摘要：植物培养技术以植物细胞全能性为基础，在无菌条件下，利用离体组织器官，如植物根、茎、花、叶和果实等，培育出一系列的可育后代。利用此技术，可以生产出大量的优良品种来提高原品种的质量。鉴于此，本文将针对植物干细胞培养技术展开更为深入的探讨，仅供相关人士参考。
关键词：防辐射屏植物干细胞培养；技术；应用
前言：随着我国制药工业及功能性食品行业的迅速发展，对植物中活性成分的需求日益增长。植物中的活性成分具有抗衰老、提高免疫力及保护心脑血管等的作用，但其质量受环境因素和收获条件的影响，活性物质产量低，有些植物的活性成分仅限于特定的组织部位或生长阶段合成。对于结构复杂、人工合成困难的活性成分，传统的愈伤组织培养方式虽然可以在短时间内生产有价值的产品，节约了资源，但是经历脱分化的愈伤组织液泡化程度高，常常增加了细胞的异质性，对振荡培养的剪切力敏感，经多次有丝分裂后，容易产生DNA甲基化以及转座子被激活等变异现象，导致培养过程不稳定，天然产物的产量、性质不稳定等缺点，难以适应现代工业生产需求。
1植物干细胞的概念和特征
干细胞的概念起源于20世纪60年代的动物胚胎学研究，其含义“具有自我更新复制能力和分化潜能的细胞”。与此相对应，植物干细胞实为传统植物解剖学范畴中的分生组织，包括茎尖分生组织、根尖分生组织、侧生分生组织以及部分髓射线细胞，其具有产生所有分化细胞类型的能力以及旺盛的分裂能力和较高的遗传稳定性。植物干细胞具有多个小液泡、线粒体活性高、聚集度低、细胞壁无木质素沉积等特点，低温保藏后仍维持较高的细胞活性，在悬浮培养过程中大部分以单细胞形式存在，对剪切力不敏感，能维持稳定的增殖速度，可以长期稳定培养。2010年，Lee等在NatureBiotechnology上成功报道了红豆杉形成层干细胞的分离及3t生物反应器培养研究，随后越来越多种植物的干细胞研究被报道，本研究在总结上述研究结果的基础上，对当前植物干细胞的分离、培养、鉴别及应用情况进行综述，并对植物干细胞培养的前景进行了展望，为该领域的深入研究提供参考。
2植物干细胞培养
植物干细胞处于未分化状态，其分离方法是建立在传统的组织培养基础上，具体步骤包括：1)含分生组织的外植体消毒处理；2)干细胞的诱导；3)分离并收集干细胞；4)干细胞的
鉴定。目前关于植物干细胞的诱导和大规模培养等研究报道较少，植物干细胞培养仅见于形成层干细胞、茎尖干细胞及根尖干细胞培养。
2.1植物贮藏根形成层干细胞的分离及培养
目前关于贮藏根形成层的培养，仅见于胡萝卜、人参及当归。具体包括：外植体的消毒、抗褐化培养、渗透处理以及诱导培养获得形成层干细胞系。在实际培养过程中渗透处理对形成层干细胞系的获得尤为重要，所选用的渗透剂以及渗透剂的浓度至关重要，实际操作过程中0.6mol/L蔗糖效果最佳，使对渗透压敏感的非形成层组织坏死，而对渗透压不敏感的干细胞保持活性。处理后的外植体置于诱导培养基上，一段时间后，所得细胞系即为干细胞系。渗透剂一般为蔗糖溶液，也有用KCl、甘露醇等作为渗透剂的报道。干细胞诱导之初对植物激素的要求相对严格，有报道表明诱导初期用IBA或IAA，而其他激素无效果，继代培养基中一般添加2,4-D即可。基于上述方法，人参、胡萝卜以及当归细胞系均已成功培养，并且建立了当归和人参细胞的气升式反应器，人参形成层细胞与愈伤组织相比，倍增时间为3−6d，而愈伤组织的倍增时间为28d，生长速度提高了5−9倍，人参皂苷的含量尤其是在野山参中达到了3%。该细胞系提取物可以抗肿瘤、提高免疫力，并且还具有抗氧
化、抑制皱纹产生的效果。当归干细胞悬浮培养21d后，鲜重增长为2.83倍，愈伤组织为1.67倍，同时当归干细胞合成次级代谢产物活性较强，干细胞阿魏酸含量为9.118mg/kg，而在愈伤组织中未检测到阿魏酸。笔者在实验过程中发现进行人参形成层干细胞的分离时有的材料自带内生菌，会对实验过程造成干扰，需要在实际的分离过程中选择合适的消毒方法以及培养条件，一般选择在干细胞诱导培养基中加入抗生素处理；另外，可能由于品种不同，形成层干细胞诱导的条件不同，实验过程中需要针对特定的品种摸索具体的实验条件，才能保证成功获得干细胞系。
2.2木本及草本植物形成层干细胞的培养
骨灰盒寄存架采集的枝条置于抗坏血酸溶液中防止氧化，外植体常规消毒后，尽量去除韧皮部等非形成层组织，将含有形成层的组织切分后置于含有IAA或NAA的诱导培养基上，一段时间后形成层细胞自然分层，收集细胞继代培养。研究者们利用上述方法成功获得了银杏及红豆杉干细胞系，所获得的干细胞系建立了大规模的悬浮培养体系，银杏干细胞最终建立了250L的气升式反应器，且干细胞干重达到了11.7g/L，其提取物可以清除自由基，具有强烈的抗氧化作用，在制药、功能性食品领域具有较强的工业实用性。在红豆杉干细胞悬浮培养方
面，气升式反应器中干细胞增长明显优于愈伤组织，3L生物反应器中培养4个月后，来自针叶和胚胎的愈伤组织干重分别为3.33g和5.08g，而干细胞干重为3819.44g。并且3L反应器中，加入诱导子50mg/L壳聚糖和100μmol/L茉莉酮酸甲酯，以及0.1mmol/L的前体苯丙氨酸处理后的愈伤组织紫杉醇含量分别达到了11mg/kg和13mg/kg，而干细胞中紫杉醇含量达到了98mg/kg，明显高于愈伤组织中紫杉醇含量，经过研究人员对培养参数的筛选和优化，建立了3t红豆杉干细胞生物反应器，实现了大规模工业生产。除此之外草本植物干细胞也有相关报道，韩国建国大学Moon等基于上述方法建立了长春花干细胞系，结果表明，含有1.5mg/LNAA和0.5mg/LKT的B5培养基中长春碱含量达到最大值，含有1.5mg/LNAA和1.5mg/LKT的B5培养基中长春新碱的含量达到最大值。不仅如此，我国厦门鹭港兆康公司的人参干细胞固体培养成功获得人参皂苷6％以上，韩国云火公司的Lee和Jin等已经成功获得了番茄和菊花以及艾蒿干细胞，并建立了气升式生物反应器，3L反应器中，番茄干细胞的生长速率达到了6.3倍，而愈伤组织的生长速率只有1.9倍，在250L的气升式反应器中干细胞的干重达到了12.6g/L，番茄干细胞的提取物可以促进原胶原的形成，抑制胶原分解酶的形成，起到了抑制皱纹的作用。菊花干细胞在3L反应器中培养14d后，细胞由最初的4.1g/L增长到了11.8g/L，干细胞系提取物不仅具有抑制由脂多糖处理引起的NO产生的效果，
溜逸>一次性台布
而且还具有抑制环氧化酶-2表达的效果，因此该细胞系可用于生产消炎药及功能性饮料。
2.3茎尖干细胞培养
关于茎尖干细胞的分离培养仅见于拟南芥茎尖干细胞和芦荟茎尖干细胞。不同于其他草本植物，芦荟干细胞挑选幼嫩的茎尖作为外植体。常规消毒后，切取茎尖，置于含有NAA和6-BA的诱导培养基中培养。获得的细胞团用0.25%的纤维素酶和0.25%的果胶酶进行酶解，所得到的细胞即为干细胞，该细胞系冻干粉中芦荟苷含量达到了150.80mg/g，显著增加了芦荟苷的含量。干细胞系的获得，除了常规诱导方面，也有通过转入抗性筛选基因进行干细胞系建立的报道。
2.4根尖干细胞培养
去毛刺工具根尖干细胞的诱导：首先将去除根冠的根组织切分成1mm大小，置于含有2,4-D的诱导培养基上，暗培养一段时间后，静止中心细胞继代于含有2,4-D的培养基上扩增，利用该方法获得了水稻干细胞。在此基础上暨南大学的王一飞等建立了铁皮石斛的干细胞系，并建立了10L的悬浮培养体系，利用超低温冷冻、超声波破碎以及真空干燥等方法制备了铁皮石
斛干细胞冻干粉，铁皮石斛干细胞提取物具有较高的POD、SOD以及CAT酶活性，具有较强的抗氧化作用，干细胞冻干粉对成纤维细胞的光老化具有抑制作用，提高了其SOD酶活性，其制备的眼霜还具去除眼袋和淡化黑眼圈的效果。
3植物干细胞的鉴别
植物干细胞具有多个小液泡、线粒体活性高以及细胞壁不含木质素等特点，在干细胞鉴别方面，主要依据其自身特点对一些特定的细胞器进行染观察，以此区别于愈伤组织等非干细胞系。目前常用的染方法有如下几种：1)中性红液泡系染；2)间苯三酚木质素染；3)JanusgreenB线粒体染。除此之外，与愈伤组织相比，在干细胞中存在特异表达或高表达的基因。
3.1中性红染
电动橡皮中性红是液泡特殊的活体染剂，由于液泡呈酸性，进入液泡的中性红解离出大量阳离子而呈现樱桃红，所以通过液泡染可以区别干细胞系。韩国云火公司Lee等诱导培养红豆杉形成层细胞后，对干细胞进行了中性红染，结果表明，形成层细胞内具有多个被染
的红小液泡，而愈伤组织细胞内呈现出一个中央大液泡，在人参以及菊花干细胞中也观察到具有多个小液泡的现象。实际操作中发现在干细胞组织学染过程中，中性红染使用PBS比Ringer溶液染效果好。
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