗｈｅｎ８０％～９０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅｗａｓｒｅａｃｈｅｄ，ｔｈｅｙｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｐｕｅｒａｒｉｎｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（６０、１２０、２４０μｇ／ｍｌ）．ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｎｃｅｌｌａｐｏｐｔｐｓｉｓｗｅｒｅｅｘａｍｉｎｅｄｂｙＣＣＫ ８ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙ．ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｂｙＡＯ／ＥＢｓｔａｉｎｉｎｇ．ＴｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆＡ５４９ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙａｎａｌｙｓｉｓ．ＴｈｅｐｒｏｔｅｉｎｓｌｅｖｅｌｏｆＡｐｅｌｉｎａｎｄＡＰ
ＪｗｅｒｅｔｅｓｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＣＣＫ ８ｔｅｓｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｐｕｅｒａｒｉｎｃｏｕｌｄｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＡ５４９ｃｅｌｌｓｉｎａｔｉｍｅａｎｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍａｎｎｅｒ．ＦｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙａｎａｌｙｓｉｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｐｕｅｒａｒｉｎｃｏｕｌｄｍａｋｅＡ５４９ｃｅｌｌｓａｐｏｐｔｏｓｉｓ．ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅＡ５４９ｃｅｌｌｓｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡｐｅｌｉｎ／ＡＰＪｗａｓｄｅｃｒｅａｓｅｄｉｎｐｕｅｒａｒｉｎｇｒｏｕｐｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＰｕｅｒａｒｉｎｉｎｄｕｃｅｓａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎＡ５４９ｃｅｌｌｓ，ａｎｄｉｔｓｍｅｃｈａｎｉｓｍｍａｙｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＡｐｅｌｉｎ／ＡＰＪｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．【ＫＥＹＷＯＲＤＳ】ｐｕｅｒａｒｉｎ；Ａ ５４９；Ａｐｅｌｉｎ／ＡＰＪ；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ
目前，肺癌已经成为严重影响人类生命健康的疾病，我国肺癌死亡率３０年上升了４倍，预计２０２５
年，我国将有１００万人死于肺癌［１
］。葛根素是从豆科植物野葛的干燥根中提取的一种化学成分，目前主要制剂为葛根素注射液，临床
主要心血管疾病，不仅可以减慢心率、降低血压，还具有扩张冠状动脉、抗心肌缺血、抗心律失常等药理作用
［２ ４
］。有
关研究表明，葛根素也可诱导肿瘤细胞凋亡
［５，６
］。
但其作用机制尚不清楚。本实验以人非小细胞肺癌Ａ５４９
细胞为靶细胞，通过体外培养方式观察葛根素对Ａ５４９细胞生长影响，并探讨其作用机制，为葛根素的临床应用提供理论依据。
１材料与方法
１．１主要材料
葛根素（方明药业有限公司）；Ｈｙｃｌｏｎｅ胎牛血清、Ｈｙｃｌｏｎｅ１６４０培养基（赛默飞伊尔生物化学制品北京有限公司）；胰酶细胞消化液（碧云天生物技术研究所）；Ｔｒｉｏｚｏｌ细胞裂解液（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公司）；顺铂（美国，Ｓｉｇｍａ
）。人非小细胞肺癌Ａ５４９细胞（ｎｏｎ ｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ，ＮＳＣＬＣ）由上海栩冉生物科技有限公司提供，配置含１０％胎牛血清的１６４０培养液，将Ａ５４９细胞株用培养液培养于培养瓶中，培养条件是３７℃，５％ＣＯ２
。细胞贴壁生长，用胰酶消化传代。１．２方法
１．２．１细胞增殖抑制实验：取对数生长期的Ａ５４９
６６４ＣｈｉｎＪＡｐｐｌＰｈｙｓｉｏｌ，２０１７，３３（５
）
细胞以１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ的密度接种于９６孔细胞培养板，每孔２００μｌ，每组均设６个复孔，培养２４ｈ，弃去原培养液，分别加入含葛根素浓度为２０、４０、６０、１２０、２４０μｇ／ｍｌ的培养基，另设不加药物的对照组，继续培养８、１２、２４、３６、４８ｈ，培养板每孔加入ＣＣＫ ８溶液２０μｌ，培养箱放置２ｈ，取出培养板，显微镜下观察细胞状态，用酶标仪于波
长４９０ｎｍ处检测各孔的吸光值（ＯＤ值），计算细胞生长抑制率。实验重复３次，确定ＩＣ５０。
１．２．３吖啶橙（ＡＯ）／溴化乙锭（ＥＢ）染：取对数生长期的Ａ５４９细胞接种于２４孔板中，过夜培养后，弃上清，实验分组：Ａ５４９空白组、葛根素低剂量组（６０μｇ／ｍｌ）、中剂量组（１２０μｇ／ｍｌ）、高剂量组（２４０μｇ／ｍｌ）和顺铂对照组（５μｇ／ｍｌ）。培养２４ｈ后，吸弃培养液，加入ＡＯ／ＥＢ染液室温避光染３０ｍｉｎ，吸弃染液，ＰＢＳ洗涤，荧光显微镜下观察、拍照。１．２．４ＡｎｎｅｘｉｎⅤ ＰＩ双染流式细胞术：取对数生长期Ａ５４９细胞，以密度为１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ接种于６孔板内，每孔２ｍｌ。３７℃，５％ＣＯ２培养箱中培养２４ｈ。换成含１０％血清的ＤＭＥＭ，３７℃继续孵育１２ｈ，使细胞进入静止期。弃上清，实验分组，培养２４ｈ，收集培养的细胞。细胞染：加入５００μｌ的ＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ悬浮细胞，加入５μｌＡｎｎｅｘｉｎＶ／ＦＩＴＣ混匀后，在上机前５～１０ｍｉｎ加入５μｌＰｒｏｐｉｄｉｕｍＩｏｄｉｄｅ，混匀。室温避光反应５～１０ｍｉｎ，流式细胞仪上机分析细胞凋亡情况。
１．２．５Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测Ａｐｅｌｉｎ及ＡＰＪ蛋白表达
低温提取细胞蛋白，ＢＣＡ法测定蛋白浓度。每孔上样６０μｇ蛋白，１０％ＳＤＳ ＰＡＧＥ分离样
品，转膜、封闭，分别滴加β ａｃｔｉｎ（１∶２０００）、Ａｐｅｌｉｎ（１∶５００）及ＡＰＪ（１∶２００）一抗４℃过夜。洗膜，二抗（１∶２０００）室温孵育１ｈ。洗膜后将高灵敏的ＥＣＬ化学发光剂加到膜的正面，采用Ｂｉｏ ＲａｄＣｈｅｍｉＤｏｃＸＲＳ＋成像系统进行拍照用，ＩｍａｇｅＪ１．４３（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ）软件进行灰度值分析并比较各组蛋白表达差异。
１．３统计学分析
采用ＳＰＳＳ１７．０软件进行统计学分析，数据用均数±标准差（珋ｘ±ｓ）表示。两组间比较采用独立样本Ｔ检验，多个样本均数比较用单因素方差分析。
２结果
２．１葛根素对Ａ５４９细胞增值的抑制作用
通过计算分析各孔吸光度ＯＤ值，得出葛根素抑制Ａ５４９细胞生长具有浓度和时间依赖性。作用２４ｈ下，所测的ＩＣ５０为（１１８±４．４７）μｇ／ｍｌ，因此设置６０、１２０和２４０μｇ／ｍｌ为实验药物低、中、高浓度（图１）
。
Ｆｉｇ．１ＣｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｅｆｆｅｃｔｓａｎｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｐｕｅｒａｒｉｎｏｒｔｉｍｅｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｂｙｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｕｓｉｎｇＣＣＫ ８（珋ｘ±ｓ，ｎ＝６）
２．２葛根素作用Ａ５４９细胞后的形态学变化通过ＡＯ／ＥＢ荧光染，正常组细胞核呈绿，而葛根素组作用２４ｈ后细胞核呈绿、橙和红，说明细胞发生凋亡，并且随着葛根素浓度的增加，细胞凋亡的数量不断增加（图２，见彩图页Ⅱ）。２．３ＡｎｎｅｘｉｎⅤ ＰＩ双染流式细胞术
检测细胞凋亡葛根素作用２４ｈ后，Ａ５４９细胞都发生凋亡反应，但浓度不一样，细胞凋亡的比例也不一样，葛根素６０μｇ／ｍｌ、１２０μｇ／ｍｌ和２４０μｇ／ｍｌ作用下细胞凋亡比例分别为（１１．２４±０．９４）％、（３２．６±４．１８）％和（５０．９８±２．３８）％。进一步证明葛根素对Ａ５４９细胞生长具有抑制作用，且具有浓度依赖性。葛根素高剂量组与顺铂组比较细胞凋亡无显著性差异（图３，表１）
。
Ｆｉｇ．３ＦｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎＡ５４９ｆｏｌｌｏｗｉｎｇｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈｐｕｅｒａｒｉｎ
Ａ：Ａ５４９ｇｒｏｕｐ；Ｂ：Ｌｏｗ ｄｏｓｅｐｕｅｒａｒｉｎｇｒｏｕｐ；Ｃ：Ｍｉｄｄｌｅ ｄｏｓｅｐｕｅｒａｒｉｎｇｒｏｕｐ；Ｄ：Ｈｉｇｈ ｄｏｓｅｐｕｅｒａｒｉｎｇｒｏｕｐ；Ｅ：Ｃｉｓ ｐｌａｔｉｎｇｒｏｕｐ
Ｔａｂ．１ＡｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎＡ５４９ｆｏｌｌｏｗｉｎｇｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈｐｕｅｒａｒｉｎ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝６）
ＧｒｏｕｐＲａｔｅｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓ
Ａ５４９ｇｒｏｕｐ３．１４±０．５４
Ｌｏｗ ｄｏｓｅｐｕｅｒａｒｉｎｇｒｏｕｐｓ１１．２４±０．９４
Ｍｉｄｄｌｅ ｄｏｓｅｐｕｅｒａｒｉｎｇｒｏｕｐｓ３２．６０±４．１８
Ｈｉｇｈ ｄｏｓｅｐｕｅｒａｒｉｎｇｒｏｕｐｓ５０．９８±２．３８
Ｃｉｓｐｌａｔｉｎｇｒｏｕｐｓ４７．６７±１．６０ Ｐ＜０．０５， Ｐ＜０．０１ｖｓＡ５４９ｇｒｏｕｐ
７
６
４
中国应用生理学杂志，２０１７，３３（５）
２．４葛根素作用Ａ５４９细胞后Ａｐｅｌｉｎ与ＡＰＪ蛋白变化
通过Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法分析比较，在Ａ５４９细胞中Ａｐｅｌｉｎ与ＡＰＪ蛋白都具有较高的表达，葛根素处理２４ｈ后，Ａ５４９细胞中Ａｐｅｌｉｎ与ＡＰＪ蛋白表达水平均显著下降（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１），高剂量葛根素组与顺铂组比较，差异无显著性（图４，表２）
。
Ｆｉｇ．４ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡｐｅｌｉｎａｎｄＡＰＪＰｒｏｔｅｉｎｉｎＡ５４９ｉｎａｌｌｇｒｏｕｐｓ
Ａ：Ａ５４９ｇｒｏｕｐ；Ｂ：Ｌｏｗ ｄｏｓｅｐｕｅｒａｒｉｎｇｒｏｕｐｓ；Ｃ：Ｍｉｄｄｌｅ ｄｏｓｅｐｕｅｒａｒｉｎｇｒｏｕｐｓ；Ｄ：Ｈｉｇｈ ｄｏｓｅｐｕｅｒａｒｉｎｇｒｏｕｐｓ；Ｅ：Ｃｉｓ ｐｌａｔｉｎｇｒｏｕｐｓ
Ｔａｂ．２ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡｐｅｌｉｎａｎｄＡＰＪｐｒｏｔｅｉｎ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝６）Ｇｒｏｕｐ
Ａｐｅｌｉｎ
ＡＰＪ
Ａ５４９ｇｒｏｕｐ１．５２±０．１６
１．４１±０．０８６
Ｌｏｗ ｄｏｓｅｐｕｅｒａｒｉｎｇｒｏｕｐｓ０．９８±０．０９５ １．０５±０．０８７ Ｍｉｄｄｌｅ ｄｏｓｅｐｕｅｒａｒｉｎｇｒｏｕｐｓ０．５３±０．０８ ０．７９±０．０６１ Ｈｉｇｈ
ｄｏｓｅｐｕｅｒａｒｉｎｇｒｏｕｐｓ０．２８±０．０３５ ０．４２±０．０３６ Ｃｉｓｐｌａｔｉｎｇｒｏｕｐｓ集热罩
０．３７±０．０３５
０．４６±０．０４１
Ｐ＜０．０５， Ｐ＜０．０１ｖｓＡ５４９ｇｒｏｕｐ
３讨论
葛根素是从天然植物葛根中提取出来的有效成分，研究证明其具有扩张血管、降低血压、抗氧化等作用，在细胞方面具有修复内皮细胞损伤及抑制脑细胞凋亡等药理作用
［７，８
红薯清洗机］。但对于人非小细胞肺癌
Ａ５４９细胞的作用研究尚少。本实验以Ａ５４９
细胞为靶细胞，通过体外培养方式观察发现葛根素具有抑制Ａ５４９细胞生长的作用，为葛根素新的
临床用途提供理论依据。
１９９３年Ｏ’Ｄｏｗｎ等从人类基因组中分离出ＡＰＪ
受体，它是一种Ｇ蛋白偶联受体，１９９８年Ｔａｔｅｍｏｔｏ［９
］等从牛胃分泌物中发现ＡＰＪ受体的内源性配体命名为Ａｐｅｌｉｎ，后期研究证明Ａｐｅｌｉｎ广泛表达于胃肠道、脂肪组织、肾脏、骨等组织和心血管系统的多个部位 844vv［１０ １２
］，常见的有Ａｐｅｌｉｎ １２、Ａｐｅｌｉｎ １３、Ａｐｅｌｉｎ １９和
Ａｐｅｌｉｎ ３６等多种多肽片段。Ａｐｅｌｉｎ／ＡＰＪ
系统在各组织和部位中起着许多生物学功能。已有研究发现Ａｐｅｌｉｎ／ＡＰＪ在心血管疾病中起着重要的作用，Ａｐｅｌｉｎ作为一种血管生成因子，可以舒张血管降低血压，增强心肌收缩力，参与动脉粥样硬化、心梗、心衰改善，调节高血压的。Ａｐｅｌｉｎ／ＡＰＪ与各组织细胞也有着密切关系，多种组织细胞表达和分泌这种内源性
多肽，Ｓｏｒｌｉ
［１３
］等研究发现在恒河猴离体视网膜的脉络膜血管内皮细胞的增殖、迁移和毛细血管样管道的形成过程中，Ａｐｅｌｉｎ起着促进作用，ＢｅｒｔａＪ［１４］等发现Ａｐｅｌｉｎ作为血管生成因子在人非小细胞肺癌细胞中高度表达，参与肿瘤细胞的生长，Ｗａｎｇ
［１５］等发现人乳腺癌Ｈｓ５７８Ｔ细胞系中Ａｐｅｌｉｎ／ＡＰＪ大量表达。以上研究证明Ａｐｅｌｉｎ／ＡＰＪ在肿瘤细胞中表达增加，Ａｐｅｌｉｎ／ＡＰＪ与肿瘤的发生发展及肿瘤细胞的增殖密切相关，特别是在肺癌细胞中尤为突出。本研究表明在人非小细胞Ａ５４９细胞中Ａｐｅｌｉｎ／ＡＰＪ蛋白大量表达，葛根素处理后，可显著降低ａｐｅｌｉｎ／ＡＰＪ
蛋白表达水平，提示这可能是葛根素诱导Ａ５４９细胞凋亡的重要机制。
跳跳鞋总之，葛根素可以抑制人非小细胞肺癌Ａ５４９细胞的生长，并且可以诱导凋亡的发生，其作用机制是通过Ａｐｅｌｉｎ／ＡＰＪ通路调节产生的。【参考文献】
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ＨｕｍａｎＮｏｎ ｓｍａｌｌＣｅｌｌＬｕｎｇＣａｎｃｅｒ：ＲｏｌｅｉｎＡｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄＰｒｏｇｎｏｓｉｓ［Ｊ］．ＪＴｈｏｒａｃＯｎｃｏｌ，２０１０，５（８）：１１２０ １１２９．
［１５］ＷａｎｇＺ，ＧｒｅｅｌｅｙＧＨ，ＪｒＱｉｕＳ．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｏｃａｌ
ｉｚａｔｉｏｎｏｆａｐｅｌｉｎｉｎｈｕｍａｎｎｏｒｍａｌｂｒｅａｓｔａｎｄｂｒｅａｓｔｃ
ａｒｃｉｎｏｍａ［Ｊ］．ＪＭｏｌＨｉｓｔｏｌ，２００８，３９（１）：１２１ １２４．
【基金项目】国家自然科学基金项目（８１２７０１２６
）【收稿日期】２０１６ １０ １３【修回日期】２０１７ ０５ １９
△【通讯作者】Ｔｅｌ：０５１０ ８５９１７００７；Ｅ ｍａｉｌ：ｑｆｐａｎｇ＠ｊｉａｎｇｎａｎ．ｅｄｕ．ｃｎ
小剂量肝素对小鼠淹溺肺损伤ＳＯＤ、ＭＰＯ活性和ＭＤＡ水平的影响 杜
斌１，朱
丹１，温媛婷１，陈俊良１，唐筛娣１，孙洁芸１，陈
炜２，庞庆丰１
△（１．江南大学无锡医学院，江苏无锡２１４１２２；２．无锡市第三人民医学院急诊科，江苏无锡２１４０４１
）【摘要】目的：探讨小剂量肝素对淹溺诱导的小鼠急性肺损伤的保护作用。方法：６０只小鼠随机分为正常组、溺亡组和小剂量肝素组，每组各２０只。肝素组在游泳前３０ｍｉｎ腹腔注射肝素０．１Ｕ／ｇ。将小鼠放入内壁光滑的离心管内置入水中让其自由游泳建立小鼠淡水淹溺肺损伤模型。正常组小鼠采用脊椎脱臼法处死，溺亡组和小剂量肝素组溺亡小鼠溺亡９ｍｉｎ后，取肺组织。称重肺组织计算肺指数及肺湿／干重比；ＨＥ染观察小鼠肺组织的病理变化；取肺组织检测肺组织丙二醛（ＭＤＡ）、肺组织髓过氧化物酶（ＭＰＯ），超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活性。结果：与正常组相比，溺亡组小鼠肺指数增加，湿干重比（Ｗ／Ｄ）比值增高；肺组织病理形态学炎症明显加重；肺组织匀浆ＳＯＤ活性明显降低，ＭＤＡ含量、ＭＰＯ活性升高（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）。与溺亡组相比，肝素组小鼠肺指数降低，湿干重比（Ｗ／Ｄ）比值降低；肺组织病理形态学炎症明显减轻；肺组织匀浆ＳＯＤ活性明显升高，ＭＤＡ含量、ＭＰＯ活性降低（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）。结论：小剂量肝素可以发挥抗炎和抗氧化作用，减轻淹溺诱导的小鼠急性肺损伤。【关键词】肝素；淹溺；肺损伤；小鼠【ＫＥＹＷＯＲＤＳ
】ｈｅｐａｒｉｎ
；ｄｒｏｗｎｉｎｇ
；ｌｕｎｇｉｎｊｕｒｙ
；
ｍｉｃｅ
【中图分类号】Ｒ９６５．１
风筝绞盘【文献标识码】Ａ
【文章编号】１０００ ６８３４（２０１７）０５ ４６９ ０３
【ＤＯＩ】１０．１２０４７／ｊ．ｃｊａｐ．５５１０．２０１７．１１２
淹溺是意外死亡的重要原因之一，每年全球发生淹溺死
亡约４０
万人［１］。淡水淹溺对肺的损伤是多方面的。淡水进入肺部后，肺顺应性降低，肺泡表面活性物质被稀释，病理学上主要表现为明显的肺泡间质水肿、肺泡壁破裂，大量蛋白与红细胞渗出。研究发现，肝素具有抗炎和抗氧化、改善微
循环调节凝血功能紊乱等多种作用［２，３］，对多种原因引起的肺损伤均有较好的效果［４，５］，然而不同剂量肝素抗凝作
用是否伴有出血倾向，选用小剂量肝素０．１Ｕ／ｇ
能否淡水淹溺肺损伤炎症［６］尚不得知。故本实验通过建立淡水淹
溺肺损伤模型，观察肺组织形态学变化以及丙二醛（ｍａｌｏｎｄｉ ａｌｄｅｈｙｄｅ，ＭＤＡ）含量、超氧化物歧化酶（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ，ＳＯＤ）、髓过氧化物酶（ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＭＰＯ）活性，探讨小剂量肝素对淡水淹溺引起的急性肺损伤保护作用，为肝素临床溺水患者提供实验依据。
１材料与方法
１．１仪器与试剂
ＲＭ２１３５石蜡切片机（德国徕卡微系统有限公司）；８０ｉ正置荧光显微镜（日本尼康公司）；ＥＬＸ８００全自动酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）。ＭＤＡ试剂盒（批号：２０１４１２０２）、ＳＯＤ试剂盒（批号：２０１４１２０１），ＭＰＯ试剂盒（批号：２０１４１１２８）、考马斯亮兰（批号：２０１５０１０９
）试剂盒（南京建成生物工程研究所），９
６４中国应用生理学杂志，２０１７，３３（５）
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