Ellman's Reagent ,埃尔曼的试剂 ，5,5'二硫代双 - （二硝基苯甲酸），5钩子程序克
Molecular Weight: 396.35 分子量：396.35
CAS #: 69-78-3 CAS号：69-78-3
材料的制备
1 反应缓冲液：0.1M的磷酸钠，pH 8.0，含有1 mM的EDTA 2
半胱氨酸标准品，分子量136.2 ：配成一定浓度梯度
3 Ellman试剂溶液：1mL反应缓冲液4毫克溶解DTNB
程序
1用反应缓冲液1.11 配制一定浓度的半胱氨酸工作液
Standard | Volume of Reaction Buffer | Amount of Cysteine (M.W. = 136.2) | Final Concentration |
A | 100 ml | 烟囱脱硫20.43 mg | 1.5 mM |
B | 5 ml | 25 ml of Standard A | 1.25 mM |
C | 10 ml | 20 ml of Standard A | 1.0 mM |
D | 六氢吡啶15 ml | 15 ml of Standard A | 0.75 mM |
E | 20 ml | 10 ml of Standard A | 0.5 mM |
F | 25 ml | 5 ml of Standard A | 0.25 mM |
G | 30 ml | 0 ml | 0.0 mM (Blank) |
| | | |
2 取若干试管，每管含50μLEllman试剂和2.5mL的反应缓冲液。
3在各试管中加入250μL各浓度的标准工作液或待测物溶液
注：对于未知的样品需要稀释，以便使其浓度在标准曲线的工作范围之内（理想的浓度为0.1-1.0）。 4在室温混合和反应15分钟。
5 在412 nm处测量吸光度。
6.根据得到数值生成一个标准曲线，测定待测样品由标准曲线计算SH含量
摩尔吸光系数的程序精确量化的巯基的
材料的制备
1 反应缓冲液：0.1M的磷酸钠，pH 8.0，含有1 mM的EDTA
2 Ellman试剂溶液：1mL反应缓冲液4毫克溶解DTNB
B.测量吸光度
1.去若干试管，每管加入50μL的Ellman试剂溶液和2.5mL反应缓冲液。
2.加入250μL待测样品,，空白添加无级变速轮250μL反应缓冲液
Note : 尽量使待测样品的浓度小于1.0mM，浓度太高将会导致误差变大
3.在室温混合和反应15分钟。
4.分光光度计412nm测定吸光度。
5.根据TNB的摩尔消光系数(14,150)计算巯基含量
The TNB dianion has a relatively intense absorbance at 412nm compared to该国能在412nm的合成，有一个相对比较激烈的吸光度
both disulfides.同时二硫化物。 Because the stoichiometry of protein thiol to TNB formed由于蛋白质的巯基，以国能形成化学计量
is 1:1, TNB formation can be used to assess the number of thiols present.为1:1，国能形成可以用来评估硫醇数目。
In the absence of denaturants, only accessible thiols will react, whereas在变性剂的情况下，唯一能够到的硫醇的反应，而
in the presence of chaotropic agents the total number of reduced Cys residues
残留的chaotropic代理人在场的总数减少胱氨酸
present can be measured.目前可以衡量的。 Reduction of the protein followed by treatment经处理后减少的蛋白质
with chaotropes and DTNB can yield the total number of cysteines (Cys-SH与chaotropes及DTNB能够产生的半胱氨酸总数（半胱氨酸巯基
plus Cys-SS-Cys).加半胱氨酸-β-半胱氨酸）。
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The reaction is sensitive to alkaline pH ( OH) competes with RS ),反应是敏感的碱性pH值（俄亥俄州）与RS竞争），
acidic pH (disulfides can be broken), oxygen (reoxidation of R-SH), and酸性pH值（二硫化物可以打破），氧（R的巯基再氧化），以及
temperature (thermochromism).温度（热致变）。 Consequently, the reaction is usually因此，通常的反应是
carried out with an excess of DTNB to protein, at neutral pH, fixed temp-进行了过多的DTNB的蛋白质，在中性pH值固定的温度，
erature, and sometimes under anaerobic conditions. erature，有时在厌氧条件。 Furthermore, TNB is此外，国能是
sensitive to various buffer ions, so the extinction coefficient used to敏感的各种离子的缓冲，所以采用消光系数
calculate number of thiols must be properly matched to the reaction硫醇数量计算必须正确匹配的反应
conditions.条件。 This is also true of reactions carried out in the presence of这也是进行了存在的真实反应
the denaturants urea or guanidine (GuHCl).尿素或盐酸胍的变性剂（盐酸胍）。 The following table summarizes下表概述
some useful data on DTNB and TNB under various conditions:在DTNB的和国能在各种条件下的一些有用的数据：
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Compound lambda max (pH~7) Extinction: (in PO4) (in Tris) (in GuHCl)复方最大的lambda（pH值〜7）灭绝：（以磷酸盐）（以磷酸三）（以盐酸胍）
编织袋颗粒--------- ----------------- -------------------- ---------- ---------- --------- ----------------- -------------------- ---- ------ ----------
DTNB 324 nm 17,780 16,600 ---- DTNB的324纳米17780 16600 ----
TNB 412 nm 14,150 ---- 13,700国能---- 412纳米14,150 13,700
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Extinction coefficients are in units of per Molar per cm path length, 30degC消光系数以每摩尔每厘米长度的路径，30degC单位
Decreased TNB extinction in the presence of GuHCl is due to a shift in the国能在降低盐酸胍存在的灭绝是由于在移位
lambda max from 412 to 422 nm.拉姆达从412到422最大纳米。 The extinction of DTNB at 412 nm is 212/M/cm,在DTNB的灭绝是在412纳米212/M/cm，
small but measurable.规模虽小但可衡量的。
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= Protocol = =协议=
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Stock Solutions:联合解决方案：
Protein solution (native or previously reduced and desalted)蛋白质溶液（本地或以前减少，脱盐）
(~5-40uM in 0.1M potassium phosphate buffer, pH 7.4) （〜5 - 0.1M的磷酸钾缓冲液，pH值7.4 40uM）
男性自卫慰器自己制作 DTNB stock (20 mM in 0.1M KPO4, pH 7.4; MW 396.35; 7.93 mg/ml) DTNB的股票（20毫米0.1M的KPO4，pH值7.4，分子量396.35; 7.93毫克/mL）
(DTNB is very slow to go into solutions; vortex periodically （DTNB的很慢进入的解决办法;涡定期
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