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SDS-PAGE原理、试剂配制和注意事项

SDS是阴离子去污剂，能断裂分子内和分子间的氢键，破坏蛋白分子的二、三级结构。作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使绊胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。

SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。

当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此

在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。

过硫酸铵（AP）为催化剂，四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。

当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测，纯化的蛋白质通常在SDS电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况，这些信息对于了

解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。

Acr：丙烯酰胺

Bis：甲叉双丙烯酰胺

束身带

AP：过硫酸铵——化学催化剂

TEMED：四甲基乙二胺——加速剂

实验材料

1、30%丙烯酰胺混合液（Acr:Bis 为29:1）：将60ml水预热至37摄氏度，加入丙烯酰胺（Acr）29g及甲叉丙烯酰胺（Bis），溶解并补水至100ml。用0.45微米孔径滤纸过滤，查证溶液pH值不超过7.0。贮棕瓶中于4℃保存，可用一个月。（Acr）29.2g及（Bis）g

丙烯酰胺（Acr）及甲叉丙烯酰胺（Bis）有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤，其作用具有累积效应。称量时应戴手套和口罩。

2、1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液取1mol/L HCL溶液48ml、三羟甲基甲烷（Tris），加双蒸馏水至80ml使其溶解，调pH至8.8，然后用双蒸馏水稀释至100ml，置棕瓶中，4℃贮存。

3、1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液取1mol/L HCL溶液48ml，Tris，加双蒸馏水至80ml，调pH6.8，用双蒸馏水稀释至100ml，置棕瓶中，4℃贮存。

100ml分离胶1.5mol/LpH8.8Tris-HCl缓冲液：将Trisg完全溶于50ml去离子水中，加HCL调pH至8.8，加水定容至100ml。室温保存。

100ml积层胶：将Trisg完全溶于50ml去离子水中，加HCL调pH至6.8，加水定容至100ml。室温保存。

4、Tris-甘氨酸电泳缓冲液94g甘氨酸，加入50ml 10%（w/v）SDS（电泳级）存储液（），用去离子水补至1000ml。pH 8.3。

5、10% 过硫酸铵（AP）：过硫酸铵于1.5ml进口EP管中，用时加1ml去离子水溶解。2周内使用。

6、10%SDS（十二烷基磺酸钠）：在900ml水预热至68摄氏度，加入100g电泳级SDS溶解，补水至1000ml。SDS颗粒易扩散，称量时戴面罩。10%SDS无需灭菌。室温保存。

7、四甲基乙二胺（TEMED）：10% TEMED 0.1ml TEMED , 加0.9 ml蒸馏水。

8、上样缓冲液取1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液6.25ml，蔗糖10g，SDS ，1g/L溴酚蓝10ml，加蒸馏水溶解，混合至100ml。

样品缓冲液：5ml1mol/l的Tris-HCl（pH6.7），2.5gSDS,1ml巯基乙醇，溴酚兰，10g蔗糖，加水定容至100ml。

2×样品缓冲液（10ml）：甘油2ml，溴酚蓝，1MTris·Cl（）1ml巯基乙醇，10%SDS 4ml。

2×上样缓冲液（10ml）：0.6ml 1mol/L Tris-HCL (pH6.8)，4ml 50%的甘油，2ml 10% SDS， 2ml 1mol/L 二硫苏糖醇（DTT），1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水，可在4℃存放数周，或在-20℃保存数月。

2×上样缓冲液（10ml）：1ml 1mol/L Tris-HCL (pH6.8)，2ml 100%的甘油，4ml 10% SDS， 2ml 1mol/L 二硫苏糖醇（DTT），2g溴酚蓝，1ml去离子水，在-20℃保存数月。

9、考马斯亮蓝R250染液：45ml去离子水，45ml甲醇，10ml冰乙酸混合液，溶解考马斯亮蓝R-250，加入的先后顺序为：考马斯亮蓝R250，甲醇或者乙醇，蒸馏水，乙酸。用Whatman 1号滤纸过滤染液去除颗粒物质。不可隔夜以免影响染效果。

10、脱液：45ml去离子水，45ml甲醇，10ml冰乙酸混合液。

取冰醋酸7.5ml、甲醇5ml，加蒸馏水至100ml。

考马斯亮蓝脱液：10ml甲醇，10ml冰醋酸，80ml蒸馏水。

11、蛋白质分子量标志物：市售中分子量蛋白质分子量标志物。也可选择5种以上的已知分子量蛋白质自行配制，注意其分子量分布要能满足需要，各种蛋白质的浓度基本相等。

配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液

溶液成分	总体积 5ml	总体积 10ml	总体积 15ml	总体积 20ml	总体积 25ml	冷库蒸发器总体积 30ml
6%
水
30%丙烯酰胺
Tris(pH 8.8)
10% SDS
10%过硫酸胺
TEMED
8%
水
30%丙烯酰胺
Tris(pH 8.8)
10% SDS
10%过硫酸胺
TEMED
c4烯烃10%
水
30%丙烯酰胺
Tris(pH 8.8)
10% SDS

编织袋颗粒连供系统

10%过硫酸胺
TEMED
12%
水		37iii
30%丙烯酰胺
Tris(pH 8.8)
10% SDS
10%过硫酸胺
TEMED
15%
水
30%丙烯酰胺
Tris(pH 8.8)
10% SDS
10%过硫酸胺
TEMED

配制Tris-甘氨酸 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳5% 浓缩胶溶液

溶液成分	总体积 3ml	总体积 4ml	总体积 5ml	总体积 6ml	总体积 8ml
水
30%丙烯酰胺
1M Tris(pH 6.8)
10% SDS
10%过硫酸胺
TEMED

四、实验方法

1、用1％琼脂将长玻璃板下端封住，冷凝30分，灌12％分离胶（15ml），凝胶液加至约距前玻璃板顶端（距梳子齿约），接着在分离胶溶液上轻轻覆盖约1cm高的蒸馏水以封胶。

约30min后，若在分离胶与水层之间可见一个清晰的界面，表明凝胶已聚合。将水倒出，吸干，灌满5％浓缩胶（8ml，4ml用于Mini-Protein Ⅲ 型电泳槽）后立即插入梳子，冷凝30分后取出梳子。

2、预电泳：将1X电泳缓冲液加入内外电泳槽，使凝胶的上下端均能浸泡在电泳缓冲液内；接通电源，上槽为负极，下槽为正极，80V预电泳3～5min。

3、取20-30μl蛋白提取液与20-30μl样品缓冲液混合，于100℃水浴加热3-5min使蛋白变性（离心 5～10s），用微量进样器以50μl的量注入点样孔，不加样槽注入样品缓冲液。

取20ul收集液，加入5×样品缓冲液5ul，在80℃水浴锅中煮5min。

取血清0.1ml、上样缓冲液0.9ml，混匀，在沸水中煮沸5min。

4、打开电源将电压调到80v，待样品跑过压缩胶后将电压调到120－150v至电泳到胶底部为止。

5、将凝胶小心取下放入容器中，加入染液，用摇床摇2－3h（染时间需根据凝胶厚度

适当调整）；待条带清晰后倒出染液，凝胶脱至大致看清条带约需1h，完全脱则需更换脱液2～3次，震荡达24h以上。

将电泳后的凝胶取出，置于培养皿中，用蒸馏水冲去残留缓冲液，加入染液将凝胶完全浸泡其中，放入微波炉内，高火档照射20秒，停留1min，再照射10秒，反复几次至凝胶上后倒出染液，用蒸馏水冲去残留染液，加入脱液，高火档照射20秒，倒出脱液，再加入新鲜脱液照射20秒，重复5－6次，直至背景清晰透明，于凝胶分析仪上成像分析。

本文发布于:2024-09-22 11:28:29，感谢您对本站的认可！

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