Treg细胞对帕金森病模型小鼠的抗炎症及神经保护研究 目的调节性T(regulatory T,Treg)细胞是一类能调控体内自身免疫反应的辅助性T(helper T,Th)淋巴细胞亚。已有报道说明,Treg细胞对自身抗原有很高的亲和力,通过直接接触或分泌抗炎细胞因子白介素(interleukin,IL)-10和转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β等抑制效应性T细胞的增殖和活化,具有明显的免疫调节和免疫抑制作用,在免疫耐受和免疫稳态中起重要作用。
近年来的研究表明,神经退行性疾病--帕金森病(Parkinson’s disease,PD)的发病机制中也涉及了神经炎症反应和外周免疫功能紊乱,主要表现为脑内小胶质细胞过度激活、外周效应性T细胞透过血脑屏障(Blood Brain Barrier,BBB)进入中枢,进一步加重PD的病理过程。然而,关于Treg细胞在PD中的作用及其机制仍不十分明确。数字调制器
为此,本研究采用Treg细胞过继转移的方式,探讨Treg细胞对PD的神经炎症和多巴胺(dopamine,DA)神经元损伤的作用,分析Treg细胞进入脑内的机制,并利用PD细胞模型探讨Treg细胞对DA神经元发生作用的机制。从而为研究PD的发病机制和寻求新的免疫抑制方法开辟思路。
方法1.PD小鼠模型的制备:8周龄的C57BL/6小鼠腹腔注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methy-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP),20 mg/kg/次,共注射4次,每次间隔2 h,制备PD小鼠模型。未作任何处理的小鼠和腹腔注射等量生理盐水的小鼠作为对照。
2.Treg细胞的过继转移对PD小鼠神经炎症的作用:体外分选活化的Treg细胞,在MPTP注射12 h后经尾静脉注射给PD小鼠,24 h后,即MPTP注射第3天用转棒和旷场实验观察动物行为学变化;用免疫荧光组织化学染法观察小鼠中脑黑质致密部(substantia nigra pars compacta,SNpc)酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)的免疫反应阳性神经元的数量;用高效液相谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)检测纹状体内多巴胺DA的含量;应用real-time PCR和Western blot方法检测中脑黑质中,炎性介质——肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、IL-1β、IFN-γ、IL-17、IL-22的表达,抗炎介质——IL-10和TGF-β、神经营养因子胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,IGF)-1的表达;ELISA法检测黑质组织匀浆液中上述相关因子的分泌;同时应用免疫荧光组织化学染法观察SNpc区小胶质细胞(CD11b~+)和星形胶质细胞(GFAP~+)的激活。3.Treg细胞的过继转移对PD小鼠外周免疫炎症的作用:在MPTP注射后的第7天,取小鼠脾脏或淋巴结提取单个核细胞,用real-time PCR和Western blot法检测Th1细胞来源的致炎细胞因子干扰素(interferon,IFN)-γ 山药种植开沟机和IL-2、Th17细胞来源的致炎细胞因IL-17和IL-22,Th2细胞来源的抗炎细胞因子IL-4、Treg细胞来源的抗炎细胞因子IL-10和TGF-β的表达;Th1细胞的核转录因子T-bet(T-box expressed in T cells)、Th2细胞的核转录因子GATA3(GATA binding protein 3)、Th17细胞的核转录因子RORγt(retinoid-related orphan nuclear receptorγt)和Treg细胞的核转录因子Foxp3(forkhead box p3)的表达。
流式细胞术检测脾脏和淋巴结组织提取的单个核细胞中CD3~+CD4~+的总CD4~+T淋巴细胞、CD4~+IFN-γ~+的Th1细胞、CD4~+IL-4~+的Th2细胞、CD4~+CD25~+的Treg细胞以及CD4~+IL-17~+的Th17细胞数目的变化。眼内眦静脉取血获得血清,ELISA法检测血清中IFN-γ、IL-17和TGF-β1的分泌。
此外,将体外分选活化的Treg细胞经尾静脉注射给PD小鼠后,用real-time PCR和Western blot法检测致炎细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-17和IL-22的mRNA和蛋白表达。4.过继转移的Treg细胞透过BBB进入脑内的机制检测:在Treg细胞过继转移24 h后,即MPTP注射第3天,应用免疫荧光双染法观察CD4~+Foxp3~+Treg细胞在中脑SNpc内的分布情况,同时用密度梯度离心法分离中脑黑质的胶质细胞和白细胞,然后用流式细胞术检测中脑黑质内CD4~+CD2
盲区监测5~+Foxp3~+Treg细胞占所分离出的细胞的百分比,以此判断Treg细胞是否进入脑内;同时,将FITC标记的右旋糖酐经心脏注入血液循环,观察小鼠SNpc中FITC标记的右旋糖酐的渗漏,Western blot法检测中脑黑质组织中两种紧密连接蛋白——ZO-1和occludin的表达情况,以此判断BBB的完整性;此外,应用抗淋巴细胞功能相关抗原1(lymphocyte functionassociated antigen-1,LFA-1)的中和抗体(5μl/ml)预处理Treg细胞30 min以中和Treg细胞上LFA-1分子,再将Treg细胞过继转移给PD小鼠,或者在MPTP注射当天经PD小鼠尾静脉注射抗细胞间粘附分子1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)的中和抗体(1mg/kg)以中和血管内皮细胞上的ICAM-1分子,再进行Treg细胞的过继转移,然后用流式细胞术检测中脑内CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg细胞占所分离出的细胞的百分比,观察Treg细胞上LFA-1分子和血管内皮细胞上的ICAM-1分子在介导Treg细胞透过BBB进入中脑黑质中的作用。
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超微电极5.检测Treg细胞是否通过分泌细胞因子减轻MPP~+的神经毒性:取小鼠脾脏,经体外分选获得Treg细胞,并用抗CD3/CD28刺激活化;取小鼠胚胎13天的中脑腹侧组织进行原代细胞培养(用阿糖胞苷抑制胶质细胞生长)获得神经元。然后将刺激活化的Treg细胞种入transwell小室,再放入神经元培养体系中与之共培养(两种细胞接种比例为1:1),使得两种培养介质可通
大功率led电源过transwell小室底部的小孔相通,而两种细胞却不直接接触,共培养1 h后,加入MPP~+(5μM)作用24 h。
然后用免疫荧光细胞化学法标记TH和NeuN阳性细胞,分别计算DA和非DA神经元的数目;并且用ELISA法检测神经元培养介质中IL-10和TGF-β1的分泌。6.检测Treg细胞通过与MN9D细胞(具有DA神经元特性)直接接触的机制减轻MPP~+的神经毒性:我们设想Treg细胞通过跨膜分子CD45与MN9D细胞上的半乳糖凝集素1(galectin1)的相互作用减轻MPP~+的神经毒性。
取小鼠脾脏经体外分选获得Treg细胞,并用抗体刺激活化;MN9D细胞进行传代培养,接种于培养板,待细胞生长状态良好时用于实验。首先,应用免疫荧光细胞化学法确定Foxp3与CD45及TH与galectin1在Treg细胞或MN9D细胞上的的共表达。
进一步在活细胞工作站上观察标记CD45的Treg细胞与标记galectin1的MN9D细胞之间相互作用的动态图像。其次,利用CD45抑制剂抑制Treg细胞内的CD45,再将抑制了CD45分子的Treg细胞与MN9D细胞共培养1 h;或利用基因干扰技术沉默MN9D细胞内的galectin1,再将正常Treg细胞与沉默了galectin1基因的MN9D细胞共培养1 h,加入MPP~+(50μM)作用48 h,
然后去除Treg细胞。
应用免疫荧光细胞化学法检测MN9D细胞的数目;用TUNEL染法直接观察细胞的凋亡;用Annexin V/PI染法检测细胞的凋亡与坏死;用LDH释放实验检测细胞的死亡;并且用Western blot法检测凋亡蛋白caspase-3和caspase-9的活化情况。结果1.Treg细胞过继转移阻止了PD模型小鼠中脑SNpc内TH阳性神经元(即DA神经元)数目下降、纹状体内DA含量降低以及行为学改变:PD模型小鼠中脑SNpc区DA神经元数明显减少,Treg细胞过继转移后,DA神经数目恢复至对照水平;同样的,PD模型小鼠纹状体内DA含量明显下降,而Treg细胞过继转移后PD小鼠DA含量显著升高到对照水平。
旷场实验中,MPTP注射的PD模型小鼠与对照组相比,小鼠跨格数明显减少,平均速度明显减慢,Treg细胞过继转移后,小鼠跨格数和平均速度均明显增高至对照水平;转棒实验中,PD模型小鼠在转棒上保持平衡的潜伏时间明显缩短,而Treg细胞过继转移后,潜伏时间升高至对照水平。2.Treg细胞过继转移抑制了PD小鼠中脑SNPc小胶质细胞和星形胶质细胞的激活、抑制了中脑黑质致炎因子的上调以及抗炎因子和神经营养因子的下调:PD模型小鼠的SNpc部位CD11b免疫反应阳性小胶质细胞和GFAP免疫反应阳性的星形胶质细胞均呈现激活状态,T
reg细胞过继转移后,小胶质细胞和星形胶质细胞的激活明显受到抑制;基因、蛋白的表达以及黑质组织匀浆液的ELISA测定均显示,PD模型小鼠中脑黑质组织中Th17细胞因子IL-17、IL-22显著升高,Treg细胞过继转移后这些因子降低至对照水平;而PD模型小鼠Treg细胞的细胞因子TGF-β、IL-10均降低,Treg细胞过继转移后升高至对照水平;此外,PD模型小鼠脑内致炎因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β明显升高,神经营养因子IGF-1显著下降,而Treg细胞过继转移后,这些因子的表达及分泌均恢复至对照水平。
3.PD模型小鼠的SNpc中BBB破坏及过继转移的Treg细胞进入中枢的途径和机制测定:在PD模型小鼠的SNpc中,可见到FITC-右旋糖酐渗出到血管周围,其中脑黑质紧密连接蛋白ZO-1和occludin的表达均降低,且CD4和Foxp3免疫荧光双染和流式细胞术检测中脑黑质CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg细胞百分比均提示,PD模型小鼠中脑黑质内Treg细胞数没有变化,而Treg过继转移后,其中脑黑质部位Treg细胞百分比显著增高,但是将Treg细胞过继转移给正常未注射MPTP的小鼠,其中脑黑质部位Treg细胞百分比并无明显变化。此外,如果抑制Treg细胞上的LFA-1或者抑制血管内皮细胞上的ICAM-1,PD小鼠中脑黑质内Treg细胞百分比又下降至对照水平。
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